바이오인

핵심내용

Cell지 게재, 섬유증과 암 전이 과정에서의 세포외기질 변화를 이해하는 실마리 제공

□ 국내 연구진이 주축이 된 국제공동연구팀이 세포 밖으로 분비돼 세포를 둘러싼 그물구조(세포외기질*)를 조절하는 단백질 티로신 인산화효소**를 세계 최초로 찾아냈다. 그물구조가 과하게 축적되는 섬유증***이나 그물구조의 분해가 필수적인 암전이과정을 이해하는 전기가 될 것으로 기대된다.

* 세포외기질 : 단백질과 탄수화물로 만들어진 세포 바깥쪽에 있는 그물 형태의 복잡한 구조로 동물 몸속 대부분의 세포는 세포외기질에 결합하고 있거나 둘러싸여 있다

** 단백질 티로신 인산화효소 : 단백질에 포함된 아미노산 티로신에 인산을 붙여주는 효소로 단백질간 결합이나 활성을 조절하여 다양한 세포활동에 관여한다

*** 섬유증 : 몸속의 기관, 조직에 세포외기질이 과다 축적된 것. 흉터의 원인이자 장기에 생기는 섬유증은 폐, 간, 심장, 동맥, 피부, 관절 등에 심각한 손상을 일으킨다

o 이화여대 생명과학전공 여창열 교수 연구진과 미국 하버드치과대학 말콤 휘트먼(Malcolm Whitman) 교수 연구진이 수행한 이번 연구는 미래창조과학부가 추진하는 중견연구자지원사업과 선도연구센터지원사업 그리고 농촌진흥청이 추진하는 차세대바이오그린21사업 지원을 받았으며 연구결과는 생명과학 분야 국제학술지 셀(Cell) 최신호(8월 29일자)에 주목받는 논문(Featured Article)으로 게재되었다.

(논문제목 : A secreted tyrosine kinase acts in the extracellular environment)

□ 그동안 세포외기질이나 세포 밖에서 인산화된 티로신을 가진 단백질이 많이 발견되지만, 이들 단백질을 인산화시키는 효소의 정체는 알려지지 않았다.

o 특히 세포의 생존, 기능, 분화를 위해 끊임없이 변화하는 그물구조(세포외기질)를 제대로 이해하려면 세포 바깥에서 작용하는 단백질 티로신 인산화효소를 찾아내는 것이 급선무였다.

□ 연구진은 생쥐의 뼈나 폐 발달에 필요한 것으로 알려진 단백질(VLK)*이 세포 밖으로 분비되며, 나아가 세포외기질과 세포외기질 분해효소를 인산화시키는 것을 알아냈다.

o 이번 연구결과가 향후 VLK의 생체내 기능 규명과 기능조절 물질 발굴로 이어질 경우 세포외기질 과다 축적 또는 분해에 의한 질병연구에 기여할 것으로 기대된다.

* VLK(Vertebrate Lonesome Kinase) : 생쥐와 흰줄까만송사리를 이용한 연구에서 배아 발달에 중요하며, 특히 뼈와 폐의 형성에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다

□ 실제 사람과 생쥐의 혈소판에 자극을 주면 혈소판 내부에 저장된 VLK가 세포 밖으로 분비되면서 함께 방출된 여러 단백질의 티로신을 인산화시키는 것으로 나타났다.

o 서열 분석 프로그램을 통해 VLK 말단에 세포 밖 분비를 지시하는 서열이 존재하는 것에 착안해 실제 VLK의 분비를 확인한 것이다.

□ 여창열 교수는 “이번 연구가 티로신 인산화에 의한 세포외기질과 세포외 단백질 기능 조절이라는 미개척 연구 분야의 실마리를 제공하고, 앞으로 세포외기질 형성 또는 기능 이상에 의해 생기는 질병의 치료제 개발을 위한 계기가 될 것”이라고 밝혔다.

상세내용

연 구 결 과 개 요

1. 연구배경

여러 종류의 조직과 배양 세포에서 얻어진 프로테오믹스(proteomics) 자료와 문헌에서 많은 종류의 세포외 단백질이 티로신 인산화 되어 있는 것으로 알려져 있지만, 현재까지 세포외로 분비되는 단백질 티로신 인산화효소(secreted protein tyrosine kinase)는 보고된 바가 없다.

세포 바깥에 있으며 티로신이 인산화 된 단백질에는 많은 종류의 세포외기질 단백질과 세포외기질 분해효소가 포함되어 있다. 세포외기질은 변화가 지속적으로 조절되는 미세 환경이라는 점과 세포외기질이 세포의 기능, 분화, 생존에 매우 중요 역할을 담당한다는 것이 점차 밝혀지면서 세포외 단백질의 인산화 과정과 이를 조절하는 유전자의 기능에 대한 연구의 중요성이 부각되고 있다.

세포 밖에서 단백질을 인산화 할 수 있는 효소는 2013년 사이언스(Science)지에 발표된 논문에서 처음으로 보고되었다. Tagliabracci 등은 Fam20C가 골지체에 존재하는 단백질 인산화효소이며, 카세인(Casein)을 비롯한 일부 단백질의 세린을 인산화 시킴을 보고하였다. 그러나 Fam20C는 일부 세포외 단백질만을 인산화 시키며 단백질 티로신 인산화효소 활성이 없는 것으로 알려졌다.

VLK는 세포분화가 진행 중인 배아줄기세포에서 발현되는 유전자로 처음 알려졌다. 이후 생쥐와 흰줄까만송사리를 이용한 연구에서 Vlk 유전자가 배아 발생에 중요하며, 특히 뼈와 폐의 형성에 중요한 역할을 담당하여 Vlk 유전자 삭제 생쥐는 출생 직후 사망하는 것으로 보고되었다. 한편 VLK는 Adtk1, AW548124, PKDCC, SGK493라는 이름으로도 알려져 있다. 연구팀은 VLK 단백질이 조면소포체(rough endoplasmic reticulum) 내부에도 존재하며 스스로를 인산화(autophosphorylation) 시킬 수 있다는 점에 착안하여 VLK의 세포외 단백질 티로신 인산화효소 활성에 대한 연구를 진행하게 되었다.

2. 연구내용

VLK의 아미노산서열을 신호펩티드(signal peptide)를 예측하는 여러 프로그램을 이용하여 분석한 결과 VLK 단백질의 아미노 말단에 신호펩티드일 가능성이 큰 부위가 있음을 확인하였다.

VLK를 과발현하는 293T 세포에서 세제(detergent)가 없는 등장성 세포용해 완충용액(isotonic lysis buffer)을 이용하여 얻은 세포추출물(cell extract)을 단백질분해효소 K(proteinase K)와 반응시키면 세포질 단백질은 완전히 분해되지만 과발현 시킨 VLK 단백질은 분해되지 않음을 확인하였다. 그러나 동일한 조건에서 신호펩티드가 없는 VLK 돌연변이 단백질은 완전히 분해되었다. 이는 VLK 단백질이 세포 내부의 막으로 보호된 구역에 존재함을 의미한다.

HepG2 세포가 VLK를 많이 발현하고 있음을 발견하였고, HepG2 세포를 분석한 결과 세포에서 정상적으로 발현되는 VLK 단백질이 세포배양액으로 지속적으로 분비됨을 확인하였다. VLK를 과발현하는 293T 세포에서도 마찬가지로 과발현 된 VLK 단백질이 세포배양액으로 지속적으로 분비되었다.

인간 혈소판의 알파과립(alpha granule)에 VLK 단백질이 많이 포함되어 있음을 발견하였고, 혈소판에 탈과립(degranulation) 유도자극을 처리한 경우 대부분의 VLK 단백질이 혈소판 밖으로 방출되었다. 혈소판 방출액(releasate)에 있는 여러 단백질이 티로신 인산화 되어 있음을 확인하였고, 혈소판 방출액을 항 VLK 항체와 반응시키거나 ATP 분해효소와 반응시키면 이들 단백질의 티로신 인산화가 현저하게 감소하였다. 이는 특정 세포 또는 상황에서는 VLK 단백질의 세포외 분비가 조절 될 가능성이 있음을 의미하고, 방출액에 있는 단백질의 티로신 인산화가 세포 밖으로 방출된 VLK에 의해 일어남을 의미한다.

프로테오믹스 자료 분석 결과 티로신 인산화가 되는 세포외 단백질 중에는 아미노산서열에는 큰 연관성이 없지만 유사한 기능을 가진 단백질 도메인의 특정 부위에 있는 티로신이 인산화 됨을 발견하였다. 특히 여러 세포외기질 분해효소(MMP, matrix metalloproteinase)에서 기질과의 결합에 관여하는 hemopexin 도메인의 외부로 노출되어 있는 티로신이 인산화 되어 있었다.

293T 세포에 VLK와 함께 MMP1, MMP13, MMP14, MMP19 또는 MMP27을 각각 발현한 경우 과발현 한 MMP 단백질이 VLK에 의해 티로신 인산화 됨을 확인하였다. 그러나 VLK의 인산화효소 활성이 결핍된 돌연변이 VLK 단백질을 과발현 한 경우에는 MMP 단백질의 티로신 인산화가 관찰되지 않았다. 또한 VLK 단백질 발현을 억제하는 shRNA를 발현하는 293T 세포에서는 정상적으로 발현되는 MMP13 단백질의 티로신 인산화가 현저히 감소함을 확인하였다. MMP 단백질에서 VLK에 의해 티로신 인산화 된 부위는 기존의 프로테오믹스 자료에서 보고된 티로신이 포함되어 있음을 확인하였다. VLK는 또한 MMP와는 연관이 없지만 티로신 인산화가 보고되어 있는 여러 세포외 단백질(laminin A1, FUT8, TNFSF10)의 티로신을 인산화 시키는 것을 확인하였다.

마지막으로 류머티스성 관절염(rheumatoid arthritis) 환자에서 추출한 K4 관절 윤활막세포(synoviocyte)에 VLK를 발현하여 VLK에 의해 티로신 인산화 되는 단백질을 프로테오믹스 기법으로 분석한 결과, 140개의 단백질이 VLK에 의해 티로신 인산화 됨을 발견하였고 이들 중 48개의 단백질이 세포 밖으로 분비되거나 세포막 또는 내막계(endomembrane system)에 존재하는 단백질임을 확인하였다. 이들 단백질은 여러 가지 다른 기능 군에 속하는 단백질이었으며, 이 중 11개의 단백질만이 티로신 인산화가 보고되어 있었다.

3. 기대효과

VLK에 의한 세포외기질 티로신 인산화의 기능을 밝히는 것은 인간을 비롯한 동물에서 세포외기질의 변화가 장기와 조직 항상성 조절에 차지하는 중요성으로 미루어 볼 때 세포외기질 조절 기능을 이해하는 연구에 중요한 실마리가 될 것으로 기대된다.

또한 인간에서 이미 VLK 유전자가 골밀도 조절과 소아 천식에 밀접한 연관이 있는 것으로 밝혀진 것처럼, VLK의 기능 이상이 여러 질병의 원인이 되거나 관련이 있을 가능성이 높다고 판단된다. VLK의 기능을 조절할 수 있는 물질을 발굴하면, 섬유증 등과 같이 세포외기질 과다 축적에 의한 장기 손상을 일으키는 질병과 세포외기질 분해가 동반되는 암 전이와 관절염 등의 질병 치료제 개발에 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

연 구 결 과 문 답

용 어 설 명

1. Cell지

○ Cell Press가 격주로 발행하는 생명분야 국제학술지

2. 단백질 티로신 인산화 효소(protein tyrosine kinase)

○ 티로신은 단백질을 구성하는 20가지 아미노산 중 하나이며, 티로신 인산화효소는 단백질에 포함되어 있는 티로신에 인산을 붙여주는 효소들을 통칭하는 것임.

○ 인산화를 통해 표적단백질간의 결합, 효소 활성 등을 조절하여 세포신호전달을 포함한 다양한 세포 활동을 조절함.

3. VLK(Vertebrate Lonesome Kinase)

○ Vlk 유전자가 배아 발생에 중요하며, 특히 뼈와 폐의 형성에 중요한 역할을 담당하여 Vlk 유전자 삭제 생쥐는 출생 직후 사망하는 것으로 보고되었다.

4. 신호펩티드(signal peptide)

○ 조면소포체에서 합성되는 단백질은 대부분 신호펩티드를 가지고 있으며, 신호펩티드에 의해 조면소포체로 인도된다.

5. 세포외기질(extracellular matrix)

○ 단백질과 탄수화물로 만들어진 세포 바깥쪽에 있는 그물 형태의 복잡한 구조이며, 동물 몸속 대부분의 세포는 세포외기질에 결합하고 있거나 둘러싸여 있음.

6. 조면소포체(rough endoplasmic reticulum)

○ 표면에 단백질 합성을 담당하는 리보솜(ribosome)이 붙어 있는 세포소기관. 세포 밖으로 분비되는 단백질과 세포막, 조면소포체, 골지체에 있는 단백질이 여기에서 만들어진다.

7. 골지체(Golgi apparatus)

○ 막 주머니를 팬케이크를 쌓아놓은 것 같은 모양의 세포소기관. 조면소포체에서 만들어진 단백질을 전달받아 탄수화물 부착 등의 변형을 시킨 다음, 세포 각 부분으로 이동될 단백질끼리 분류하여 내보낸다.

그 림 설 명

그림. VLK의 단백질 티로신 인산화 기능

VLK 단백질은 합성되면서 신호펩티드(signal peptide, SP)에 의해 조면소포체(녹색)로 이동한 후 신호펩티드가 잘리면서 조면소포체 내부로 합성된다. VLK 단백질은 조면소포체와 골지체(노란색)에서 세포 바깥으로 분비되며 세포외기질(extracellular matrix), 세포외 단백질, 조면소면체와 골지체 단백질의 티로신 인산화를 조절한다.

(출처 : Cell Bordoli et al.)