정봉현 박사 / 생명공학연구소 생물분리공정 R.U.장

1. 서 론

모든 단백질은 각자 독자적인 3차원 구조를 갖고 있다. 이러한 독특한 단백질의 구조적인 특성을 단백 질 정제에 효과적으로 이용할 수 있을까? 본 질문에 대한 대답은 이미 자연계에 존재한다. 즉, 면역 시스템은 단백질을 구성하고 있는 아미노산의 공간적 배열의 차이점을 이용, 특정 단백질을 선택적으로 인식할 수 있는 항체라는 분자인식 파트너를 제공하며 이것은 최고의 선택도 (selectivity)를 갖는 크로마토그래피 리간드로 이용될 수 있다. 이것이 분자인식을 이용한 단백질의 대표적인 분리정제법이라 할 수 있으며, 이와 유사한 분자인식 시스템을 화학 합성에 의해 인공적으로 만들려고 하는 시도가 “molecular imprinting”이다.

이미 언급한대로 단백질 분자인식의 가장 대표적인 예로는 항원-항체 상호작용을 들 수 있다. 면역 시 스템은 항원에 공격을 받았을 때 항원 분자를 선택적으로 인식하여 결합할 수 있는 항체를 만든다. 이러한 항원-항체 결합은 현재까지 인위적으 로 설계된 어떠한 시스템보다도 성능면에서 월등히 우수한 전형적인 분자인식 시스템이라 할 수 있다. 항원-항체 사이에는 소수성 (hydrophobic), 이 온(ionic), Van der Waals, steric repulsive, 수소 결합 등 다양한 화학 및 물리적인 상호작용들이 존재하며, 그 결합력 은 10⁷­10¹² 결합상수를 가질 정도로 매우 높다(1). 생체내에서 만들어지는 항체는 항원과 마찬가지로 3차구조를 갖 고 있는 단백질로써 in vitro에서 합성은 거의 불가능하다. 최근 유전공학의 발달로 다양한 항원에 선택적 결합성을 지닌 모노크로날 항체 가 유전자 재조합 기술에 의해 대량으로 생산되고 있지만, 현재까지의 기술 수준으로는 생산 경비가 매우 높아 진단시약 및 실험실 규모에서의 소 규모 분리정제에 사용되고 있는 형편이다. 단백질 정제에 항체를 리간드로 사용하는 면역 친화성 (immuno-affinity) 크로마토그래피의 경우 선택성 이 매우 높은 가장 효과적인 단백질 정제방법이나, 앞에서 언급한 항체의 가격 문제 뿐만 아니라 매우 낮은 loading capacity, 극한 의 용출 조건 등의 문제점들 때문에 상업적 사용이 제한되고 있다(2). 항원/항체 분자인식 시스템 외에도 생물계에는 receptor/effector, 효소/효소저해제(inhibitor)와 같이 이미 완벽하게 디자인된 분자 인식 시스템이 존재하며 in vivo에서 생리적으로 매우 중요한 역할을 한다. 따라서 이러한 생물학적인 분자 인식계에 근접하는 성능을 갖는 새로운 분자 인식 시스템을 인공적으로 제조하여 생리활 성물질의 정제, 인공 생촉매 및 바이오 센서 등에 이용하려는 연구가 활발히 이루어지고 있다.

인공적으로 단백질에 대한 분자인식 시스템을 제조하는 방법은 host-guest 화학합성을 이용한 molecular imprinting에 의해 목적 단백질을 선택적으로 인식하여 결합할 수 있는 imprinted 고분자를 제조하는 것이다. 이렇게 제조된 인공 항체는 단백질 분리정제 뿐만 아니라 진단 시약 등으로도 유용하게 사용될 수 있다. 화학 합성으로 제조된 인공 항체는 단백질 항 체에 비하여 변성이 되지 않으며 대량으로 값싸게 제조할 수 있다는 장점 때문에 현재 선진국에서는 활발한 연구가 진행되고 있으나, 현재의 기술 수준은 단백질 항체에 비하여 선택도 면에서 매우 성능이 떨어지는 host 분자를 제조하는 수준에 머무르고 있다. 그러나 본 기술이 성공적으 로 개발되어 실용화될 경우 생명공학 분야에 큰 변혁을 갖고 올 것이다. 본 글에서는 단백질 분자인식을 위한 molecular imprinting 시스템에 관하여 주로 언급할 것이며, 특히 molecular imprinting에 관련된 다양한 분야 중에서도 단백질 분리정제 분야에 초점을 맞추 어 논할 것이다.

2. 본 론

가. Bio-molecular imprinting

Bio-molecular imprinting은 인공 항체, receptor, 효소를 가교화된 합성 고분자 형태로 제조하고자 하 는 첨단 기술이다(3-6). 이것은 print 분자(항원에 해당하는 단백질 등)와 가교제, 모노머를 혼합하여 고분자 반 응을 수행한 후 print molecule을 선택적으로 인식할 수 있는 구조를 갖는 고분자 물질을 제조하는 것이다 (Figure 1). 이렇게 만들어진 host 분자는 반복적으로 guest 분자(혹은 print molecule)와 결합하였다가 분리될 수 있으므로 단백질 분리정제에 매 우 유용하게 사용될 수 있다. 일반적으로 생체분자를 포함한 모든 물질에 본 기술이 적용될 수 있으며 광범위하게 molecular imprinting이라고하며 단백질, 생물 고분자 등에 적용할 경우 bio-molecular imprinting 또는 bio-imprinting이라고 한다.

Figure 1. Molecular imprinting. Template(or Print) molecules(T) bind polymerizable molecules with appropriate functional groups to form a template-binding group complex. Addition of an excess of crosslinker results in copolymerization of the complex 'monomer' with the cross linker. Removal of the template yields an imprinted polymer containing micro-cavities with specifically oriented functional-binding groups. The imprinted polymer is thus able to rebind the template molecule with high selectivity

Molecular imprinting 시스템을 제조하는 방법은 크게 공유결합 (covalent bonding)을 이용하는 방법 과 비공유결합 (noncovalent bonding)을 이용하는 방법이 있다. 전자의 방법은 print 분자와 모노머의 가역적인 공유결 합에 의해 imprinted 분자를 제조하는 것으로써 미국 UC Irvine의 Shea 연구팀과 독일 Dusseldorf 대학의 Wulff 연구팀에서 주 로 연구하고 있으며, 후자는 모노머와 print 분자사이의 이온, 수소, 소수성 결합 등의 비공유 결합을 이용한 것으로 써 스웨덴 Lund 대학의 Mosbach 연구팀에서 활발히 연구하고 있다. 최근 Caltech 화공과의 F. H. Arnold 연구팀에서는 금속 이온과 단백 질 표면의 금속이온 결합그룹 (Cu(II) 이온과 histidine 등)과의 상호작용을 이용한 금속 친화성 molecular imprinting 시스템을 개발 하여 단백질 분리정제 및 센서 등에 응용하려는 시도를 하고 있다.

이렇게 제조된 imprinted 고분자 물질은 print 분자를 선택적으로 인식할 수 있는 “induced molecular memory” 부위를 갖고 있으며, 이러한 특성에 의해 imprinted 고분자는 tailor-made 분리정제를 위한 담체, 반응 성 있는 촉매 및 효소 모방체(enzyme mimics), 바이오센서의 성능을 갖는 센서 등으로 생체 분자들을 효과적으로 대체할 수 있다.

나. Imprinting 방법

현재까지 보고된 molecular imprinting 방법들은 주로 앞에서 언급한 것과 같이 host-guest 고분자 반 응을 이용하는 것이 대부분이나 본 글에서는 기존의 방법들과 더불어 가능성이 있는 새로운 imprinting 방법들도 소개하 고자 한다. 또한 단백질을 분자인식할 수 있는 imprinted 고분자 제조에 적용할 때의 문제점 또는 장점 등에 대하여 기술할 것이다.

Copolymerization

본 방법은 molecular imprinting 시스템을 구축하는 가장 직접적인 방법으로써 주로 작은 분자들에 적 용되어 왔다(7-10). Print 분자, print 분자와 친화성 모노머, 스페이서 모노머를 혼합하여 고분자 반응을 수행한 후 합성된 고분자로부터 print 분자를 용출하여 imprinted 고분자를 제조한다(Figure 2). 본 방법의 가장 큰 장점은 제조 scheme이 간단하다는 것이다. 고난도의 화학 반응을 필요로하지 않으며, 반응 시스템을 최적화하는데 있어서 최소한의 시간과 경비로 많은 trial and error 실험을 수행할 수 있다는 장점을 갖고 있다. 현재까지 작은 분자의 경우 많은 연구 결과들이 보고된 바 있다(11, 12). 그러나 분자량이 큰 단백질의 경우 작은 분자들에 비해 확산 속도가 작기 때문에 가교화된 고분자 내로 이동하는 속도가 율속 단계 (rate limiting step)가 될 수 있다. 또한, 친화성 모노머가 print 단백질과 정량적으로 결합하지 않을 경우 무질서한 결합 부위 들이 고분자내에 생겨 분자인식 성능을 저하시킬 수 있다.

Figure 2. Copolymerization imprinting

고체 담체 상에서 copolymerization

본 방법은 copolymerization 방법과 매우 유사하다. 우선 고체 담체 표면에 고분자 시스템과 가교 반응 을 할 수 있는 표면 처리를 한 후, 표면에 template 분자를 포함하는 용액을 접촉시킨다. 그 후 고분자 반응이 담체 표면에 서 천천히 진행되는 동안 모노머를 서서히 첨가하여 담체 표면이 imprinted 고분자로 코팅되도록 한다. 반응 후 담체로부터 print 분자를 용출시킨다(Figure 3).

Figure 3. Surface copolymerization imprinting

담체 표면에 template 결합 부위가 존재하므로 template 분자와 빠른 속도로 쉽게 결합할 수 있으며, 제조시 친화성 모노머의 첨가 속도를 조절할 수 있어 무질서한 결합 부위를 최소화할 수 있다는 장점을 갖는다. 그러나 이 방법 은 결합 부위가 표면에만 존재하므로 용량 (capacity)이 낮아 표면적을 높여야하는 문제점을 지니고 있다.

Postpolymerization crosslinking

본 방법은 친화성 결합 부위를 포함하고 있는 가교화가 안된 copolymer 용액을 이용하는 방법이다. 본 용액에 print 분자인 단백질과 가교제를 첨가한 후, 가교화를 한다. 합성된 고분자 물질로부터 print 분자를 용출하므로써 완 성되며, 전에 언급한 고체 담체 상에서의 copolymerization 방법과 함께 사용될 수 있다(Figure 4).

Figure 4. Postpolymerization crosslinking

본 방법의 장점은 template 단백질이 고농도의 모노머 용액과 혼합되는 것을 피할 수 있다는 것이다. 여기서 사용되는 고분자 용액들은 단백질을 안정화 시키는 역할을 할 수도 있다(13). 그러나 이미 고정된 결합 부위를 이용하므로 적은 수 의 결합 부위를 갖게 된다는 단점을 갖는다.

친화성 결합 부위의 공유결합에 의한 표면 templating

본 방법은 근본적으로 postpolymerization crosslinking 방법과 매우 유사하며 작은 분자에 주로 적용 되어 왔다. 고분자 표면에 고농도의 반응 부위들이 배치되도록 한 후, 이러한 반응 부위들과 반응을 할 수 있는 functional group들을 표면에 갖고 있는 print 분자인 단백질을 고분자와 접촉시킨다. 접촉 후 단백질(print molecule)을 제거하면 단 백질과 선택적으로 결합할 수 있는 결합 부위만 남게된다(Figure 5).

Figure 5. Surface imprinting I

이 방법은 주로 작은 분자의 molecular imprinting에 사용되며 지금까지의 방법들에 비해 가장 견고한 template 결합 부위를 갖는다. 견고성(rigidity)은 template 결합에 있어서 결합상수에 중요한 영향을 미친다. 그러나 3 차원 구조의 분자를 2차원 표면상에 imprint해야 하는 구조적인 단점을 갖는다.

리간드 결합 부위 제거를 통한 표면 templating

이 방법은 바로 전에 기술한 molecular imprinting 방법의 역이라 할 수 있다. 전 방법과 마찬가지로 고분자 표면을 고농도의 리간드 결합 부위로 치환한 다음 단백질을 첨가하여 서서히 고분자 표면의 리간드와 결합시킨다. 단백질 과 결합하지 않은 리간드를 적절한 용매를 선택하여 제거한 후 단백질을 제거하여 imprinted 고분자를 완성한다(Figure 6). 이 방법은 지금까지 제 시된 어느 방법보다도 이상적이나 단백질과 결합한 리간드와 결합하지 않은 리간드를 선택하여 제거할 수 있는 방법의 어려움으 로 인하여 실현되고 있지 못한 형편이다.

Figure 6. Surface imprinting II

금속 친화성(metal affinity)을 이용한 molecular imprinting

기존의 금속 친화성을 이용한 단백질 정제 방법은 항원 항체 친화성을 이용한 면역 친화성 크로마토그 래피 방법에 비해 선택도(selectivity)가 낮아 고순도 단백질 정제를 위해서는 기타 분리 정제 방법들이 추가로 필요하다. 이러한 단점을 해결하 기 위해 단백질 표면에 histidine과 같이 금속 친화성이 있는 functional group을 포함하고 있는 단백질을 선택적으로 분자 인식할 수 있는 리간드를 제조하여 목적 단백질만 선택적으로 결합할 수 있는 금속 친화성을 이용한 molcular imprinting 방법이 제시되었다 (14). 이 방법의 원리는 표면에 금속 친화성 group을 갖고 있는 단백질과 금속이온을 포함하는 모노머를 혼합, host/guest 고분 자 반응에 의해 목적 단백질을 선택적으로 인식할 수 있는 금속이온 부위를 포함하는 고분자 물질을 제조한 후 이를 단백질 분리에 반복 적으로 이용하는 것이다(Figure 7).

Figure 7. Metal-affinity molecular imprinting

다. Imprinting 시스템의 분리정제에 응용

Molecular imprinting 시스템이 가장 널리 사용되어온 분야는 키랄 화합물의 분리정제 분야이다. 현재 판매되고 있는 광학 활성 의약품 중에서 90%는 라세믹 혼합물 형태이나, 미국 FDA는 혼합물 상태가 아닌 분리된 각 물질의 효 능과 활성만을 인정하여 의약품으로 허가하는 정책을 결정한 바 있다. 따라서, 키랄 화합물의 분리는 대부분의 원료 의약품 제조회사들이 지 니고 있는 당면 과제이며 생산성 있는 분리 방법 개발을 위하여 많은 노력을 경주하고 있다. 혁신적인 키랄 화합물 분리정제를 위한 해결 방법 중의 하나가 molecular imprinting이며 현재 실용화에 연결될 수 있는 기술 수준에 근접해 있다.

또다른 응용 분야는 지금까지 주로 언급하였던 항체 모방체(antibody mimics)를 이용한 단백질의 분리 정제이다. 그러나 당단백질인 transferrin을 imprints를 이용하여 분리한 보고(15) 이후, 단백질이나 이와 유사한 거대 생체 분자의 molecular imprinting을 이용한 분리정제 기술의 진보는 거의 없는 실정이다. 단백질 유사체인 작은 분자의 molecular imprinting을 이용한 분리정제 연구결과들은 계속 보고되고 있으므로 머지 않아 molecular imprinting이 단백질의 분리 정제에 광범위하게 응용될 것으로 예상된다.

라. Molecular imprinting의 응용분야

Molecular imprinting은 분리정제 이외에도 다양한 분야에 응용이 가능하다. Molecular imprinting 기 술이 생명공학에서 응용될 수 있는 분야들을 요약하면 다음과 같다.

­생리활성물질 상호작용에 관한 연구

­친화성을 이용한 생리활성물질 분리정제 ­immunoassay type 진단시약

­인공 생체 촉매

­초고감도 biosensor-like devices

3. 결 론

항원/항체, receptor/effector, 효소/inhibitor 등과 같은 생물 분자인식 시스템과 유사한 시스템을 인 위적으로 제조하는 방법은 host/guest 고분자화 반응을 이용하여 molecular imprinting 시스템을 만드는 것이다. 특정 단백 질을 선택적으로 인식하여 결합할 수 있는 imprinted 분자는 인공 항체에 해당하며 단백질 분리정제, 생물전환, 바이오 센 서 분야 등에 다양하게 이용될 수 있다. 단백질을 인식할 수 있는 molecular imprinting 시스템에 있어서는 선택도(selectivity)가 높 은 인공 항체를 만드는 기술이 가장 핵심이라 할 수 있다. 현재 단백질을 print 분자로한 imprinted 고분자의 제조 및 응 용 기술은 초기 단계에 머무르고 있다. 그러나 본 기술이 실용화 될 경우 생물분리정제는 물론 바이오 센서, 생물 전환 등의 생 명공학 분야에 새로운 혁명이 예상된다.

참 고 문 헌

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8. Ekberg, B., K. Mosbach (1989) Trends in Biotechnol., 7, 92

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10. Norrlow, O., M. O. Mansson, K. Mosbach (1987) J. Chromatogr., 396, 374

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14. Dahl, P. K., F. H. Arnold (1992) Macromolecules, 25, 7051

15. Glad. M. et al. (1985) J. Chromatogr., 347, 11