바이오인

핵심내용

-세포 손상을 최소화하고 시간, 위치, 주입량을 선택적으로 제어 가능-

□ 국내 연구진이 레이저로 세포에 구멍을 뚫고 원하는 유전자를 세포 안으로 전달하는 광집게* 장치를 개발했다. 세포손상을 최소화할 수 있어 유전자 치료 등 생명공학 연구에 활용될 것으로 기대된다. 

   * 광집게(optical tweezers) : 레이저의 전자기장을 이용하여 비접촉식으로 마이크로 크기의 입자를 포획하고 이동시킬 수 있는 장치

<그림> 입자에 도포한 유전물질을 광집게로 집어 세포로 침투시키는 모식도

 o 광주과학기술원 기전공학부 이용구 교수와 왈리드 무하마드 박사과정(제1저자) 연구원 등이 수행한 이번 연구는 미래창조과학부(장관 최문기)와 한국연구재단(이사장 이승종)이 추진하는 중견연구자지원사업(핵심연구)의 지원으로 수행되었고, 연구결과는 미국광학회가 발간하는 바이오메디컬 옵틱스 익스프레스(Biomedical Optics Express)지 8월 7일자 온라인판에 게재되었다. (논문명: Single-cell optoporation and transfection using femtosecond laser and optical tweezers)

□ 기존방식은 임의의 세포에 총을 쏘듯이 원하는 유전자로 코팅된 나노입자를 고속으로 충돌시키거나(gene gun) 전기쇼크를 주는 방식이어서 유전자 전달의 성공여부가 일정하지 않고 세포손상의 우려가 있었다.

  o 이는 대량의 세포를 대상으로 확산원리에 기대는 만큼 원하는 때 원하는 부위로 원하는 양만큼의 유전자를 전달할 수 없다는 것이 한계가 있었다. 

□ 연구팀은 펨토초 레이저*로 세포벽에 순간적인 구멍을 내고 원하는유전자가 도포된 입자를 광집게로 포획하여 세포내로 전달하는 방법을 시연하는 데 성공했다. 

    * 펨토초 레이저 : 10-15초 켜졌다 꺼지기를 반복하는 아주 짧은 펄스의 레이저로 짧은 시간 동안 세포에 에너지를 전달해 열 손상 없이 작은 구멍을 만들 수 있다.

  o 광집게를 이용하면 단일세포의 유전자조작이 가능하고, 전달할 유전물질의 양과 전달시간 및 주입위치를 정교히 조절할 수 있다. 

  o 또한 펨토초 레이저가 뚫은 구멍은 순간적인 것이어서 세포표면에 열에 의한 손상이나 기포발생 등의 부작용을 일으키지 않는 것도 장점이다. 

□ 이는 펨토초 레이저가 유전자 전달입자가 통과할 수 있는 터널을 만든 데 따른 것이다. 이 터널로 유전자 전달입자를 주입하고 나면  터널은 자체 치유에 의해 닫힌다는 설명이다. 

  o 나아가 연구팀은 실제 유전자가 전달되고 48시간 후 유전자가 발현되어 단백질이 생성되고 세포가 생존함을 확인하였다.

□ 한편 해당 연구결과는 미국광학회의 보도자료*로도 소개되었다. 

    * 보도자료 제목 : New High-Tech Method Allows DNA to be Inserted "Gently" into Living Cells (http://www.osa.org/en-us/about_osa/newsroom/newsreleases/)

상세내용

연 구 결 과  개 요

1. 연구배경

   기존의 유전자 전달 기술은 대량의 세포에 전기/물리/화학적인 충격을 동시다발적으로 가하여 일시적으로 세포 표면이 외부 물질을 받아들일 수 있게 한 후 다량의 유전자가 흘러들어가도록 하는 과정을 거친다. 이러한 방법은 정확히 얼마만큼의 유전 물질이 어느 경로로 언제 주입하는지에 대한 제어가 불가능하기 때문에 통계적이고 거시적인 발현결과만을 관찰할 수 있다. 본 연구에서는 단일 세포에 최소한의 손상을 입힌 후 정확한 양의 유전물질을 전달할 수 있는 방법을 세계 최초로 제시하였다.

2. 연구내용

   현재까지의 유전자 조작 방법은 다량의 세포에 대해서만 이루어져서 집단적 평균 결과만 보고되었고 개개 세포의 미세한 분포에 대한 관찰이 이루어지지 않았다. 따라서 특이한 개별적인 변화에 대한 분석은 간과되었다. 거대한 집단을 이루는 세포의 전체적인 통계치는 중요한 점을 놓칠 수 있다. 세포들은 매우 다양해 세포간의 복잡한 네트워크와 신호전달 체계를 무시하고 전체적으로 바라보면 중요한 현상이 평균치에 가려서 보이지 않기 때문이다. 또한 세포는 매우 역동적이어서 형태가 변하고 분열하고 사멸(apoptosis)하기 때문에 이러한 세부적인 관찰 없이는 유전자의 발현에 대한 이해가 더딜 수 밖에 없었다. 유전자가 단일 세포의 내부에서 여러 소기관들을 거쳐 어떻게 시공간적으로 전개하고 발현되고 나아가 생명현상에 참여하는 유기분자들을 생성하는지에 대한 연구가 이루어져야만 유전자 치료의 많은 문제점들을 해결할 수 있다.

   이러한 이유로 단일 세포로의 유전자 전달 방법은 필수적으로 필요하다. 본 연구는 선택한 단일 포유류 세포에 유전 물질을 주입하고 발현한 후 세포가 계속적으로 생존해서 유전자 발현 과정을 미시적으로 관찰할 수 있는 기술을 제시하였다.

   포유류 세포 플라즈마 멤브레인에 펨토초 레이저를 이용하여 열응력, 기포발생 등의 부작용이 없이 유전자 매개 입자가 통과할 수 있는 터널을 만들 수 있는 기술로 요약할 수 있다.

일반적으로 현미경 영상으로 세포를 보면 호떡같이 넓게 퍼져서 슬라이드에 붙어 있다. 세포 표면이 슬라이드에 동일한 높이에 있다고 생각하기 쉬우나 그 높이 차이는 실험에서 사용한 암세포의 경우 수십 마이크로미터에 이른다. 이에 반해 구멍을 내려는 레이저의 초점은 수 마이크로미터에 불과하므로 레이저 초점의 높이를 세포 표면에 정확히 조준하는 것은 어렵다.

   본 연구에서는 이 문제를 광집게로 포획한 마이크로 입자를 프로브 매개체로 사용해 해결했다. 광집게로 포획한 입자에 외부 힘을 가해 초점에서 비드가 이탈하면 산란되는 빛의 세기가 더 커지게 된다. 따라서 입자를 포획하여 이동하다 세포 표면에 닿으면 빛 신호가 커지게 되는 것을 이용해 세포 표면의 높이를 정확하게 감지할 수 있었다. 정확히 파악한 높이로 펨토초 레이저를 순간적으로 발사하여 터널을 만들었다.

   터널을 통해 광집게로 포획한 유전자 매개 입자를 주입할 수 있으며 터널은 유전 물질의 주입 후 자체 치유에 의해 닫힌다. 본 연구에서 사용한 암세포에 다양한 노출 시간과 레이저 출력을 조절해 보고 조사한 구멍이 쉽게 다시 닫히는지를 관찰하여 최적화한 레이저 조사 조건을 찾았다. 나아가 48시간의 인큐베이팅을 통해 유전자가 발현되고 세포가 생존함을 확인하였다.

3. 기대효과

   단일세포 DNA 전달 시스템은 순수 생명 과학연구, 농산물의 품종개량, 유전자 조작 세포를 이용한 인슐린 등의 유용 단백질 생산 등에 이용할 수 있을 것으로 기대된다. 제안하는 기술이 사용될 경우 관련 기술의 산업화를 앞당길 것으로 기대된다.

용  어  설  명

1. 바이오메디컬 옵틱스 익스프레스(Biomedical Optics Express)
 ○ 미국 광학회에서 발간하는 오픈엑세스 출간물로 생명과학과 광학의 융합을 다루는 대표적인 저널
 ○ 2012년도 IF는 3.176이며 광학분야 저널(67개)중 순위는 6위임
 
2. 미국 광학회 (Optical Society of America, www.osa.org)
 ○ 175개의 국가를 대표하는 18만 전문가를 회원으로 하는 국제학술단체. 1916년부터 광학관련 학술활동을 해왔다. 다양한 출판물, 학술대회, 그리고 교육을 통해 광학과 포토닉스의 저변 확대를 위해 힘쓰고 있다.
 
3. 광집게(optical tweezers)
 ○ 전자기장을 이용하여 비접촉식으로 마이크로 크기의 입자를 포획할 수 있는 장치로 인간이 측정할 수 있는 가장 작은 단위의 힘인 picoNewton급의 아주 작은 힘을 측정하는 센서로 활용할 수 있다.
 ○ 개구수가 매우 높은 렌즈로 레이저를 강하게 집속할 때 주변 매질보다 굴절률이 큰 물체가 초점으로 잡아당겨지는 원리를 이용한다. 입자이송을 위해서는 레이저의 입사각을 변조하는 장치가 필요하다.

4. 펨토초 레이저(femtosecond laser)
 ○ 10-15초 켜졌다 꺼지기를 반복하는 아주 짧은 펄스의 레이저로 짧은 시간 동안 세포에 에너지를 전달해 열 손상 없이 작은 구멍을 만들 수 있다.

그  림  설  명

<그림 1> 입자에 도포한 유전물질을 광집게를 이용하여 세포내부로 침투시키는 도식도. 입자가 세포벽을 통과할 때 극초단파 레이저를 이용하여 수 마이크로미터의 구멍을 순간적으로 만든다.

<그림 2> a) 실험에서 사용한 암세포의 레이저 스캐닝 현미경 이미지. 초록색 원이 유전물질로 도포한 입자이며 광집게로 세포내부에 침투한 결과임. b) 같은 영상을 형광으로 관찰. 초록색 형광은 주입한 유전 물질이 초록 형광 단백질을 생성하는 것을 나타내고 이는 유전자 발현이 성공하였음을 의미한다.

 c) 이미지 b)를 c)위에 겹친 사진.

<그림 3> 연구원이 유전자 조작할 세포가 위치한 배양접시를 자체제작한 광집게 시스템(Lamda-ST)에 탑재하는 모습

<그림 4> TDFPI라고 명명한 광집게를 이용한 유전자전달 프로세스
세포 표면의 정확한 높이 감지와 터널의 생성 그리고 마지막으로 유전자 입자의 삽입으로 구성되어 있다. a) Inverted 현미경상에서 암세포 주위에 유전물질이 코팅된 입자들이 놓여 있다. b) 광집게로 유전자가 코팅한 마이크로 입자를 포획 (1. Trapping); c) 포획한 입자를 프로브로 사용하여 세포표면의 정확한 높이를 탐지 (2. Detection); d) 정확한 세포 표면에 펨토초 레이저를 조준 (3. Focusing); e) 세포 표면의 터널 생성 (4. Puncturing); f) 세포 내부로 마이크로 입자를 주입 (5 Insertion).