바이오인

핵심내용

마이크로RNA 생성 열쇠,‘드로셔 단백질’3차원 구조 밝혔다

엑스선결정학 방법 활용...새로운 진화 가설도 제시
 

□ 미래창조과학부(장관 최양희) 산하 기초과학연구원(IBS, 원장 김두철) RNA 연구단 김빛내리 단장 연구팀이 마이크로알엔에이(이하 miRNA) 생성에 결정적 역할을 하는 드로셔(DROSHA) 단백질의 3차원 구조를 세계 최초로 밝혀냈다.

ㅇ miRNA는 세포의 발생, 분화, 사멸, 분열, 암 발생 등 세포내에서 다른 유전자를 조절하는 핵심적인 역할을 한다.

□ 지난 6월 김빛내리 단장은 우재성 IBS 연구위원(서울대 연구교수)과 드로셔-DGCR8 단백질 복합체(일명 마이크로프로세서)가 1개의 드로셔와 2개의 DGCR8 분자로 구성돼 있음을 처음으로 규명한데 이어,

ㅇ 이번 연구에서 엑스선결정학 방법으로 드로셔 단백질의 3차원 구조를 규명함으로써 그동안 불명확했던 드로셔의 일부 작동 원리를 알아냈다.

* 엑스선결정학 방법 : 단백질에 엑스선을 쬐어 생기는 고유의 회절 패턴을 겹겹이 쌓아 그 구조를 파악하는 방법. 마치 3차원 좌표에 특정 단백질이 갖는 공간적 특성을 그려내는 방법과 같다.

ㅇ 지난 2003년 드로셔 단백질이 처음 발견된 후, 12년 만에 김 단장 연구팀이 처음으로 그 3차원 구조를 밝혀낸 것이다.

□ 이번 연구는 드로셔 단백질의 3차원 구조를 처음으로 파악해 냄으로써 그 작동 원리를 보다 세부적이고 깊게 이해할 수 있는 바탕을 마련한 데 큰 의의가 있다.

ㅇ 이번 연구에서 miRNA 생성과정에서 재료물질(miRNA 1차 전구체)절단을 담당하는 마이크로프로세서의 드로셔 분자가 DGCR8 분자 두 개와 결합하는 위치를 명확히 규명했다.

ㅇ 연구진은 드로셔 단백질 3차원 모델링을 통해 마이크로프로세서 중 드로셔의 돌출부가 miRNA 1차 전구체의 하단 분기점에 끼워져 분기점을 인식하고 정확한 위치를 절단하는 모델을 제시했다.

ㅇ 또한, 드로셔 단백질의 3차원 구조가 miRNA 2차 전구체의 절단에 관여하는 다이서 단백질과 구조적으로 유사함을 확인하고,

ㅇ 드로셔와 다이서가 같은 단백질로부터 진화했을 수 있다는 새로운 진화가설도 제시했다.

□ 이번 연구결과는 miRNA 생성과정(연구결과개요 참조,p.3)의 이해를 한층 확장했다. miRNA의 생성과 발현과정을 이해하면 유전자 변이나 이상발현으로 인한 질병의 치료법을 찾을 수 있다. 이번 연구성과는 miRNA를 이용한 신약 개발 등 응용 연구에 이론적 기반을 제공할 것으로 기대된다.

ㅇ 김 단장은 “이번 연구는 지난 6월 Cell 논문을 통해 드로셔-DGCR8 복합체 기능과 구성을 밝힌 데서 더 나아가 드로셔의 구조를 밝히는데 성공했다”며 “연속성 있는 연구가 가능한 환경에서 이뤄낸 쾌거”라고 밝혔다.

□ 이번 연구 결과는 생명과학분야 세계 최고 권위지 셀(Cell, IF 33.116)誌 12월 31일자(한국시각 1.1. 새벽 2시) 온라인에 게재되었다.

ㅇ 또한 셀은 김빛내리 단장과 우재성 연구위원 등 연구자들이 3차원(3D) 프린터로 구현한 드로셔 모형 등을 활용해 이번 연구 결과를 직접 설명하는 동영상을 자사 웹페이지(www.cell.com/cell) 및 유튜브 채널(www.youtube.com/user/cellvideoabstracts)을 통해 공개할 예정이다.

상세내용

연 구 결 과 개 요

Structure of human DROSHA

S. Chul Kwon, Tuan Anh Nguyen, Yeon-Gil Choi1, Myung Hyun Jo, Sungchul Hohng, V. Narry Kim*, Jae-Sung Woo*
(Cell, in press)

마이크로RNA는 약 22 뉴클레오티드 길이의 짧은 RNA이다. 세포의 증식과 분화, 조직의 발달, 면역 반응, 노화와 질병 등 생명 현상의 모든 과정에 직간접적으로 중요한 영향을 미치는 유전자 발현 조절자이다. 마이크로RNA는 전구체로부터 2단계에 걸친 정확한 절단 과정을 거쳐서 생성된다. 먼저 핵 내에서 RNA 중합효소에 의해 생성된 마이크로RNA 1차 전구체가 드로셔-DGCR8 단백질 복합체(마이크로프로세서)에 의해 절단되고, 이로 인해 생성된 마이크로RNA 2차 전구체가 핵 밖으로 나가 세포질에서 다이서 단백질에 의해 다시 한 번 절단되어 약 22 뉴클레오티드 길이를 가진 마이크로RNA가 된다. 이후 마이크로RNA는 아고놋 단백질에 장착되어 다른 유전자의 발현을 특이적으로 조절하는 기능을 수행한다. 사람의 유전체에는 2000여종의 마이크로RNA가 있는 것으로 보고되었는데, 이들 대부분이 드로셔-DGCR8 복합체와 다이서 단백질에 의한 2단계 절단 과정을 통해 생성되는 것으로 알려져 있기에, 그동안 이러한 2단계 절단 과정의 정확한 기작에 대한 연구가 중요하게 이루어졌다.

엑스선결정학 방법은 단백질의 구조를 옹스트롬(10-10 m) 단위 수준에서 확인할 수 있는 실험기법으로, 단백질이 어떻게 작동하여 그 고유한 역할을 수행하는지 명확히 알 수 있는 장점이 있지만, 단백질 고유의 특성 및 실험 조건에 따라 단백질 결정이 만들어지지 않을 가능성이 커 연구 성공률이 낮다는 단점이 있다. 예를 들어, 2001년에 발견된 다이서 단백질은 2006년에 단백질의 구조가 보고되었지만, 2003년에 발견된 드로셔 단백질은 2015년까지 수많은 연구팀들이 그 구조를 밝히고자 도전했지만 아무도 성공하지 못했다.
연구팀은 드로셔의 파트너 단백질인 DGCR8의 C-말단 부분을 드로셔와 함께 발현시키는 방법을 이용하여 세계 최초로 균일하고 안정적인 드로셔 단백질을 정제할 수 있었고, 이를 이용하여 드로셔와 DGCR8의 기능과 구성에 대한 내용을 지난 6월 셀(Cell)에 게재하였다. 이번 연구는 위에서 정제한 드로셔 단백질을 엑스선결정학 방법을 통해서 그 구조를 밝힌 것으로서 그동안 알지 못했던 중요한 질문에 대한 답을 할 수 있게 되었다.

첫째로 연구팀은 드로셔가 DGCR8과 어떻게 결합하여 마이크로프로세서를 형성하는지 모델을 제시하였다. 드로셔를 안정적으로 정제하기 위해 넣어주었던 DGCR8 C-말단이 엑스선결정학 방법에서 드로셔와 함께 검출되었기에, 연구팀은 DGCR8의 C-말단이 드로셔와 결합하는 위치를 확인할 수 있었고, 단일분자실험 방법을 이용하여 이를 증명하였다.

둘째로 마이크로프로세서가 마이크로RNA 1차 전구체를 어떻게 인지하는지에 대한 3차원 모델을 처음으로 제시하였다. 이전 연구에서 연구팀은 드로셔가 머리핀 모양으로 생긴 마이크로RNA 1차 전구체의 하단분기점을 인식해서 약 11 bp (약 28 X 10-10 m) 길이가 떨어진 곳을 자르는 것을 밝혔는데, 이번 연구에서는 어떻게 그것이 가능한지에 대한 구조적 증거를 찾아내었다.

셋째로 연구팀은 드로셔 단백질의 진화적 기원을 제시하였다. 예상치 못하게 드로셔 단백질의 구조는 마이크로 2차 전구체의 절단을 담당하는 다이서 단백질의 구조와 상당히 유사하다는 사실을 발견했다. 드로셔 단백질과 다이서 단백질은 서로 다른 길이의 RNA 구조를 인지하여 절단할 뿐 아니라, RNA 절단 역할을 수행하는 리보뉴클레이즈 도메인을 제외하면 아미노산 서열의 유사성도 매우 낮았기에, 드로셔는 다이서와는 독립적으로 진화했을 가능성이 제시되어 있었다. 그러나 이번 연구를 통해 드로셔와 다이서 간 구조적 유사성이 밝혀졌으므로, 드로셔는 다이서와의 공통 조상 단백질로부터 진화했을 가능성이 높다.

결론적으로 이 연구 결과는 마이크로RNA의 생성 과정에 대한 심도 깊은 이해를 가능하게 하였고, 마이크로RNA를 이용한 신약 개발 등의 응용 연구에 대한 이론적 단초를 제공한다.

연구 이야기

□ 연구를 시작한 계기나 배경은?

단백질의 상세한 구조와 작용 메커니즘을 연구하기 위해선 순수하게 정제된 단백질 시료가 필수적이다. 하지만 세포 내 단백질은 대개 미량 발현되고 다른 물질과 다양한 상호작용을 하고 있다. 단백질 정제를 위해서는 대량 발현이 필요하고 정제과정 중 안정성과 기능에 필요한 상호작용들을 놓치는 경우가 많다. 이런 이유로 의학적, 생물학적으로 중요하다고 알려진 많은 인간 단백질들의 정제가 불가능해 명확한 메커니즘 연구에 큰 걸림돌이 되고 있다. 이를 해결하기 위해 본 연구팀은 지속적으로 인간 세포 발현 시스템을 개발해 오고 있었으며 지금까지 정제되지 못한 다양한 인간 단백질들의 발현과 정제를 시도하고 있다.
드로셔의 경우 그 중요성이 널리 알려진 지 10년이 넘었지만 단백질 시료를 얻는 기술에 한계가 있었다. 때문에 그 기능과 성격이 제대로 분석되지 못한 상태였다. 드로셔 정제에 있어 가장 큰 문제는 과발현 시 본래 접혀 있는 형태를 잘 유지하지 못하고 용해도가 낮다는 것이었다. 또한 파트너인 DGCR8과 함께 발현해도 복합체의 크기 및 형태가 균일하지 않아 정제가 불가능하였다.
본 연구팀은 드로셔 단백질이 널리 쓰이는 발현 시스템들로부터는 쉽게 얻을 수 없는 단백질임을 간파하고, 개발 중인 인간 세포 발현 시스템을 적용해 볼 수 있는 적합한 목표라 생각하여 이 프로젝트를 시작하게 되었다.

□ 연구 전개 과정에 대한 소개

단백질 구조 연구를 위해선 빽빽, 단단, 균일한 형태로 순수하게 정제된 단백질이 필수적이다. 하지만 드로셔 역시 다른 단백질들과 마찬가지로 유동적인 부분들을 가지고 있었다. 핵심 기능을 유지하고 있는 단백질의 구조를 찾기 위해 다양한 구조들을 빠른 시간 내에 복제하고 그 특징을 구별해내는 시스템을 먼저 개발하였다. 그 뒤 여러 버퍼(pH 등이 일정해 결정화에 적합한 환경을 제공하는 용액)들의 조건값을 시험한 결과 소량의 에탄올을 다른 결정화 조건들에 첨가하고 기존의 작은 결정들을 심어 성장시키는 특이한 방법으로 결정을 발전시켰다. 그 후 연구팀은 결정의 엑스선 회절 해상도가 얼마나 발전하였는지를 알기 위해 2년간 거의 매월 포항 가속기 연구소(PAL)의 빔라인을 사용하였다. 최고로 발전된 결정으로 3.2 옹스트롬의 해상도를 보이는 데이터를 얻을 수 있었는데, 이 해상도는 새로운 단백질의 구조를 풀기에 쉽지 않은 해상도였다. 약 6개월간 다양한 중금속 표식법이 시도된 끝에 단백질 구조의 전자지도를 얻을 수 있었다. 그리고 3개월에 걸친 단백질 모델 구축 작업 끝에 비로소 대략적인 드로셔의 구조가 해석이 되었다.

□ 연구하면서 어려웠던 점이나 장애요소가 있었다면 무엇인지? 어떻게 극복(해결)하였는지?

단백질 구조를 보기 위해 단백질을 결정화하는 과정이 상당히 오래 걸리고 어려웠다. 먼저 인간 배아 신장 293 세포 (HEK293)를 3-4 리터 배양하여 단백질을 발현하고, 정제하였다. 정제된 단백질을 결정화하는데 성공하였지만, 공교롭게도 에탄올이 20%인 용액 조건에서 작은 결정이 생겼다. 소주를 비롯하여 다양한 술들을 시험해 볼까 하는 생각도 하면서 연구진들과 웃었던 기억이 난다. 알코올 성분은 물보다 휘발성이 높아 결정 성장과 발전에는 어려웠고 결정화 조건을 재발견해야했다. 이 과정에서 소량의 에탄올을 첨가하는 방식으로 결정화를 보는데 성공했다. 
매월 포항 가속기 연구소(PAL)의 빔라인을 사용하였는데, 긴 기간을 배려해준 5C 빔라인 측의 지원도 연구의 속도를 높이는 데 큰 기여를 하였다.

□ 이번 성과, 무엇이 다른가?

생명현상은 실제로 3차원적이다. 생명물질의 3차원 구조는 생명현상을 3차원적으로 이해하는 기초를 제공한다. 이번 성과는 드로셔 단백질의 구조를 최초로 밝힘으로서 마이크로RNA 생성 초기에 일어나는 절단 현상을 3차원적으로 이해하는 기초를 설립하였다.
특히 드로셔 구조를 밝힌 논문을 셀에 투고한 뒤 3명의 익명 동료과학자들로부터 피어 리뷰 시 마이크로 RNA 분야에 매우 환영받을만한 일, 획기적인 사건이자 엄청나게 중요한 진전 등 찬사를 받았다. 

□ 꼭 이루고 싶은 목표와, 향후 연구계획은?

단백질 결정화부터 3차원 구조 규명까지 긴 여정이 끝났지만 끝이 아니다. 실제 세포 내에서 드로셔의 기능과 활성 메커니즘을 정확하게 반영하기 위해 밝혀낸 3차원 구조를 검증해봐야 한다. 우재성 연구위원은 “단백질 구조는 그 자체가 하나의 발견이기도 하지만 생물학자 입장에서는 소중한 데이터이고 더 큰 발견을 위한 교두보이다”라며 “구조를 바탕으로 의미있는 생화학 및 생물리학 연구들을 디자인할 수 있고 더 많은 정보를 지닌 구조들을 정확하게 풀기 위한 연구들을 디자인 할 수 있다”고 밝혔다.
RNA와 결합된 마이크로프로세서의 구조를 규명하는 것이 앞으로의 중요한 과제이다. 이 구조가 있어야 miRNA 1차 전사체의 절단 메커니즘을 완전히 이해할 수 있을 것으로 보고 있다.
RNA연구단은 RNA 생화학 분야에서 세계 최고 수준의 연구를 진행하고 있고 뛰어난 노하우를 지니고 있다. 이번 연구성과로 RNA연구단은 진행되고 있는 연구에 날개를 단 셈이다. 더군다나 이 구조는 찾아낸 사실보다 찾아낸 질문이 더 많다. 그래서 사실, 지금까지의 연구보다도 앞으로의 연구가 더 기대가 된다.

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