바이오인

핵심내용

의약품 속 동물 유래 시알산 분석법 제시

□ 우리 몸에서 합성되지 않지만 바이오의약품 속에 다량 포함되어 있는 시알산의 정량 분석 방법이 보고되었다. 김준곤 교수(고려대학교)와 안현주 교수(충남대학교) 연구팀이 주인-손님 화학을 이용해 인간이 아닌 포유류의 시알산을 유도체화하지 않고 분석해내는 방법을 제시했다고 한국연구재단(이사장 노정혜)은 밝혔다.

□ 시알산 중 하나인 글리콜뉴라민산(Neu5Gc)을 섭취하면 우리 몸에서 면역 반응이 일어난다. 글리콜뉴라민산은 포유류의 세포 및 추출물로 제조한 치료용 단백질에 다량 존재하기 때문에, 반복적으로 과량 투여되는 의약품에서의 함량을 정확히 확인하는 것이 중요하다.

□ 기존 연구들은 주로 액체 크로마토그래피를 사용해 글리콜뉴라민산을 분리했다. 이때 또 다른 시알산인 아세틸뉴라민산(Neu5Ac)과 구분하기 위해 많은 시간을 들여 유도체화 하는 과정이 소요되었다.

□ 연구팀은 기체상 주인-손님 화학*을 이용해 두 종류의 시알산을 유도체화나 추가적인 분리 없이 높은 감도로 정량해냈다.
   * 주인-손님 화학 : 주인 역할을 하는 분자가 자신의 분자 구조 내에 손님 분자를 선택적으로 받아들여 안정한 복합체를 형성하는 현상을 연구하는 화학 분야

 ㅇ 연구 결과, 두 시알산의 용액 상태의 농도 비가 기체 상태에서 주인-손님 복합체 비율과 비례하였다. 복합체 형성 비율은 주인 분자의 구조 인식 능력에 의해 결정된다. 이점을 이용해서 각 시알산 복합체 이온의 세기를 비교분석하는 원리이다.

 ㅇ 개발된 분석법은 글리콜뉴라민산을 최소 농도 1.6 pmol(피코몰)까지 정량할 수 있어, 유도체화가 필요한 기존 분석법들과 비견된다. 또한 대표적 치료용 단백질인 세툭시밥, 에리스로포이에틴 등을 포함한 7종의 당단백질에서 시알산 함량을 확인함으로써 분석의 우수성을 입증했다. 

□ 김준곤 교수는 “이 연구는 주인-손님 화학과 기체이온화학 분야를 융합해 새로운 질량분석법 기반 분석법을 개발하고 이를 실제 현장에서 겪는 문제해결에 적용한 것”이라고 설명하며, “향후 분석에 어려움이 있는 다른 표적 물질에도 적용하는 추가 연구를 진행할 계획”이라고 밝혔다.

□ 이 연구 성과는 과학기술정보통신부·한국연구재단 기초연구사업(중견연구) 등의 지원으로 수행되었다. 국제학술지 미국화학회지(JACS) 8월 28일에 게재되었다.

<참고자료> : 1. 주요내용 설명
                  2. 그림 설명
                  3. 연구 이야기

상세내용

■ 주요내용 설명

□ 논문명, 저자정보

논문명
Accurate Quantification of N-glycolylneuraminic Acid in Therapeutic Proteins Using Supramolecular Mass Spectrometry

저  자
김준곤 교수(교신저자, 고려대학교), 안현주 교수(교신저자, 충남대학교), 이현희 박사과정 학생(제1저자, 고려대학교).

□ 연구의 주요내용

 1. 연구의 필요성
  ○ 단백질 재조합 기술의 발전에 의해 현재 그 시장 규모가 미국에서 수백억 달러에 가까운 치료용 단백질들은 여러 종의 세포 및 추출물들을 통해 생산되고 있다. 사람 단백질의 번역 후 변형(post-translational modification, PTM)을 모사하기 위하여 주로 사람을 포함한 포유류들의 세포를 사용하며, 여러 종 중 단백질의 생산 효율과 제조의 용이성에 맞춰 단백질마다 특정 종의 세포가 사용되고 있다. 허나 최근 사람이 아닌 포유류들에서 유래된 세포 및 추출물을 사용할 때 사람에게서 발견되지 않는 비인간 PTM들이 존재한다는 것이 발견되었다. 또한 비인간 PTM 중 몇몇은 사람의 체내에서 면역 반응을 일으킨다는 것이 밝혀졌다.

  ○ 비인간 PTM 중 하나이며 포유류에서 풍부한 시알산(sialic acid)인 N-glycolylneuraminic acid(Neu5Gc)는 암 세포에서 높은 농도로 존재함이 밝혀져 더욱 많은 관심을 받았다. 많은 연구들을 통하여 Neu5Gc가 글리칸(glycan)에 존재하는 치료용 단백질들의 경우 그렇지 못한 경우에 비하여 빠르게 인체 내에서 제거됨이 밝혀졌다. 따라서 사람이 아닌 포유류 세포를 사용하여 제조된 단백질들을 판매하는 제조회사에는 해당 단백질의 품질을 보장하기 위하여 단백질 내 Neu5Gc의 함량을 확인하고 있다. 허나 이 단백질에 공존하고 있는 또 다른 시알산인 N-acetylneuraminic acid(Neu5Ac)에 의해 Neu5Gc의 정량 분석을 위해서는 두 시알산들의 유도체화 과정이 필요하였다.

  ○ 따라서 연구진은 두 시알산들을 높은 감도를 가지며 유도체화 없이 한 번에 정량하기 위하여 이전 연구에서 그 분석 능력이 증명된 기체상 주인-손님 화학을 이용하고자 하였다. 기존의 연구에서 기체상 주인-손님 화학은 친수성이 높고 미세한 구조적 차이를 지닌 단당류 이성질체들을 정성 및 정량 분석하는데 효과적으로 쓰일 수 있음이 밝혀졌다. 특히 두 단당류 이성질체들의 주인 분자에 대한 기체상 복합체 형성 비율이 두 이성질체들의 용액상 농도 비와 비례함을 이용하여 높은 감도를 가지며 이성질체들을 정량할 수 있음이 밝혀졌다. 따라서 이 분석법을 이용하여 친수성이 높고 수산기 하나의 구조적 차이만을 지닌 두 시알산들을 정량하고자 하였다.
 
 2. 연구내용
  ○ 연구진은 먼저 용액 상에서 주인 분자인 쿠커비투릴[7](cucurbit[7]uril, CB[7])과 시알산들이 결합을 이루는지 확인하였다. 용액 상에서 결합이 있을 경우 용액 상과 기체상에서 모두 복합체 형성이 일어나 용액 상 농도 비와 비례하지 않을 수 있으므로 이를 확인하였다. 실험 결과, 두 시알산 모두 pH 2와 7의 완충액에서 CB[7]과 결합하지 않음을 확인하였다. 따라서 다음으로 두 시알산들의 CB[7]에 대한 기체상 복합체 형성 비율과 용액 상 농도 비율이 선형적 관계를 가지는지를 확인해보았다. 연구 결과, 결정 계수(coefficient of determination, R^2)가 0.999인 매우 선형적인 비례 관계를 갖고 있음을 확인할 수 있었다. 또한 이 비례식을 이용하여 수 pmol의 Neu5Gc와 Neu5Ac 모두를 정량할 수 있음을 확인하였다 (Neu5Gc의 정량 한계: 1.60 pmol; Neu5Ac의 정량 한계: 0.65 pmol).

  ○ 다음으로 이온이동도 질량분석법과 계산 화학을 이용하여 두 시알산들이 주인 분자인 CB[7]과 기체상에서 어떤 형태로 결합을 하고 있는지를 확인해 보았다. 연구 결과, 시알산들이 기체상에서 CB[7]과 복합체를 형성하는 경우 항상 CB[7]의 공동 내에 존재함을 확인할 수 있었다. 또한 복합체를 형성하지 않는 경우 시알산의 아세트아미드(acetamide) 작용기의 산소 원자에 양성자가 첨가되는 것이 해당 작용기의 질소 원자에 첨가되는 것보다 에너지적으로 우세함에도 불구하고(10-20 kJ/mol), Neu5Gc가 CB[7]과 복합체를 형성한 경우에는 질소 원자에 양성자가 첨가된 구조가 산소 원자에 양성자가 첨가된 구조보다 매우 안정함을 확인할 수 있었다(약 70 kJ/mol 차이). 반면에 Neu5Ac의 경우, 복합체를 형성하지 않을 때와 마찬가지로 산소에 양성자가 첨가된 경우가 더 안정하였다. 이 에너지 차이는 복합체 구조를 통하여 이해될 수 있다. Neu5Gc에 추가적으로 존재하는 수산기가 CB[7]의 카보닐 산소들과 상호작용하여 아세트아미드 작용기를 U자의 형태를 띄게 하였다. 또한 이 구조를 통하여 아세트아미드기의 카보닐 산소가 주인 분자의 입구에 존재하는 카보닐 산소들과 멀어져 에너지적으로 안정화됨이 확인되었다. 반면에 수산기가 존재하지 않는 Neu5Ac의 경우 위의 구조를 통한 에너지 안정화가 불가함을 확인할 수 있었다. 결과적으로, CB[7]과 시알산들 간의 독특한 상호작용에 의해 이 선형 관계를 갖는 복합체화가 이뤄졌음을 확인할 수 있었다.

  ○ 마지막으로 이 분석법을 이용하여 실제 치료용 당단백질 내 두 시알산들을 정량할 수 있는지 확인해 보았다. 치료용 단백질인 세툭시맙(cetuximab)과 에리스로포이에틴(erythropoietin)을 포함한 총 일곱 종의 당단백질들이 조사되었다. 실험 결과, 기존에 있던 분석법을 이용해 얻은 농도와 이 연구의 분석법을 통해 얻은 농도 간 상대 오차가 26.5% 이내로 매우 유사함을 확인할 수 있었다. 또한 기존에 세툭시맙에서 검출되지 못하였던 Neu5Ac가 이 분석법을 이용해서는 관찰됨을 확인하였다.

 3. 연구성과/기대효과
  ○ 이 연구에서는 치료용 당단백질 내 미량 존재하는 비인간 시알산을 유도체화 없이 높은 감도로 정량할 수 있는 기체상 주인-손님 화학을 이용한 분석법을 제시하였다. 또한 해당 분석법이 주인 분자와 시알산과의 독특한 기체상 상호작용에 기반하는 점을 분자적 관점으로 보여주었다. 이 연구는 유도체화 과정 등에 의해 많은 분석 시간이 소요되었던 기존 방법의 문제를 해결하기 위하여, 두 화학 분야를 결합하여 높은 감도를 지닌 분석법을 새롭게 개발함에 의의가 있다. 연구진은 이 연구가 제조업체들의 분석 효율 증진에 큰 기여를 할 것이라 기대한다.
 

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