바이오인

 방광 질환의 줄기세포

울산대학교 신동명, 신정현

[목차]

1. 서론

2. 요실금

3. 과민성 방광

4. 저활동성 방광

5. 간질성

6. 결론

[서론]

줄기세포 (Stem Cell)는 분화능력 (Differentiation), 자가재생능력 (Self-renewal) 등의 고유한 특성을 지니고 ‘미분화 세포’로 인체를 구성하는 다양한 조직으로 분화할 수 있는 세포이다. 줄기세포는 질병의 보존적 치료에서 근본적 치료를 가능하게 하는 재생의료 (regenerative medicine) 분야에서 가장 중요한 연구 분야로 주목 받고 있다. 줄기세포는 분화 가능성을 기준으로 인체를 구성하는 삼배엽의 모든 세포로 분화가 가능한 전분화능 줄기세포 (Pluripotent stem cell)과 특정 계통 범위 안의 세포로 분화 가능한 다분화능 줄기세포 (Multipotent stem cell)로 구분된다. 이 중 다양한 성체 조직에서 획득이 가능한 중간 배엽 줄기세포 (Mesenchymal stem cell; MSC)는 근 세포, 골 형성 세포, 지방 세포 등 중배엽의 다양한 세포로 분화할 수 있는 다분화능 줄기세포이다. MSC 줄기세포는 전분화능 줄기세포가 가지고 있는 암 유발성 가능성이 낮으며, 다른 성체 줄기세포와
비교하여 증식능이 우수하며 다양한 세포로의 다분화능을 가지고 있고, 성체 조직의 다수에서 채취가 가능하다.

MSC 줄기세포는 생체 이식을 통하여 손상 세포를 재생하고, 염증 반응 감소, 조직 섬유화 (tissue fibrosis) 예방, 혈관 생성과내재성 줄기세포 (Endogenous progenitor cell)을 활성화하는 등 다양한 치료 능력을 가지고 있으며, 유전자와 약물 전달에도 적합하다. 전세계 줄기세포를 이용한 세포치료의 대부분이 이들 MSC 세포가 활용되고 있으며, 국내의 경우 임상 시험을 거쳐 시판 허가를 받은 4종의 세포치료제 모두가 각 조직 특이적 MSC 줄기세포이다. 줄기세포의 치료 효능이 다양한 세포로 분화할 수 있는 능력 이외에 최근에는 이식된 줄기세포에서 분비된 사이토카인 (Cytokine)과 성장인자 (Growth factor)들의 파라크라인 효과 (Paracrine effect) 또한 중요한 유효적 치료 기전 (Mode of action)으로 연구되고 있으며, 실제 이식한 MSC 줄기세포는 염증과 허혈 등의 손상으로 활성화된 신호체계를 따라 손상 부위로 이동하여 국소, 전신의 염증 반응을 조절하고 손상 부위 조직을 재생하는 성장인자를 분비한다.

줄기세포를 이용한 치료는 골수이식, 자가면역질환, 척수손상, 심혈관계 질환 등 임상에서 활발하게 연구되고 있지만, 과민성 방광, 저활동성 방광 등의 방광 질환에서 줄기세포에 대한 연구는 실제 임상 환자보다는 다양한 전임상 동물 모델에 기반하고 있다. 방광질환은 만성적이고 퇴행성이며 신경학적인 원인이 작용하는 만큼 줄기세포 치료 연구에 적합한 질환이다. 본 기고문은 방광질환에서 줄기세포 치료에 대해 전반적으로 살펴보고자 한다.

[요실금]

요실금 (Urinary incontinence; UI)은 무의식적으로 요누출이 일어나는 증상으로 요누출이 발생하는상황에 따라 그 종류가 다양한데, 가장 흔한 것은 기침, 재채기, 운동 등 복압 상승으로 발생하는 복압성 요실금과 요절박과 연관된 절박성 요실금, 두 가지가 혼재된 혼합성 요실금이다. 복압성 요실금은 여성에서 흔하며 유병률은 나이와 연관이 있고 29에서 75%로 추정된다.

1998년 Lin 등이 암컷 쥐의 질분만을 이용한 첫 동물 요실금 모델을 만들었고 이후 신경 손상, 요도의 직접 손상, 골반 인대 손상 등 다양한 방법이 개발되었다. 크게 음부신경 손상, 요도를 지지하는 해부학적 구조물 (예: 인대) 등을 손상시키거나 요도를 직접 손상시키거나 다양한 기전을 혼합한 방법이 사용된다. 전임상 동물모델에서 자가유래 골격근 전구세포 주입 시 줄기세포가 근육 세포 계열로 분화하면서 요도 괄약근의 기능이 향상되거나 손상을 회복시키는 물질을 촉진하는 파라크라인 효과로 요실금 호전에 도움이 되는 것으로 확인되었다. 줄기세포는 국소주입이 정맥 주입보다는 그 효과가 더 좋았다.

임상시험으로는 2008년 Carr 등이 최초로 복압성 요실금이 있는 8명의 여성 환자에서 요도괄약근 내 자가 근육세포 유래 줄기세포를 주입 후, 5명 환자에서 증상의 호전, 1명의 환자는 완전히 요실금 증상이 소실됨을 확인하였으며, 이후 38명의 환자를 대상으로 시험을 확장하여 약 90% 환자에서 첫 줄기세포 주입 3개월 후 추가로 줄기세포를 주입한 경우 50% 이상 요실금이 호전됨을 확인하였다. 2014년 Gotoh 등은 근치적 전립선 절제술, 홀뮴 레이저를 이용한 전립선 수술 후 요실금이 발생한 남성 환자 11명의 요도 괄약근에 자가 지방유래 줄기세포를 주입 후, 1년 추적관찰에서 59.8%에서 요실금 양이 감소함을 확인하였다.

[과민성 방광]

과민성 방광 (Overactive bladder) 은 절박뇨가 있고 빈뇨, 야간뇨, 절박성 요실금이 흔하게 동반되는 만성 질환이다. 유병률은 약 20%로 고령일수록 높으며 행동치료부터 약물치료, 수술적 치료가 있는데 가장 흔하게 사용되는 약물치료의 경우 그 효과가 부족하거나 효과가 있더라도 지속적으로 약물 복용이 필요하거나 입마름과 안구 건조감, 변비등의 약제 부작용으로 인해 복용 지속률이 낮다. 과민성 방광의 원인은 다양한데, 일부 환자군에서 방광 출구 폐색(Bladder outlet obstruction; BOO)을 동반하는 경우가 있다.

동물에서 과민성 방광을 유발하는 방법에는 만성 허혈 (혈관 결찰 혹은 고지혈증), 척수 손상, 방광출구폐색, 초기 당뇨 등이 있는데 방광 출구 폐색 모델을 이용한 연구가 제일 많다. Woo 등은 마우스에서 방광 출구폐색 유발 3일 후 인간 제대혈 골수 유래 줄기세포를 정맥 주사하고 4주 뒤 치료 효능을 평가한 결과, 방광 출구 폐색모델은 대조군에 비해 방광근육의 비대, 콜라겐 축적되어 있었고 줄기세포 주입군은 대조군과 비슷한 정도로 평활근 비대와 섬유화가 덜 했다. 주입한 줄기세포는 방광에서만 발견되고 피부, 폐, 신장에서는 관찰되지 않았다.

본 연구팀은 6주령 암컷 백서에서 방광출구폐색을 유발, 4주 뒤 GFP 형광단백질로 표식한 지방 유래 인간 중간배엽줄기세포를 방광에 한 차례 주입하거나 정맥 주사로 현재 약물치료로 사용되는 항콜린제제인 solifenacin을 매일 2주간 주입하였고 2주, 4주 뒤 방광 기능과 조직을 평가하였다. 분자학적 기전을 관찰한 결과, 줄기세포 주입군에서 방광 신경세포가 10.34배 재생돼 신경체계 손상을 회복시켰으며, 배뇨근 비대를 완화시켜 과민성 방광 증상을 효과적으로 호전시켰다. 줄기세포 주입군은 solifenacin 주입군보다 더 방광 기능이 호전되었으나 줄기세포 생착은 확인되지 않았다. 유효적 치료 기전을 분석한 결과, 줄기세포가 직접 방광 세포로 분화하지 않고, 방광 주변의 다른 세포들에 영향을 미치는 파라크라인 효과로 줄기세포성 (stemness)과 줄기세포 생착/이동 (engraftment/mobilization) 관련 유전자들의 발현이 유의적으로 증가하였으며, 이로 인하여 줄기세포성 (SOX2와 OCT4) 인자를 발현하는 내재생 줄기세포 활성화와 손상된 방광 조직 내로 이동과 생착이 주요 기전임을 확인하였다.

또한 Lee 등은 백서 BOO 모델에서 인간 중간배엽유래 줄기세포가 콜라겐 축적을 억제할 수 있는지 살펴보았는데 줄기세포 주입군에서 TGF-β 발현이 줄어드는 것을 확인하였으며, 줄기세포가 방광의 섬유화를 억제하여 방광 기능을 회복시켰다고 결론 지었다. 백서와 마우스를 사용한 BOO 모델에서 줄기세포를 직접 방광에 주입하거나 정주로 주입한 연구에서 항상 과민성 방광이 유발되는 것은 아니다. Nishijima 등은 GFP 형광 단백질을 표식한 골수 유래 줄기세포를 방광에 직접 주입, 4주 후 대조군과 방광의 수축력을 비교하였고 줄기세포 주입군에서 수축력이 개선되고 줄기세포가 평활근과 유사한 세포로 분화했음을 확인했다.BOO 동물 모델에서 줄기세포치료 효과가 확인되었지만 폐색의 초기 단계에 줄기세포를 주입하여 치료효과를 확인했음을 감안할 때 방광 출구 폐색에서 줄기세포치료를 임상에 적용하기 위해서는 언제 치료를 할지, 주입한 줄기세포가 이미 변성된 방광을 회복시킬 수 있는지 고려해야 한다.

[저활동성 방광]

저활동성 방광 (Detrusor underactivity)은 방광의 수축력 감소로 방광을 비워내는 데 시간이 오래 걸리거나 정상 시간 안에 방광을 완전히 비우는 것을 하지 못하는 것으로[19] 노화, 신경학적 결손, 당뇨, 지속적인 방광 출구 폐색 등이 위험인자이다. 유병률은 50세 미만의 젊은 남성에서 9-28%, 70세 이상의 남성에서 약 48%, 여성에서 12-45%로 추정된다.[20] 정확한 병리학적 기전이 알려져 있지않지만. 구심성 혹은 원심성 신경 조절에 변화가 생긴 신경학적 원인 혹은 방광 평활근의 변성, 이온 저장/교환 장애의 근원성 기전 (Myogenic mechanism)이 제시된다.[21] 방광 출구 저항을 감소 시키거나 방광 수축력을 증대하는 약물을 투약하거나 유치 도뇨, 방광 절제 및 요로 전환 등이 시도되나 완치하는 치료방법은 없다. 저활동성 방광 모델은 streptozotocin 주입을 통한 당뇨 모델, 고령의 설치류를 사용한 노화모델, 방광 출구 폐색 모델, 골반 신경의 냉동 혹은 손상모델, 죽상경화증으로 인한 허혈 모델 등이 있다.[22]

Zhang 등은 8주령 암컷 백서에서 고지방 식이와 streptozotocin에 의해 유도된 제 2형 당뇨 모델에 지방 조직 유래 줄기세포를 꼬리 정맥 주사하고 4주 뒤 치료 효능을 평가한 결과, 당뇨 모델은 대조군에 비해 증가된 배뇨간격과 방광압력, 세포사멸을 보였고 줄기세포 주입군은 대조군과 비슷한 정도로 배뇨기능이 회복되었다. 지방 조직 유래 줄기세포의 이식은 당뇨 모델의 배뇨장애 기능을 완화시키고 세포사멸 억제 및 혈관 완전성의 촉진은 줄기세포 치료 후 가장 중요한 기능적 변화일 수 있다.[23]

또한 Jin 등은 4주령 암컷 백서에 streptozotocin을 복강 내 주사하여 당뇨 모델을 만들어 4주 후 저에너지 충격파 치료를 시행하였다. 저에너지 충격파 치료는 당뇨병으로 인해 손상된 방광기능을 회복하고, 혈관 신생 및 평활근 재생을 향상시킨다. 본 연구에서 제시한 결과는 저에너지 충격파에 의해 유발된 재생 과정에서 내인성 줄기세포의 활성화가 중요한 역할을 한다는 것이고, 이러한 효과는 내인성 줄기세포에서 혈관 내피 성장인자를 더 많이 분비하며 매개 면역 작용을 나타내며 방광 기능과 혈관 신생이 개선됨을 확인하였다.[24]

[간질성 방광염]

간질성방광염 (Interstitial cystitis; IC)은 감염이나 다른 원인이 없는 상태에서 지속되는 골반통과 빈뇨, 절박뇨, 야간뇨가 동반되는 만성 질환이다. 성기능 장애, 수면 장애, 우울, 불안, 만성 스트레스가 동반되며 환자들의 삶의 질을 떨어뜨린다. 간질성 방광염의 병태생리는 아직 명확하게 밝혀지지 않았고 근본적인 치료방법 또한 없는 실정이다. 유병률은 0.06%에서 3%로 다양하게 보고되며, 2011년 대한민국의 간질성 방광염 유병률은 약 0.26%로 추정되었지만 최근 그 환자수가 증가하는 추세이다. 생활습관 개선, 약물 치료, 방광내 약물 주입, 내시경 적 치료 등 다양한 치료 방법이 시도되고 있지만 환자들의 증상은 치료 후에도 지속되거나 재발한다. 이에 대해 간질성 방광염의 원인을 규명하고 치료법을 개발하기 위한 연구가 활발하게 진행되고 있으며 방광에 직접적인 화학적 손상을 주거나 생리적 스트레스를 주는 동물 모델들이 활용되고 있다.[25]

본 연구팀은 간질성방광염의 주요 병인 중 하나인 방광 내벽의 투과성 손상을 구현하기 위해 HCL 주입 유도 간질성방광염 질환 모델 (HCL-IC)-을 활용하여 인간 제대혈 줄기세포 (UCB-MSC)를 방광 내에 단회 투여하고 1주 일 뒤 방광 기능과 조직학적 검사 및 방광 조직의 유전자 발현을 평가하였다. HCL 유도 간질성방광염 타겟 인간 제대혈 줄기세포 치료법의 기전을 규명하기 위하여, 요로상피세포 재생에 관여하는 sonic hedgehog (SHH)와 WNT 유전자들과 관련 growth factors 성장인자의 발현을 평가한 결과, SHH-WNT-EGF, IGF, FGF 신호전달체계들이 HCL-IC 방광 조직에서 감소되어 있으며, 줄기세포를 이식한 방광에서 발현이 증가됨을 확인하였다. 따라서 WNT signaling의 활성화에 의한 요로상피세포 재생이 간질성방광염 타겟 줄기세포 치료법의 주요 유효적 치료 기전임을 확인하였다.[26]

하지만 UCB-MSC는 방광 내 줄기세포의 생착률과 직접분화가 저조하였다. 이를 극복하기 위해 인간 배아줄기세포 유래 다분화성 줄기세포 (hESC-MSC; MMSC)를 HCL-IC 동물 모델의 방광에 단회 투여하고 1주일 뒤 방광기능을 평가하였다. MMSC는 골수 유래 줄기세포에 비해 치료 효능이 10배 이상 높았고 치료 효과가 2주, 4주까지 장기간 지속되었다. 이전 연구에서 확인한 WNT signaling이 활성화 되었고 줄기세포가 직접 요로상피세포나 혈관내피세포 주변의 주피 세포 (Pericyte)로 분화, 방광 내 생착이 6개월 이상 관찰되었다. 즉, MMSC는 손상된 요로상피세포를 재생하고 성장인자를 분비하는 기질 세포와 주피 세포로 분화하여 혈관 재생 촉진을 통한 치료 효능을 보였다. 또한 MMSC 주입 12개월까지 영상추적 검사 및 부검을 통해 줄기세포가 방광 외 다른 장기로 이동하거나 종양을 유발하지 않음을 확인하였다. [27]

다양한 임상 표현형을 대변하는 간질성방광염 질환 모델을 개발하고자 세계 각 국에서 사회적 문제로 대두되고 있는 케타민 (ketamine) 오용으로 인한 방광염 (ketamine induced interstitial cystitis, KC)에 대한 질환 모델을 구축하였다. 25mg 케타민을 일주일에 두 번씩 3주간 정맥 주사하여 케타민 유도 방광염 환자에게서 나타나는 방광 기능 이상과 방광 요로 상피층의 염증 반응, 비만세포 침입, 세포사멸 등 KC가 유도하였고, MMSC를 방광 내에 단회 투여하여 1주일 뒤 방광기능과 조직학적 손상 (섬유화, 비만세포 생착, 염증)이 호전되는 것을 확인하였다. KC 질환 모델의 주된 치료 기전은 항섬유화 효과임을 확인하였다.[28-30]

HCl-IC 모델은 주요 병인 중 하나인 방광 내벽의 투과성 손상을 구현하여 임상학적 소견 재현을 확인하였지만, 단기간에 강한 화학적 화상으로 인한 급성기 모델이라는 한계점을 가지고 있다. 이를 극복하기 위하여, protamine sulfate (PS)와 lipopolysaccharied (LPS)를 장기간 투여하는 새로운 만성 모델 (LPS-IC)을 확립하였다. PS는 IC 환자의 중요 병인으로 받아들여지고 있는 방광 내벽의 glycosaminoglycan (GAG) layer 손상을 유도하기 위해 사용하였고, LPS는 박테리아의 내벽 인자로서 IC의 또 다른 중요 병인인 염증을 유발시키는 목적으로 사용하였다. 매주 1회 PS+LPS 투여를 5주 동안 실시하여, LPS-IC를 유발시킨 쥐의 방광 내벽에 MMSC를 투여하여 통계적으로 유의한 조직학적, 기능적 치료 효능을 확인하였다. LPS-IC 전임상 연구에서도 마찬가지로 성체줄기세포와 비교하였을 때 MMSC의 우수한 치료 효능과 생착률을 증명하는데, SHH-WNT 신호전달체계에 의한 EGF, IGF, FGF 등과 같은 성장인자가 활성화가 요로상피세포 재생과 이식한 줄기세포 생착률 조절에 중요한 기전이었다.

또한 이식된 줄기세포가 실제 쥐의 방광 내에서 어떻게 분화되는지 알아보기 위해 고해상도 생체 영상기법 (intravital imaging)을 새롭게 개발하였다. 이 영상기법을 통해 LPS 주입을 통하여 간질성 방광염을 유도한 쥐의 방광 내에 형광물질을 입힌 줄기세포를 주입한 후 세포를 다각도로 정밀하게 관찰할 수 있는 공초점현미경과 직접 제작한 직경 1mm의 소동물용 미세 방광내시경을 이용하여 간질성 방광염 모델에 따라 42일 동안 줄기세포를 관찰했다. 줄기세포 주입 후 방광 내벽에 혈관이 형성되고, 형광물질을 입힌 줄기세포가 살아있는 세포로 분화되어 점점 줄어들면서 42일째에는 형광물질이 모두 소멸된 것을 확인하였다. 즉 인간 배아줄기세포 유래 다분화능 줄기세포가 쥐의 방광에서 모두 살아있는 세포로 분화되었다는 것을 현미경과 소동물용 미세 방광내시경을 통해 직접 관찰하는 데 성공한 것이다. 이러한 생체 영상 기법을 활용하여, 줄기세포의 유효적 치료 기전 분석 기술과 함께 이식 후 생체 내 동태를 실시간으로 세포 수준의 고해상도로 모니터링할 수 있는 기술적 근간을 확립하였다.[31]

그림. 고해상도 생체 영상기술을 활용한 줄기세포 치료 모식도

결론적으로 본 연구팀은 다양한 모델을 활용한 전임상 연구에서 MMSC의 유의적인 치료 효능과 함께, 임상 연구를 진행하기 전, 줄기세포 치료를 위한 투여 세포 형태, 투여량, 빈도, 경로 등의 최적화 프로토콜을 확립하였으며, 장-단기 치료 효능과 치료 기전, 안전성을 규명하여 간질성 방광염에서 줄기세포가 임상에 진입할 근거를 마련하였다.

결론

다양한 방광질환에서 줄기세포의 치료효과를 확인하는 연구들이 활발하게 진행 중이다. 동물모델을 이용한 전임상 연구결과를 실제 질환이 있는 환자에 적용하고 해석하기 위해서는 상당히 조심스럽게 접근해야 할 것이다. 과민성 방광, 저활동성 방광, 간질성 방광염 등 다양한 방광 질환은 아직 그 병태생리가 완벽하게 밝혀지지 않았고, 행동치료, 약물치료, 수술적 치료 등 여러 치료법이 시도되고 있지만 해당 질환을 완치하는 확실한 치료법이 없다. 아직 방광 질환에서 줄기세포 치료는 임상 연구 및 실제 적용이 필요하지만 전임상 모델의 우수한 치료 효과를 고려하였을 때, 향후 그 역할이 기대된다.

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