Catalytic Antibocdy

유재훈/KIST 응용과학부

1. 서론

맞춤 양복과같은 촉매(Taylor-made Catalyst)

화학반응의촉매로쓸수있는물질의제조와그와관련된연구는최근화학의주요연구분야이다. 이는새로운촉매의 개발을통해보다효율적으로유기변환을수행할수있기때문이다. 지금까지개발된여러인공촉매들은탁월한효율성을가지고있지만, 입체적인이성질체(enantiomer) 를구별하고 선택적으로반응하는특이성이부족한경우가대부분이다.

그러나 이에반해, 자연촉매인효소는거울면이성질체를구별하여반응하는특이성을가지고있다. 또한이러한자 연효소를제어하는화합물도이성질체로서효소에접합해야하므로, 두개의거울면이성질체중에한개만이효능을발휘할수있다. 그러므로모든유기반응에서한거울면이성질체의순도 를높이기위한카이랄촉매(chiral catalyst) 를개발하는데많은관심과노력이집중되고있다. 특히라세믹혼합물(racemic mixture) 로시판되는기존의약품중 에서이성질체에의한독성이발견되어(Eichelbaum, 1995), 이러한문제들을해결할수있는카이랄촉매의개발이더욱필요하게되었다. 결국촉매연구의최종목표는자 연효소가기질을인식하여반응을일으키듯이, 선택적이며특이적인방법으로화학반응을일으킬수있는시스템을고안 하고만들어내는것이다.

생물학적관점에서도위와같은생체내화학변화를선택적이며특이적인방법으로촉진하는도구가필요하다. 생체 내의무수한분자들중특정한분자만을인식하고변화시키는도구는, 목표로하는단백질과같은고분자물질을손쉽게변형하거나분해할수있으므로그이용가치가높다. 암과같은질병을 포함하여잘못된단백질이많이생산되어발생하는질병들에서이런특이적도구를이용하여잘못된단백질만을선택적으 로제거할수있다면훨씬신속하고간단하게질병을치료할수있을것이다. 이방법은잘못된단백질의유전자를찾고조작하는유전자치료법보다간편하여광범위한치료제로서여러환자에게적 용할수있다. 이와마찬가지로세포간의접합을유도하는인자들, 질병발생의원인이되는여러가지독성인자들(virulence factors), 바이러스나박테리아의부착을유도하는표적 인자등을특이적으로인식하고그것을절단하는도구가있다면, 이들질병에대해서도획기적인원인치료효과를기대할수있다. 또한, 단백질의특정한아미노산서열, 또는DNA 나 RNA의특정한뉴클레오타이드서열을인식하고변화시킬수있는촉매를얻는것은질병의선택적치료뿐아니라, 생명현상을규명하는도구로서유효적절하게사용할수있으므로모든생명과학분야에획기적인발전을가져올수있 다.

자연계에존재하는라이브러리시스템중에 하나인면역계는 위에서필요로 하는인공촉매를 제조할수 있는좋 은 재료로서천문학적으로 큰다양성으로부터, 화학변환을촉진할 수있는 항체를골라 선택적인촉매로 사용해보려는 시도이다. 이런 촉매항체의출현은 약10 여년 전인1986 년에 이루어졌으며 10 년남짖한 시간동안 많은발전을 거듭하여왔다. 본총설에서는 그러나10 여년간의 역사를 자세하게 디루기보다는 최근2-3 년간 에 발표된생물학적 면역학적견지에서 촉매항체를다루려고 한다.

2. 연구개발 현황항체와 면역체계

척추동물면역계의산물인항체는새로운종류의촉매로서그가능성이심도있게탐구되고있다. 항체가이런목표에 적합한가장큰이유는항체의다양성때문이다. 항체의다양성은항원결합부위의두개의단백질인heavy, light chain 아미노산서열에의해결정된다. 이런아미노산을결정하는염기의서열은조각으로되어있는유전자의 조합적인배열에의하여정해지기때문에10⁸-10⁹ 정도의다양한아미노산배열을얻게된다(Leder 1982). 이런유전자배열에의한다양성외에도, 항원에노출 정도에따라접합력을증진하기위한체세포변이(somatic mutation) 가유발되어위의다양성에10-100 배이상의다양성이추가된다(Tonegawa, 1983). 이와같은다양성은 결국면역계가이세상에존재하는어떤분자에대해서도독특한항체를만들어다른분자와구별할수있다는뜻이다.더구 나항체는항원에대해서강력한접합력(K_d< 10^-6M) 을가질수있는특이성을가지고있으므로그특이성에있어서자연계에존재하는어떤시스템보다 도탁월성을가지고있다.

Pauling 교수는화학반응의전이상태이론을통해높은에너지상태를넘기위한활성화에너지의크기가화학반응의 속도를좌우한다고했다(Pauling, 1948). 또한자연효소는활성부위의배열이전이상태에잘상응하는구조를지니도록진화되었기때문에활성화에너지를낮추 어반응을촉진한다고했다. 항체는이에반하여기저상태의안정한분자에대해잘상응하는구조를갖도록진화되었기때 문에항원-항체간에는강력한접합력이있다고했다. 후세의유기화학자들은이런그의주장을긍정적으로평가하고, 목적이다른자연의두단백질(효소와항체) 을하나 로집약시키는시도를단행하였다. 즉, 유기화학기법을이용하여전이상태모방화합물을만들고이분자에대한항체를 제조하여자연효소와같은활성을가질수있는가능성을실험했으나제반여건의취약성으로쉽게성공을거두지못했다 (Jencks, 1966). 실제로, 촉매항체가처음으로소개된것은항체를대량으로만들수있는하이브리도마(hybridoma) 기술 (Kohler & Milstein, 1975) 과명백한전이상태와좋은전이상태모방화합물을합성하는기술을연합하여이루어졌다. Schultz 연구팀과 Lerner 연구팀은각각독립적으로의도하는반응인에스터가수분해를촉진하는포스포네이트형태의전이상태모방화 합물을합성하고이것에대한단일클론항체중에효소적성질을가진항체의제조를찾아내어, 에스터의가수분해반응을10000 배정도촉진시키는것을확인하였다. 그러나, Schultz 교수팀과Lerner 교수팀 은독립적으로에스터결합의분해반응의전이상태모방화합물로서결합손이네개인포스페이트를합성하여이에대한항 체를제조하였고, 마침내이항체가의도한화학반응을촉진시키는효소활성을가진것을최초로확인하였다(Tramontano et al.,1986; Pollack et al.,1986).

에스터가수분해항체가개발된이래펩타이드(Benkovic et al.,1990; Iverson & Lerner, 1989), 당(Yu et al.,1997; Janda et al. 1997) 포스포다이에스터결합(Scanlan et al.,1991; Rosenblum et al.,1995) 등자연가수분해효소의역할을하는촉매항체가보고되었으며, 에스터결합(Benkovic et al.,1988; Jacobsen et al.,1992) 과펩타이드결합의생성(Hirschmann et al.,1994; Jacobsen & Schultz, 1994) 을촉진하는결 과도보고된바있다. 생체내에서발견되는chrismate mutase 기능을가진촉매항체를개발해냈으며(Jackson et al.,1988; Hilvert et al.,1988), 특이적인산화-환원반응을촉진시키는촉매항체(Janjic & Tramotano, 1989; Cochran & Schultz, 1990; Keinan et al.,1990) 들도다수보고되었다. 이외에도일반적인산염기로반응을진행시킬수있는Elimination 반 응도촉매항체에(Shokat et al.,1994) 의해촉진된보고가있다.

10 여년간의연구결과중가장큰촉매항체의장점으로는자연효소의한계를촉매항체가극복한예이다. 자연효소로 서Diels-Alder 반응을촉진하는효소가존재하는지는아직밝혀지지않았지만, Lerner 교수팀이개발한Diels-Alder 촉매항체는4 가지의가능한입체이성질체중에한가지이성질체만을생성하 고있다. 특히이항체는열역학적으로가장어려운반응의전이상태를모방하는구조를항원으로제조하였으므로, 가장일어나기힘든반응을가장일어나기쉬운반응으로전환시킨셈이다(Gouverneur et al.,1993). 또한열역학적 으로유리한5 각환을만들기보다는열역학적으로만들어지기어려운6 각환의제조를촉진하는촉매항체도, 6 각환을만드는반응의전이상태모방분자에대한항체를제조함으로서얻어질 수있었다(Janda et al.,1993). 이외에도50-60 여종의어려운유기반응을촉진시키는항체가선진연구진에의하여얻어졌다. (Shokat & Schultz, 1991; Lerner et al.,1991; Schultz & Lerner, 1993, 1995).

90년대중반이후의촉매항체연구의가장큰변화로는기존에나와있거나새롭게발견된촉매항체의기작과인식에관 한분자인식차원에서의연구를들수있다. 이와같은연구는결국일반효소의작용기작에관한고찰을가능하게하므로자 연계의효소반응의보다정밀한모방과그응용을가능하게할수있다. 특히항체의단백질구조는일반적성격을가지고있으므로쉽게촉매작용기작을세밀하게연구할수있기때문이다. 실 예로에스터결합의분해를촉진시키는촉매항체의구조연구를통해, serine 계열단백질분해효소가일반적으로가지고있는triad (Ser-His-Asp) 구조와유사한dyad (Ser-His) 가에 스터결합의분해에직접관여하는작용기임이밝혀진바있다(Zhou et al.,1994; Guo et al.,1994). 촉매항체결정구조의효용성은Schultz 교수팀의항체에서그진가가다시한번 나타났다(Patten et al.,1996). 이논문은진화전의항체(germline) 와면역반응을진행하여효소활성을가지게된항체와의구조의 비교에서, germline 항체가항원에대한면역반응을통하여효소항체로진화되었음을보여주고있다. 자연효소가수억년에걸쳐돌연변이 와다아윈식선택에의하여효소기능을가진것과같이단2 개월의면역기간을통한효소기능의진화를촉매항체의제조과 정에서관찰할수있는셈이다(Wedemayer et al.,1997). 따라서촉매항체의구조연구는자연효소의기작을이해할수있을뿐아니라그기작형성의진화과정을 알수있는유일하고효과적인수단이다.

Schultz 와 Lerner 의초기 촉매항체의성공을 지켜본많은 과학자들은이제 화학적반응을 특이적으로변환시 키는 요술방망이를얻은 것처럼생각했으며, 가까운장래에 효소기능을능가하는 촉매항체의존재를 볼수 있을것으로 기대했었다. 그러나 10 여년이지난 지금까지도자연효소의 효소활성을능가하는 촉매항체를만들어 내지못하고 있으며, 대부분의 촉매항체들은자연효소의 활성에비할 수없는 낮은활성을 가지고있다. 또한촉매항체의 연구결과를단순히 속도의증가분 (k_cat/k_uncat) 의크기에 의해서만측정하며, 항체들이진정한 multiple turnover 를갖는지, 산물에의한 효소활성이저해되는지에 대한자료에는 미흡함이없지 않다. 촉매항체의 효소활성은 과연 한계가있는 것일까? 촉매항체가 아직자연효소에 필적하는기능을 가지고있지 못한주요 원인은, 촉진하고자 하는화학반응을 완전히이해하지 못하여전이상태 에 대한지식의 부족에서원인을 찾을수도 있다. 전이상태의 지식의부족은 그전이상태를 모방하는데심각한 오류를범할 수있기 때문이다. 비록 그전이상태 가 잘알려졌다 하더라도, 전이상태는 가상적인상태이므로 이것의완전 모방이란불가능하므로 자연효소와같은 촉매항체는영원히 불가능할수도 있으리라는우려의 목소 리도있다. 그러나, 좀더 정밀한전이상태의 파악과불완전한 전이상태모방을 개선하여더욱 유사한전이상태 모방화합물을만드는 노력들은많은 유기화학자들에의하여 수 행되고있다.

효소반응의 새로운열역학적 고찰

촉매항체의제조와연구에서쓰는고전(?) 적인방법, 즉의도하는화학반응의좋은전이상태모방화합물을합성하 고그에대한단일클론항체를제조하는법이외에새로운전략이90 연대중반에많이소개되어, 진정한인공촉매로서촉매항체가자리메김할수있는가능성을열고있다. 효소반응의열 역학적고찰은Pauling 교수가제안한전이상태이론에서찾을수있다(Pauling, 1946). 모든반응물은생성물로가기위해에너지가높은산을넘어반응이진행된다. 자연효소는전이상태의상응구 조에잘배열되도록진화되어왔으므로전이상태를낮출수있어서반응이빠르게진행된다.

이와같은1 세대의촉매항체는주로전이상태의에너지만을낮추는기법을이용하였다.그러나, 활성화에너지를작 게하는데는, 반응물과항체의결합을불안정하게하여반응물의에너지를높여도성취될수있다. 최근의Fujii 교수는반응물과의접합력이감소된항체를선택하여반응물의에너지를높임으로서높은효소적성질을 나타낸다는연구결과를발표하여항체와기질과의접합력의세기를조절하는것이차세대의촉매항체를만들기위한중요 한인자임을입증하였다(Fujii et al.,1998). 자연적으로발생된자가촉매항체(auto-catalytic antibody) 의큰특징으로강한기질특이성을들 수있다(Paul, 1996). 비슷한맥락으로항체의항원결합부위의아미노산서열을변화시켜기질과의접합정도를감소시켜서활성화 에너지를줄이는방법도연구된바있다(Sun et al.,1997).

대부분의자연효소가 기질특이성을 가지고있으므로 성공적인차세대 촉매항체의제조를 위해서는기질의 구 조를고려해야 한다. 최근 본연구자는 당결합을 분해하는촉매항체를 위한항원의 설계에서기질의 특이성의고려가 효소활성에큰 영향을끼치고 있음을파악하 였다. 즉, 항원은 전이상태를낮추는 구조뿐만아니라 기질과유사한 구조를도입하여 항체를제조한 결과, 우수한 기질특이성과 (K_m = 20 microM) 우 수한활성을 가진촉매항체를 얻어냈다(Yu et al., 1998). 또한 다수촉매항체들의 구조-효소활성과의 상관관계연구는, 전이상태모방 정 도에따라 그효소활성 값이정해진다는 전이상태이론 (Stewart & Benkovic, 1995) 에 적지않은 예외가있음을 확인했다(Ulrich & Schultz, 1998). 이러한실험결과는 차세대촉매항체의 제조를위해 오직전이상태 모방화합물을 항원으로사용하고 있 는단순한 전략에서탈피하여 기질의특이성과 기질과항체와의 접합안정성에 기인하는여러 인자를항원의 설계에서고려해야만 한다.

면역계의 다양성을나타낼 수있는 새로운면역방법들

기존의면역법으로는얻을수있는다양한항체의레퍼토리가제한되어있을가능성이있다. 촉매항체가원래의항체 의기능과는판이하게다른기능을수행하고있으므로, 정상적인면역체계에서는이런기능을가진효소의발현을억제하 는기능을가질수도있기때문이다. 따라서면역시스템이가진방대한다양성을적절히표출시키는여러가지새로운면역법들이등장하였다. 첫번째로시 험관적면역법(in vitroimmunization) 으로(Sthal et al.,1995, Suckling et al.,1993), 독성이강하거나화학적으로불안정한항원의면역법에필요 하며항원을운반단백질에연결하지않고면역반응하는장점이있다. 두번째의방법으로는자가면역질환에잘걸리는SJL/J 와같은생쥐strain 을이용한면역법이다(Tawfik et al.,1995). 이방법으로얻은항체중에는효소활성이높은항체가다수존재하는것으로보고되었으며, 정상적인면역체계에의한면역법에의해촉매항체가제거될수있다는가능성을간법적으로입증하고있다. 이결과들 은자가면역환자들에게서DNA 또는단백질을분해하는자연적인촉매항체가다수발견되는연구결과와연관지을수있을 것이다(Paul et al.,1989; Shuster, 1992). 또다른면역법으로최근Lerner 교수팀에의해서실행되고있는활성면역법 (reactive immunization) 을들수있다. (Wagner et al.,1995; Wirsching et al.,1995). 활성면역법은불안정한기질을직접면역시킴으 로서전이상태의모양을직접기질이연출하여, 그에대한항체가생성되어반응을촉진시킨다는이론적배경을가지고있다. 이방법에의한촉매항체의형성은쉽게설 명할수없지만, 좋은효소활성과넓은기질특이성을가진촉매항체를제조하였다(Barbas et al.,1997). 아마도이면역법에의한항체는somatic mutation 등이수반된affinity maturation 에의해서제 조되었다기보다는, 기질에특이하게반응을할수있는작용기를항원결합부위에가지고있는항체들을, affinity labelling 방법으로 선택해낸결과로사려된다. 자연효소의모방을위한촉매항체의제조법으로자연효소에대한anti-idiotype 항체를제조하여효소의기능을직접항체에부여할수있는방법도모색되었다(Izadyar et al.,1993).

위의여러가지면역법들은그나름대로의장점을가지고있어서상용화되어있는생체면역법과병행하여사용하면두 개이상의항원을인식할수있는면역시스템을구축할수있다. 이런관점에서보면, Massamune 교수가시도한바있는다항원면역법(heterologous immunization) 이주목된다 (Suga et al.,1994). 이방법은한가지의분자로완전한모방이어려운전이상태의특징을구조가다른두전이상태모방화합물 로제조하여번갈아생쥐에주사하는면역법이다. 이면역법에서는결국구조가다른두화합물을동시에인식할수있는항체의제조가가능하다는고무적인결과를보여주 고있다. Tachibana 등은(1993) 두개의항원을각각상용적생체면역을실시한후동시에암세포와의융합을통하여다 중특이성항체의제조했다.

최근의촉매항체 연구의기법 중에기존의 활성을가지고 있는1 세대의 촉매항체에새로운 작용기를도입하여 그효소적 기능을향상시키는 연구가활발하다. 1 세대촉매항체의 구조적성질이 결정구조등에 의하여결정되면, 활성부위에 존재하는작용기를 알아낼수 있 다. 이런 작용기의기능을 향상시키거나보존하기 위하여새로운 작용기나조효소의 도입, 항원 결합부위에 부가적인활성반응기를 도입하여효소활성을 갖도록 하는 연구의예가 있다(Shokat et al.,1989).

Benkovic 등은 항체의활성을 증가시키기위해 금속이온의 자리를만들기 위한분자생물학적 돌연변이를시도 했으나 그효소활성의 증가는미미했다 (Stweart & Benkovic, 1988). 또한 활성분자를항체의 일부에직접 연결하여항원 결합부위 근처에위치시킴으로 서 효소활성을증가시키는 방법도시도되었으나 효소활성의극적인 증가는없는 것으로알려졌다 (Pollack & Schultz, 1989; Shokat et al., 1994). 그 러나이런 선행연구는진정한 전이상태의모방을 위한적극적인 모색이었기보다는, 소극적인 돌연변이에의한 항원접합 부위의 몇개의 아미노산을교환하여 효소활성의증가를 꾀하고있다. 효소활성을높일 수있는 항체의구조변화는 활성부위의몇 개의아미노산의 교환에의해서 일어날 수도 있지만, 항체 전체의포괄적인 아미노산의교환에 의해서나타날 가능성이더욱 크다(Joyce, 1996). 최근에 분자생물학에 도입된새로운 돌연변이방법인 DNA suhffling 법은이런 목적에알맞는 방법으로인정되고 있다. 특히 인공촉매의재료를 생물재료를사용함으로서 제2 제 3 세대의촉 매를 생물학적도구에 의하여손 쉽게얻어 낼수 있으며, 따라서 증진된효소활성을 가질수 있는가능성을 증대시킬수 있는장점을 지닌시스템이라 할 수 있다.

3. 전략 및 목표

우리나라의 바람직한 연구개발 방향과 연구개발에 대한 전략적 제언

21 세기초에완성될인간게놈과제(human genome project) 에의하여새로운수용체또는효소들이등장할것이 며, 이들을목표로한치료제개발에많은연구가진행될것이다. 지금까지의치료제는주로수용체나, 효소에반응하는기질들에선택적으로접합할수있는물질들이그주류를이루고 있다. 그러나, 기존치료제의가장큰단점은치료효과의극대화를위해서목표수용체나효소의양과같은양이상을투입 하여야하는점이다. 최근에개발된항암제중엔지오스터틴등이혈관의생성을억제하는좋은항암치료제로개발되었다. 또한70 연대항 암제의선두치료제였던인터루킨등이개발되었으나, 모두다량의치료제를사용하여야만그약효가나타나는것으로보 고되고있다. 더구나필요이상의치료제를사용했을때의부작용, 많은약을생산할수있는시스템등이해결되어있지않은현시점에 서새로운개념의치료제는시대적인요구이다. 그러므로촉매작용이있는인공효소를치료제로사용할수있다면, 소량의촉매만가지고도충분한치료효과를나타낼수가있을것이며, 결과적으로다량의치료제를사용하여파생되는 문제점들을원초적으로제거할수있다. 이러한관점에서본다면본연구에서목표로하는촉매항체나라이보자임은수용 체또는효소를인식할뿐만아니라그것의일부를변화시킬수있는이중기능을가지고있기때문에소량으로치료효과를나 타낼수있는전혀새로운개념의치료물질을개발하는결과를가져올수있다. 이런장점은치료제의과다투여에의한부작용을없앨수있으며, 치료제의다량생산시스템구축에드는비용도줄일수 있다. 유용한작용을하는촉매항체의유전자를직접몸안에주입하는유전자치료법(gene therapy) 의형태로도임상에적용할수있을것이다.

촉매항체의또하나의응용은생체밖에서찾을수있다. 어떤단백질보다도그안정도가강한항체는유기화학실험실 에서쓰이는반응물에넣어주어특이적으로반응을촉진시키는인공적인촉매로서산업으로의응용이가능하다. 항체가반응에관련이되면, 항체의거울면이성질체를구분할수있는능력으로인하여하나의거울면이성질체를다른 것으로부터구분이쉬워지게된다. 따라서여러반응에의하여완성되는합성과정이라도한번만, 도중에또는마지막 반응으로항체가촉진하는반응을수행하면라세믹화합물이아닌한개의거울면이성질체가얻어 질수있다. 1997 년말Lerner 교수팀에의하여생성된항체가aldol condensation 을촉진시키는최초의상용화되는촉매항체로기록되었다(Barbas et al., 1997). 본연구의결과제 2, 제3의촉매항체가출현하게되면, 많은종류의화학반응에서이들이응용될것이고, 보다정밀한화학반응의조절이가능해질것으로보여진다. 또한이 들인공효소의개발이성공적으로완성이된다면, 그동안전혀생각해보지못한화학반응에대한선택적인촉매들이만들 어지게되는것이고, 이러한결과는전혀새로운정밀유기화학공업의탄생을촉진하는결과가될것이다.

촉매항체라함은결국유기화학적으로합성된유기재료를매우큰다양성을가진생물학적라이브러리인면역체계로 부터, 가장좋은접합력또는가장좋은활성을지닌하나의분자(항체)를선택해내는과정에의해제조된것이다. 또한자연촉매를수동적으로이용하는연구와는차원을달리하여, 유기반응을특이적으로촉진하는인공효소를생물 학적인도구와방법을이용하여직접만들고그효소활성을생물학적인방법으로개량하려는능동적인시도이다. 특히, 유기화학적인도구로사용되는촉매를그것과는그원칙을달리하는생물학의도구를사용하여진화에의한촉매 의질을향상시키는노력은, 최근학문간의격차가없어지고다원칙학문이주류를이룰21 세기를선도할다학제간학문의백미로꼽힐수있다. 결국촉매항체는이론유기화학으로부터전이상태의모양을파악 하고그유사체를합성할수있는유기합성적인배경과, 면역학, 효소학, 분자생물학, 단백질생화학등생물학전반에결친여러배경을총체적으로다루는생물학과화학간의다원칙 학문으로서종합적인성격을띤프로젝트에의하여추진되는것이바람직하며, 연구Unit 에의한활발한연구가진행될수있는성격이매우크다.

선택적으로반응을 촉진시킬 수있는 효소항체의개발은 이제까지의 항체에대한 강력한접합을 하는중화 분 자로서의일반적 개념을탈피하고, 화학반응을일으키기 위한인위적 재료로서자연에 존재하는생체 재료를이용하려는 새로운시도이다. 1986 년최초의 촉매항체가보 고된 이후, 새로운 촉매항체를만들고 개량하는시도는 이제까지많은 연구결과를도출했다. 그러나, 촉매항체의 제조를위해 관련된많은 학문의발전에 의하여촉매 항체의 개발속도는매우 빨라질것으로 생각된다. 마치 선진국의경제적으로 풍족한연구 Unit 에의해서만 개발될수 있는과제라는 일반적인식을 탈피하여, 다 학제간 학문에관심이 있는젊은 생각을가진 화학자생물학자의 많은분발이 있을것으로기대한다.

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