바이오인

  

□ 국내 연구진이 혈관성 치매*를 일으키는 또다른 원인 단백질을 찾아냈다. 이 단백질이 뇌에서 인지기능을 담당하는 해마**에 존재하는 신경세포의 사멸을 유도함으로써 혈관성 치매를 유도하는 기전이 밝혀짐에 따라 향후 이 단백질의 활성을 억제하는 방식의 혈관성 치매 예방 및 치료제 개발을 위한 실마리가 될 것으로 기대된다.

 

* 혈관성 치매 : 기억력 등의 인지기능과 행동조절에 관여하는 대뇌 주요부분에 뇌혈관질환으로 인한 병변이 발생하여 초래된 치매

** 해마(Hippocampus) : 대뇌의 양쪽 측두엽에 존재하는 부위로 일화, 의미 기억 등 인지기능을 담당하는 부위

 

o 건국대학교 의학전문대학원 이종민, 최동희 교수 연구팀이 공동으로 수행한 이번 연구는 미래창조과학부와 한국연구재단이 추진하는 중견연구자지원사업(핵심)의 지원으로 수행되었고, 연구결과는 내분비 및 대사 분야 국제학술지 항산화산화환원신호지(Antioxidants and Redox Signaling, ARS) 온라인판 2월 6일에 게재되었다.

 

(논문명 : NADPH Oxidase 1, a Novel Molecular Source of ROS in Hippocampal Neuronal Death of Vascular Dementia)

 

□ 활성산소*와 치매 같은 퇴행성 신경질환을 유발할 수 있는 만성대뇌허혈과의 연관성은 알려져 있었지만

o 해마의 신경세포가 활성산소에 특별히 취약한 이유에 대한 연구는 미약한 상태였다.

* 활성산소(ROS) : 지방, 단백질, DNA, 및 탄수화물과 반응하여 세포에 산화성 손상을 일으키는 것으로 알려져 있다.

 

□ 연구팀은 NADPH산화효소1*이 만들어내는 활성산소가 지방 및 DNA의 산화를 통해 해마의 신경세포사멸을 유도함을 밝혀냈다.

* NADPH산화효소1(NOX1) : 활성산소를 만드는 세포막에 존재하는 효소 가운데 하나

 

o 향후 Nox1의 활성을 억제하는 방식의 혈관성 치매의 예방과 치료연구로 이어질 것으로 기대된다.

 

□ 실제 혈류가 통하지 않는 양측 경동맥 폐색* 유발 랫트 모델에서 NOX1 발현량과 활성이 높아졌고 NOX1이 활성화된 경우 수중 미로에서 도피대를 찾는데 20초가 더 오래 걸렸다.

 

* 경동맥 폐색 : 허혈을 위해 양쪽 경동맥을 실로 묶어 혈류가 통하지 않도록 하는 처리

 

o 과산화물을 만드는 NOX1이 해마의 신경세포 사멸을 유도해 학습과 기억에 나쁜 영향을 미친다는 설명이다.

 

□ 반면 혈관성 치매 동물에 NOX 억제제 처리시 이러한 해마 신경세포 사멸이나 인지기능 손상이 완화되는 것으로 나타났다.

 

o 또 해마 신경세포에서 리보핵산 간섭*을 통해 NOX1 발현을 억제한 경우 DNA 산화, 신경세포 사멸 및 인지기능의 손상이 완화되었다는 설명이다.

* 리보핵산 간섭(RNAi) : 20개 내외의 뉴클레오타이드로 된 리보핵산이 상보적인 염기서열의 리보핵산을 만나 분해하거나(siRNA), 발현을 억제(miRNA)하는 현상

 

□ 최 교수는 “혈관성 치매에서 해마 신경세포 사멸에 관여하는 NOX1에 의한 발병기전을 규명했으므로 이를 토대로 NOX 1 억제제 개발 및 유전자 치료에의 응용 가능성이 있다”라고 밝혔다.

 

 

혈관성 치매는 고연령층 환자에서 알츠하이머 병 다음으로 흔히 발병하는 가장 흔한 인지 장애 중 하나이다. 혈관성 치매는 인지 기능의 손상과 관계된 허혈성, 출혈성 뇌병변 장애에 이르는 심혈관 또는 뇌혈관 상태에 따라 발병한다. 이중에서도 만성 대뇌 저관류(Chronic cerebral hypoperfusion)는 급진적인 인지 능력감소와 밀접하게 연관되어 있는데, 만성 대뇌 저관류는 혈관성 치매에 국한되지 않고, 알츠하이머병의 발명의 초기 요소 중 하나에 불과하며, 만성 대뇌 저관류가 어떠한 기전에 의해 혈관성 치매의 인식 기능 저하에 관여하는지는 아직도 명확히 밝혀지지 않은 상태이다.

 

 

만성 대뇌 저관류를 재현하기 위한 동물모델로, 랫트에서 총경동맥의 양측을 영구적으로 폐색하는 혈관 폐색 모델이 구축되었고, 이러한 동물 모델은 만성 대뇌 저관류에서 관찰되는 인지 기능 손상, 백질 병변, 신경 손상의 분자적 기전과 치료법을 연구하기 위한 도구로 폭넓게 사용되어 오고 있다.

 

한편, 산화적 스트레스는 혈관성 치매와 알츠하이머의 병인에 관여하는 주요 요소 중 하나로, 단백질 산화, 지질 과산화 및 산화적 DNA 손상으로 나타나는 뇌 실질 조직에서의 증가된 산화적 스트레스는 혈관성 뇌질환 및 알츠하이머의 주요 특징이다. 산화적 스트레스는 혈관 저관류에 의해 유도되는 병리에 의한 인지 장애의 발달에 매우 중요한데, 수퍼옥사이드 이스뮤타아제, 카탈라아제, 글루타치온 퍼옥시다아제, 글루타치온 리덕타아제, 헴 옥시제나아제/빌리베르딘 리덕타아제와 같은 항산화 효소의 활성은 알츠하이머 병과 혈관성 치매 환자에서 감소된다.

 

한편, NADPH 산화효소군은 활성산소 생성에 중요한 역할을 하는데, NADPH 산화효소 2 (Nox2)는 식세포에서 처음 동정되었고, 상당한 양의 초과산화물을 식포로 방출하여 박테리아를 멸균하는 것으로 알려져 있다. 현재, NADPH 산화효소 군은 중추신경계를 포함하는 다양한 조직에서 Nox1, Nox2, Nox3, Nox4, Nox5, Duox1, Duox2의 7개의 동족체를 가지고 있는 것으로 알려져 있다.

 

Nox는 알츠하이머의 발달에 있어서 염증성 신경세포 손상에 관여하며, 아연에 노출되거나 성장인자의 결손, 저혈당증 및 메틸 아스파 테이트 수용체 활성화와 같은 조건에서 신경세포 사멸에 관여하는 것으로 알려져 있다. 또한, Nox4는 뇌졸중에 의한 산화적 스트레스와 신경퇴행과 관계되어 있음이 알려져 있다. 또한, Nox2도 중추신경계 질환과 밀접한 관련이 있다는 보고가 있으나, 아직까지 Nox1이 이러한 질병과 관련이 있다는 특별한 연구 결과가 활발히 발표되고 있지는 않은 실정이다. 다만, 본 연구실에서 Nox1 입자가 도파민 신경 세포에서 활성산소에 의존적인 세포사멸과 관련이 있다는 연구 결과를 보고한바 있다. 그러므로 본 연구에서는 혈관성 치매 환자의 혈액 샘플에서 항산화 효소의 수치가 감소되는 현상에 NADPH 산화효소가 깊이 관여할 것으로 예측하고 그 분자 기전을 조사하여, NADPH 산화효소 군의 하나인 Nox1의 발현을 억제함으로써 혈관성 치매의 치료 효과가 있음을 최초로 규명하였다.

 

 

만성 대뇌 저관류 동물모델에서 해마의 신경세포 사멸과 인지기능 저하가 NADPH 산화 효소 1 (Nox1)에서 생산된 활성산소에 의한 것임을 밝혔으므로 혈관성 치매의 치료법 개발을 위한 새로운 분자 표적으로써의 응용 가능성이 높다.

 

 

이번 성과 뭐가 다른가		Nox1이 혈관성 치매에서 해마 내의 신경세포 손상과 인지기능 손상에 미치는 역할을 처음으로 규명한 것이다.
어디에 쓸 수 있나		새로운 혈관성 치매의 원인 기전 규명으로 이어질 경우 치료제 개발을 위한 기초자료로 활용될 수 있다.
실용화까지 필요한 시간은		치료제 발굴 후 전임상 및 임상연구 등 다소 장기간이 소요될 수 있다.
실용화를 위한 과제는		Nox1 억제제 후보물질을 발굴하고 합성한 후 중개연구를 통한 표적치료제 개발이 선행되어야 한다.
연구를 시작한 계기는		퇴행성 뇌질환의 주요 발병원인으로 알려져 있는 활성산소가 생성된 후 항산화제 처리를 통한 손상된 신경세포에 대한  치료효과가 임상적으로 한계를 보이므로 직접적인 활성산소 생성을 조절하는 분자를 찾고자 하는 의도에서 시작되었다.
꼭 이루고 싶은 목표는		퇴행성 뇌질환과 혈관성 뇌질환의 원인규명을 위한 기초연구를 통해 임상에 적용할 수 있는 새로운 치료법을 개발하는 것이 목표이다.
신진연구자를 위한 한마디		의약학 분야에서 창조적인 기초연구의 활성화가 난치성 및 노인성 질환의 새로운 치료법 개발의 근간이 될 것이므로 이를 위해 도약하길 바랍니다.

 

○ 세포내에서 활성산소를 만드는 효소, 세포의 산화적 손상과 관련된 것으로 알려져 있다.

○ 활성산소를 측정하기 위한 염색법, 디하이드로에티디움을 동물에 복강주사 한 후 조직 절편을 만들어 형광현미경으로 관찰하면 활성산소가 증가된 경우 붉은 형광이 세포핵에서 관찰된다.

 

○ 데옥시리보핵산(DNA) 손상을 측정하는 표식인자인 8-Hydroxy -2-deoxyguanosine (8-oxo-dG)를 염색하는 면역화학염색법

 

○ NeuN 단백질에 결합하는 항체를 이용해 신경세포의 핵을 염색하는 방법

* NeuN 단백질 : 신경세포의 핵에 존재하는 단백질

 

○ 염기성 아닐린 염료로 신경조직을 염색하는 방법으로 신경세포체의 니슬소체가 뚜렷하게 관찰된다.

○ 수중 미로에 도피대를 설치하고 수조 주위 벽면에 걸려있는 각종 도형 모양의 공간단서(cue)들을 일정하게 유지시킨 후 동물이 도피대에 도달하는 시간이나 도달하는 양상을 확인하여 공간기억력을 평가하는 동물행동검사

 

 

(A) 랫트의 양측 경동맥을 폐색한 후 뇌의 기억을 담당하는 해마에서 NADPH 산화효소1 (NOX1)의 발현을 빨강형광 꼬리표가 달린 산화효소 특이적인 항체(맨 위의 행)와 신경세포 핵단백질의 발현을 녹색형광꼬리표가 달린 NeuN에 특이적인 항체를 이용하여 확인(가운데행)한 결과 NOX1의 발현이 대조군(SC)에 비해 증가됨을 확인하였으며 이 둘을 합성한 이미지에서 보듯 이러한 NOX1 발현이 NeuN과 같은 위치의 세포에서 나타나 신경세포에서 NOX1이 증가(맨 아래행)되는 것으로 나타났다.

 

(B) NOX1과 NeuN 항체로 신경세포를 염색한 결과 양측 경동맥 폐색 후 1주(1W)부터 10주(10W)때 까지 해마의 신경세포에서 NOX1의 발현(붉은색 형광)이 증가되는 것으로 나나났다.

 

(C) NOX1의 발현을 정량화하기 위하여 녹색형광꼬리표가 달린 NeuN 세포 수에 대한 NOX1 발현 세포수를 세어 백분율과 세포수로 분석한 결과 랫트에 양측 경동맥을 폐색하고 1주일 후부터 8주까지 통계적으로 유의하게 증가되는 것으로 나타났다.

   

 

(A) 녹색형광 꼬리표가 달린 Nox1 리보핵산 간섭을 유발하여 NOX1의 발현을 억제시키는 상보적 염기서열(Nox1shRNA)을 가진 분자 또는 어떤 유전자와도 상보적인 서열을 같지 않는 무작위적인 서열을 갖는 리보핵산(ScbRNA) 분자를 대조군과 양측 경동맥을 폐색한 동물의 해마에 투여하였을 때 녹색형광 꼬리표가 비슷한 수준으로 발현되었다 (첫번째 행).

 

DHE를 이용하여 빨강 형광을 띄는 세포수를 확인하여 활성산소의 양을 측정한 결과 무작위서열 분자가 존재하는 양측 경동맥 폐색 동물군에서 해마 부위에 활성산소가 증가되었으며 NOX1의 발현을 억제시키는 상보적 염기서열 (Nox1shRNA)을 가진 양측 경동맥 폐색 동물의 해마에서 빨강색 형광을 나타내는 세포가 감소되었다 (두번째 행).

 

둘을 합성한 이미지에서 보듯 활성산소의 생성이 Nox1shRNA가 투여된 양측 경동맥 폐색 동물에서 감소되는 것이 나타났다. (세번째 행)

 

(B) 활성산소의 변화를 정량화하기 위하여 녹색형광꼬리표가 달린 리보핵산 발현 세포수에 대한 빨강 형광을 띄는 DHE 염색 세포수를 세어 백분율과 세포수로 분석한 결과 NOX1의 발현을 억제시키는 상보적 염기서열 (Nox1shRNA) 처리 랫트에 양측 경동맥 결찰을 한 경우 무작위적인 서열을 갖는 리보핵산 (ScbRNA) 분자를 처리하고 양측 경동맥 결활을 한 경우보다 통계적으로 유의하게 감소되는 것으로 나타났다.

 

 

(A) Nox1 리보핵산 간섭을 유발하여 NOX1의 발현을 억제시키는 상보적 염기서열 (Nox1shRNA)을 가진 분자 또는 어떤 유전자와도 상보적인 서열을 같지 않는 무작위적인 서열을 갖는 리보핵산 (ScbRNA) 분자를 대조군과 양측 경동맥을 폐색한 동물의 해마에 투여한 후 DAN 산화를 파랑 형광 꼬리가 붙은 8-oxo-dG에 특이적인 항체로 면역염색하였을 때 무작위서열 분자가 존재하는 양측 경동맥 폐색 동물군에서 해마 부위에 DAN 산화된 세포가 증가되었으며 이러한 증가가 NOX1의 발현을 억제시키는 상보적 염기서열 (Nox1shRNA)을 가진 양측 경동맥 폐색 동물의 해마에서 감소되었다.

 

(B) 빨강 형광 꼬리가 붙은 NeuN 신경핵 단백질에 특이적인 항체로 면역염색하여 세포사멸 정도를 측정하였을 때 무작위서열 분자가 존재하는 양측 경동맥 폐색 동물군에서 해마 부위에 신경핵 단백질이 감소되었으며 이러한 감소는 NOX1의 발현을 억제시키는 상보적 염기서열 (Nox1shRNA)을 가진 양측 경동맥 폐색 동물의 해마에서 억제되었다.

 

(C) 신경세포 손상을 확인하기 위하여 닛슬염색 하였을 때 무작위서열 분자가 존재하는 양측 경동맥 폐색 동물군의 해마 부위에 신경세포가 감소되었으며 이러한 감소는 NOX1의 발현을 억제시키는 상보적 염기서열 (Nox1shRNA)을 가진 양측 경동맥 폐색 동물의 해마에서 억제되었다 (맨아래행).

 

(D) A에서 확인한 DAN 산화 변화를 정량화하기 위하여 파랑 형광 꼬리가 붙은 8-oxo-dG 항체에 염색된 세포수를 세어 대조군 대비 백분율과 세포수로 분석한 결과 NOX1의 발현을 억제시키는 상보적 염기서열 (Nox1shRNA) 처리 랫트에 양측 경동맥 결찰을 한 경우 무작위적인 서열을 갖는 리보핵산 (ScbRNA) 분자를 처리하고 양측 경동맥 결활을 한 경우보다 통계적으로 유의하게 감소되는 것으로 나타났다.

 

(E) B에서 확인한 신경세포 사멸 변화를 정량화하기 위하여 빨강형광꼬리표가 달린 NeuN 항체에 염색된 세포수를 세어 백분율과 세포수로 분석한 결과 NOX1의 발현을 억제시키는 상보적 염기서열 (Nox1shRNA) 처리 랫트에 양측 경동맥 결찰을 한 경우 무작위적인 서열을 갖는 리보핵산 (ScbRNA) 분자를 처리하고 양측 경동맥 결활을 한 경우 보다 통계적으로 유의하게 증가되는 것으로 나타났다.

 

(F) C에서 확인한 신경세포 사멸 변화를 정량화하기 위하여 니슬 염색된 세포수를 세어 대조군 대비 백분율과 세포수로 분석한 결과 NOX1의 발현을 억제시키는 상보적 염기서열 (Nox1shRNA) 처리 랫트에 양측 경동맥 결찰을 한 경우 무작위적인 서열을 갖는 리보핵산 (ScbRNA) 분자를 처리하고 양측 경동맥 결활을 한 경우보다 통계적으로 유의하게 증가되는 것으로 나타났다.

 

 

A. 기억능력 검사를 위해 도피대가 있는 원형수조에서 하루 90초간 2회 또는 3회씩 10일 간 훈련을 받으며 도피대에 이르는 평균시간을 측정하였을 때 무작위적인 서열을 갖는 리보핵산(ScbRNA) 분자를 갖는 대조군에 비해 양측 경동맥을 폐색한 동물의 경우 도피대에 이르는 시간이 약 3배 더 오래 걸렸으며 이러한 증가는 해마에 NOX1의 발현을 억제시키는 상보적 염기서열(Nox1shRNA)을 가진 경동맥 폐색 동물에서 약 20초의 시간이 감소되었다.

 

B. 수중미로 검사에서 각 그룹별 동물의 수영속도의 차이를 확인하였을 때 비슷한 속도를 나타냈다.

 

C. 기억능력 검사 훈련 5일, 10일째에 마지막 3번째 훈련 시행시 도피대가 제거된 채로 30초간 수영을 하게 하여 도피대가 있는 사사분면에 동물이 머무는 시간을 전체시간에 대비한 결과 10일째 검사에서 대조군에 비해 양측 경동맥을 폐색한 동물의 도피대가 있는 사사분면에 머무는 시간이 약 7%였으나 해마에 NOX1의 발현을 억제시키는 상보적 염기서열 (Nox1shRNA)을 가진 경동맥폐색 동물에서는 약 20%로 증가됨을 나타냈다.

 

D. 기억능력 검사 훈련 5일, 10일째에 마지막 3번째 훈련 시행시 도피대가 제거된 채로 30초간 수영을 하게 하여 도피대 위를 지나가는 횟수를 측정하였을 때 10일째 검사에서 대조군의 경우 한 번도 도피대 위를 지나가지 못했으나 NOX1의 발현을 억제시키는 상보적 염기서열(Nox1shRNA)을 가진 경동맥 폐색 동물에서는 약 한 번 정도 도피대 위를 지나가는 것으로 나타났다.