바이오인

출처 : 생물학연구정보센터(BRIC) 

패치 클램프를 이용한 전기생리학 연구동향

저자 / 김성영

[목 차]

1. 서론

2. 본론

  2.1 APC platforms - first generation

  2.2 APC platforms - Second generation

  2.3 APC platforms ? Advantages

  2.4 APC platforms를 활용한 industry의 신약개발

3. 결론

4. 참고문헌

[요약문]

세포의 이온 통로 활동을 기록할 수 있는 기기가 패치 클램프(Patch Clamp)이다. 전통적인 Manual Patch Clamp (MPC)에서 최근 많이 이용되는 Automated Patch Clamp (APC)까지 전기생리학 분야는 많은 기술적인 진보를 이루었다. APC technology는 2000년대에 들어서면서 본격 개발되었다. 놀라울 정도로 향상된 평가 속도는 기존의 MPC를 대체할 수 있는 구세주가 되었다. APC 덕분에 industry에서도 이온채널을 타겟으로 한 신약개발이 훨씬 용이하게 되었다.

1. 서론

 일반적으로 이온채널 연구와 전기생리학 실험은 하나의 세포에서 이온의 세포막 통과에 따른 전류, 전압을 측정한다[1,2]. 이때 사용하는 기기가 패치 클램프이다. 매뉴얼 패치 클램프가 이온채널 연구의 Gold standard이지만 이 방법은 고도의 숙련된 operator가 있어야 하며, throughput이 낮으며(20~40 data points per working day), 노동 집약적이라는 단점을 가지고 있다. 그렇기 때문에 이온채널 연구는 academy에서 제한적으로밖에 이루어지지 않았다. 

이러한 MPC의 단점은 2000년 초반에 automated patch clamp (APC)라는 혁신적인 기기의 등장으로 인해 극복되고 있으며, 제약업계에서도 활발하게 이온채널 신약개발 연구를 가능하게 만들었다(3). APC key development는 이온채널을 발현하는 세포가 붙을 수 있는 planar type의 recoding site이다. MPC에서는 micro-manipulator를 이용하여 정밀하게 glass electrode pipette을 하나의 세포에 붙이게 된다. APC에서는 다량의 cell suspension을 흘려주고, gravity와 negative pressure를 이용하여 planar recording chip(plate)에 붙게 만드는 원리를 사용한다(그림 1). 일단 세포가 planar chip에 붙게 되면 negative pressure를 증가시켜 high quality 패치 클램프 기록의 상징인 resistance seals(100 MΩ ~ 수 GΩ)를 형성하게 된다. APC는 작동법이 간단하여 고도의 테크닉을 요하지 않는다. 오히려 기기 다루는 것보다 세포배양이 더 중요하다. 하지만 기기값이 너무 고가이며(1~10억), 유지비가 비싸다는(96~383 well or single chip 소모) 단점이 있다. 그렇기 때문에 제약회사나 연구비가 풍부한 학교에서만 제한적으로 이용되고 있다.

그림 1. MPC와 APC의 작동원리

Recording plate 혹은 chip을 재활용할 수 있으면 좋겠지만 현재 나와 있는 기기들은 재활용이 불가능하다[4]. 

본 보고서에서는 현재까지의 APC를 이용한 전기생리학 연구 동향을 리뷰해 보고자 한다. 

2. 본론

2.1 APC platforms - first generation

 APC platform은 거의 20년 동안 발달해왔다. 크게 First generation과 second generation으로 구분해 보도록 하겠다(그림 2).

그림 2. APC의 발달 순서

 간략히 말하면, First APC platform은 아래 3가지의 recording format을 사용하였다.

1) Automated recording electrode pipette-to-cell recordings, mimicking MPC recordings via robotics (Apatchi-1, Sophion A/S, Denmark)[5].

 2) Cell suspensions inside inverted pipettes, each forming a seal with a single cell from the suspension, for example, AutoPatch, CeNeS (acquired by Xention) (Mathes, 2003); Flyscreen, Flyion GmbH, Germany[6].

 3) Cell suspensions applied via automated pipettors to planar arrays of recording sites (planar recording chips), for example, Patchliner, Nanion Technologies GmbH, Germany[7].

세가지 방법 중 가장 효과적이고 성공적인 방법은 세 번째 방법으로 multiple recording site에서 planar recording chip을 이용하는 것이다. 현재 standard한 APC platform의 방법이 되었다[8]. 이 방법은 한번의 시험에서 multiple recording이 가능하다. 

First generation APC의 등장으로 엄청난 평가 throughput의 향상을 가져왔다. MPC는 20~40 data point/day가 고작인데, APC는 throughput을 10-100배 향상시켰다. 하루에 수백 개의 화합물을 스크리닝 할 수 있게 된 것이다. 

표 1. First generation APC 비교

384개의 recording이 동시에 가능한 first generation APC의 경우 일반적으로 저항이 100MΩ정도의 loose seal을 나타낸다. MPC에서는 GΩ seal을 나타낸다. 참고로 GΩ seal을 형성해야 신뢰성 있는 결과값 산출이 가능하다. 

APC 중 PatchXpress는 throughput은 떨어지지만(16개를 동시에 기록함), GΩ을 만들 수 있다는 장점이 있다. 필자 경험상 PatchXpress의 결과값이 신뢰성이 높다.

Patchliner, SyncroPatch96기기 경우는, GΩ seal을 만들기 위해서는 ‘seal enhancer’ 용액이 필요하다. Seal enhancer는 40mM의 Ca2+용액이다. 이것은 Ca2+농도에 sensitive한 이온채널을 기록시에는 아마 좋지 않은 영향을 줄 것이다. 이 seal enhancer는 recording 시작 전에 seal 형성에 사용하며, Giga seal이 형성되면 wash out 해버린다. 

초기 모델들의 문제점 중의 하나가 recording volume과 test compound의 washout 능력이다. IonWorks HT는 적은 recording well volume (~20ul)와 두 농도의 시험물질만 세포에 흘려줄 수 있다. 이 기기는 MPC에서 routine하게 쓰이는 wash 및 다른 용액을 계속 흘려줄 수 있는 기능이 없다. well-volume이 적으면 안 좋은 점은 다음과 같다. Recoding site에 seal이 되어있지 않은 여분의 세포가 많으면 highly lipophilic compounds의 ‘lipid sinks’ 역할을 하게 된다[9]. 대표적인 약물이 terfenadine, astemizole이 있다. 이렇게 되면 약물의 free concentration이 낮아지기 때문에 실제 potency보다 안 좋은 결과가 도출되게 된다.

2.2 APC platforms - Second generation

 First generation APC에서 많은 점들이 보완되어 second generation APC가 등장하였다. 이 기기들의 특징은 표 2에 요약하였다.

표 2. Second generation APC 비교

IonWorks384는 IonWorks Barracuda로 업그레이드 되었다[10]. 이와 유사하게 Nanion의 syncroPatch 384 PatchEngine과 Sophion의 Qube는 micro-fluidic channel을 사용하여 적은 양으로 cell recording site에 빠르게 용액을 교환할 수 있게 되었다[11].

 Second generation APC platform은 높은 throughput(384 or 768)을 유지하였다. 또한 high-quality GΩ seal을 달성하였다. 384PE는 높은 농도의 칼슘 용액인 ‘seal enhancer’를 필요로 한다. 

놀랍게도 Qube와 384PE는 voltage clamp뿐 아니라 current clamp recording도 가능하다. 또한 향상된 throughput뿐 아니라 recording success rate 또한 많이 향상되었다. 그 결과 data point당 비용이 감소되는 결과를 가져왔다.

First generation APC는 data point당 비용이 €0.31-€1.50 였지만, second generation APC는 3~10배 정도 비용이 절약되어 €0.10-€0.15 이 되었다.

2.3 APC platforms - Advantages

 APC는 MPC와 비교할 때 놀라운 throughput을 자랑하는 장점이 있다. 하지만 속도 외에 MPC에서 할 수 없는 기능을 가지고 있다.

1) Internal cell solution perfusion

 Patchliner, SyncroPatch96, 384PE, Qube는 recording중에 internal cell solution을 교환할 수 있다. 예를 들어 K2P2.1 (TREK-1) channel은 intracellular pH에 의해 modulation되는데, 이것은 384PE에 의해 밝혀졌다[12]. 또 다른 예로 TRPC5 채널이 384PE를 이용하여 Ca2+ containing internal solution을 perfusion하여 activation되는 것을 밝혔다[13]. 비록 internal cell solution perfusion은 MPC에서 가능하나, 오직 한번밖에 되지 않는다는 단점이 있다.

2) Temperature control

거의 모든 APC 기기에 온도조절장치가 되어 있어서 원하는 온도로 채널을 activation 시킬수 있거나, physiological condition에서 recording을 진행할 수 있다. Patchliner platform을 이용한 TRPV1, TRPV3 연구가 효과적으로 수행되었다[14]. hERG 채널의 온도 영향성 연구도 수행되었다[15]. MPC에서도 온도조절은 가능하나 별도의 온도조절기기를 구매해야 한다. 

3) Fluidics

 Micro-fluidic channels (e.g. IonFlux, QPatch, SyncroPatch, PE384, Qube)나 적은 volume을 쓰는 IonWorks는 값비싼 시료(예를 들어 peptide toxin fractions)를 적게 사용하게 만드는 장점이 있다. Micro-fluidic channels는 빠른 external solution exchange rate (10~50ms)를 보여주어 빠르게 desensitizing되는 ligand-gated ion channels (e.g. nAChR α7 receptors, P2X receptor)를 기록하게 해준다. MPC에서 가능하지만 microinjection unit을 별도로 구매해야 한다.

4) Planar chips

 Planar recording chip의 개발은 MPC에 쓰이는 긴 glass electrode pipette의 mechanical noise를 감소시킨다. 그 결과 APC에서는 긴 시간(>30분)에서의 recording 성공 확률이 높다.

2.4 APC platforms를 활용한 industry의 신약개발 

 이온채널은 다양한 질환의 타겟으로 제약회사에서 약물을 개발하고 있다. 그 중 대표적으로 pain 분야에서 어떻게 APC가 활용되는지 살펴보고자 한다. 현재 제약회사뿐 아니라 전문 CRO (contract research organization)에서 APC service를 제공한다. 

Pain의 주요 타겟으로 voltage-gated sodium channels (Nav1.7-1.9)가 많은 관심을 받고 있다. 이 채널들에 대한 selective blocker를 찾기 위하여 수만에서 수십만에 이르는 화합물 라이브러리를 APC를 이용하여 스크리닝을 진행하였다.

Nav1.7의 경우, 미국의 한 회사에서 70만 개의 라이브러리에서 컴퓨터를 이용한 virtual screening을 이용하여 2만천 개의 화합물을 selection하였고, 이 화합물들을 IonWorks HT를 이용하여 스크리닝하여 selective한 blocker를 찾았다[16].

표 3. APC를 활용한 통증 신약개발의 예

 신약개발에 있어 APC는 이온채널 타겟 평가뿐 아니라 초기 독성평가에도 활용된다. 초기 hit 탐색시 심장독성을 알아보기 위하여 hERG 채널(Kv11.1) 저해능 평가가 이루어진다. APC를 활용하면 신속하게 hERG 저해능을 확인할 수 있다. 또한 hERG는 temperature-sensitive하기 때문에 MPC보다 APC가 더 적합할 수 있다[17]. 최근에는 심장독성평가의 새로운 패러다임으로 CiPA (Comprehensive in vitro Proarrhythmia Assay) 컨셉이 등장하였다. CiPA에는 심장독성에 관여하는 7개의 이온채널 평가 (hERG, Nav1.5(peak current), Nav1.5(late current), Cav1.2, Kir2.1, Kv4.3/KChip, KvLQT1/mink) 가 명시되어 있다. 앞으로 APC의 역할이 점점 커질 것으로 예상된다[18].

보통 APC를 이용하여 최대 수만 개 정도의 화합물을 스크리닝한다. 96well 혹은 384well plate 비용이 비싸기 때문에 수백만 개 화합물 라이브러리에는 사용할 수 없다. 그래서 일반적으로 fluorescence를 이용하여 primary screening을 진행하고 여기서 찾은 hit에 한하여 APC를 이용하여 second screening을 진행하게 된다. 마지막으로 MPC를 이용하여 검증하는 screening flow가 사용된다. 

3. 결론

APC technology의 발달은 이온채널 평가 data throughput은 획기적으로 증가시키고, technical한 기기 사용 능력은 감소시키는 결과를 가져왔다. 그래서 industry에서 이온채널을 타겟으로 한 신약개발이 활발해지게 만들었다

 패치 클램프는 굉장히 민감한 시험이다. 아무리 APC가 발달하여도 MPC의 시험 신뢰도를 따라 올 수 없다. APC와 MPC를 조화롭게 사용해야 신뢰성 있는 데이터를 얻을 수 있을 것이다.

4. 참고문헌

==> PDF 참조 

...................(계속)

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