포유동물은 외부환경의 변화를 인식하고 반응하기 위해 진화학적으로 잘 보존된 기전인 다섯 가지의 특징적인 MAP Kinase signaling cascades가 알려져 있다. 이들은 세포의 성장을 유도하는 ERK1/2 cascade와 스트레스에 대항하여 활성화되는 JNK/p38 MAP kinas cascade 그리고 잘 알려지지 않은 ERK3 와 ERK5 cascade등을 포함한다.

세포의 성장을 유도하는 ERK1/2 cascade는 이들 중에서 매우 잘 연구되어 있는 것으로, 세포 성장과 분화 세포의 전이 등에 핵심적 역할을 한다고 알려져 있다. 이런 역할 외에도 이것은 세포의 이동 분비 및 기억 등에도 관여한다고 한다.

스트레스에 의해 활성화되는 kinase로 JNK 와 p38 cascade가 있다. 이들은 외부의 스트레스성 자극, inflammatory cytokines, heat shock, high osmolarity, ceraminde, LPS 그리고 TGF-beta등에 의해서 활성화된다고 보고되고 있다. 스트레스에 의해 활성화되는 kinase로 JNK 와 p38에 의해서 일어나는 세포의 반응은 세포에 따라 그 자극물질에 따라 다르다고 한다. ERK3 와 ERK5 cascades는 최근에 연구되기 시작했으며 가장 덜 규명된 분야이다.

이런 신호전달과정과는 또 다른 신호전달계인 Phosphothidylinositol-Akt protein kinase signal pathway도 활발하게 연구되고 있는 신호전달계이다. 이것은 매우 잘 연구되어 있는 ERK1/2 cascade의 기능처럼 세포성장과 분화 그리고 세포의 생존 등에 핵심적 역할을 한다고 알려져 있다.

이 신호전달계의 major effector인 Akt protein kinase는 직접적인 인산화를 통한 핵 내 tranional factors나 다른 신호전달계 protein kinase 등 세포질 내 여러 단백질의 activation/inactivation이 유발한다. Akt protein kinase는 세포성장과 증식에 관여하는 단백질은 인산화를 통해 activation시키고, 반대로 세포사멸에 관여하는 것들은 인산화를 통해 inactivation 시키는 경향이 있다. 그리하여 Akt protein kinase는 세포의 생존과 증식을 조절하는 것으로 추정된다.

Akt protein kinase substrate protein은 거의 RxRxxS/TX(x는 아무 amino acid; X는 hydrophobic amino acid) motif를 가지고 있는 것으로 보고되고 있는데, 충북대학교 과학교육학과 강상순 교수는 Akt protein kinase 자체 내에 스스로 인산화를 유발하는 곳(64teRpRpnTFi73)이 발견되어 이곳의 인산화가 Akt protein kinase activity 변화에 미치는 영향을 규명해 Akt protein kinase활성 조절 기전을 연구하고자 한다.

또한 RxRxxS/TX motif를 가진 규명되지 않은 후보 Akt protein kinase 기질 단백질들의 Akt protein kinase에 의한 인산화 여부와 이로 인한 이 단백질의 어떤 기능(효소의 활성 혹은 세포내 단백질 위치 등)의 변화를 연구하고자 연구 목표를 정하고 연구를 수행하고 있다.


난치병 원인 규명·치료에 도움될 듯

강 교수는 대두에 있는 여러 isoflavnoids 중 사람의 피부암세포의 생장 억제하는 성분을 스크린하면서 그 효능 여부를 조사하는 과정에 Akt protein kinase의 연관성이 나왔고, 그래서 Akt protein kinase에 관심을 가지고 연구하게 되었다고 한다.

세포생존을 위한 신호전달과정에서 Akt protein kinase가 중요한 역할을 한다는 사실이 밝혀진 이후, 그 활성화 조절 기작에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 단순히 하나의 발암유전자로 발견된 Akt protein kinase는 그 유전자의 염기서열과 단백질 서열이의 분석으로 그 기능과 역할에 대해 새로운 조명을 받게 되었다.

세포는 자신의 생존과 사멸을 외부환경의 신호와 정보를 종합하여 내재하고 있는 생존 혹은 사멸 기작 어느 한쪽을 선택함으로써 결정한다. 이 내재된 운명 판단을 위한 정보 수용 및 그 각각의 작동 기작이 잘못되어 각종 난치병(암 혹은 치매)의 원인이 된다고 추정된다. 세포사멸과 생존은 서로 표리의 관계로, 한쪽의 선택은 다른 한쪽의 억제를 동반하는 것이다. 최근 세포사멸 기작에 대한연구가 활발히 진행되어 중요한 발견들이 보고되고 있다고 한다.

상대적으로 세포생존에 대한 그 기작 연구는 낙후되어 있고 아주 최근에 관심이 고조되고 있습니다. 역설적으로 이 분야에 대한 연구가 세계적인 경쟁력을 가질 수 있다는 표현도 되는 거죠. 이처럼 국내에서도 자생력이 있고 세계적으로 경쟁성을 유지하는 연구 분야에 지원이 이뤄지면서 생리적 분화에 관한 조절 기구의 해명으로 학문적 우위를 확보할 수 있을 뿐 아니라 산업적으로 유용한 물질을 창출하는 데도 기여할 수 있을 것이라고 강 교수는 말한다.

지금까지 신호전달계 연구, 기질 단백질 규명, 단백질-단백질 상호작용 등에 대한 연구는 Yeast Two Hybrid System을 이용하거나 초파리 등 실험동물의 mutant를 규명하면서 그 단서를 얻고 각 신호전달 과정을 규명해 왔다. 이런 연구방식은 결과를 얻는 데 시간과 노력 그리고 연구비가 많이 들어가는 단점을 가지고 있다. 이에 강 교수는 이런 연구방식 대신 consensus motif 정보를 이용해 데이터베이스에서 컴퓨터로 candidate protein을 찾아내고 실험적으로 이를 규명해 왔다.

그 예로 (RxRxxS/TX) motif를 가진 단백질이 Akt protein kinase 기질 단백질이라는 정보를 이용하여 데이터베이스(Medline)에서 이런 sequence가 있는 많은 후보 단백질들을 찾아냈다. 이 중에서 telomerase catalytic domain이나 Rac1, ASK1가 Akt protein kinase에 의해 인산화됨을 규명하여 JBC에 발표했다.

Akt protein kinase 기질에 대한 Consensus motif정보를 이용하여 기질 후보 단백질을 데이터베이스에서 찾아내고, 실험적으로 이 단백질의 인산화 여부와 이로 인한 생체 내 이 단백질의 기능변화를 규명해 그 생물학적인 의의(세포생존 및 사멸과의 연관성)를 찾고 있다고 한다. 강 교수는 신호전달계를 연구하는 중에 방사선을 사용하는 전통적인 protein kinase assay 단점을 극복한 Non-Radioactive Akt Protein Kinase Assay를 자체 개발하여 그 결과를 JBC 등에 게재했다.

이 Non-Radioactive Protein Kinase Assay 방법은 ①방사선을 사용하지 않으므로 안전하고 ②쉽고 간편하고 ③값이 저렴하고 ④한 번에 수백 개 이상 다수의 시료를 한번에 측정할 수 있고 ⑤재현성이 우수하고 ⑥부분적으로 정제한 효소나 정제하지 않은 세포 파쇄액을 사용하여도 동위원소를 이용한 kinase 활성 측정법에 비해 noise나 background가 거의 없고 ⑦주어진 protein kinase에 대한 specific assay가 가능한 장점들을 갖고 있다.

이와 같이 강 교수는 대상 단백질들에서 short amino acid consensus motif를 찿고 Akt protein kinase에 이어 ILK/PDK1 기질특이성(Table1)도 규명하여 에이케이티 키나제/엠이케에케이쓰리/아이엘케이/피디케이1 각각에 대한 단백질 인산화효소 활성 측정용 형광표지 펩티드 및 이를 이용한 비방사성 위 각각의 단백질 인산화효소 활성 측정법 에 대한 4개의 특허들을 출원했다. 이 방법으로 인산화된, 형광표지된 consensus motif의 펩타이드 정량은 gel 사진을 이용한 일반적인 densitome try를 이용하거나, gel에서 인산화된 band를 elusion하여 spectrofluorometry로 측정할 수도 있다.


연구에 대한 열정으로 어려움 극복

이공계 기피 현상 속에서 그리고 지방국립대학, 그것도 사범대학 교수로 이런 연구를 한다는 것이 얼마나 어렵고 힘든 일인지.... 항상 이 triple deep을 과연 극복하고 연구를 제대로 수행할지 불안한 마음으로 걱정을 하면서 연구를 수행하고 있습니다.

다행히 전 직장에서 함께 연구한 연구원과 이곳 청주를 사랑하여 현재 우리 실험실에 있는 학생과 연구원들이 있기에 서로 연구에 대한 열정으로 여러 가지 어려움들을 극복하려고 노력하는 중이라고 강 교수는 말한다.