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1. 서론

모든 생물에서 유전자의 발현은 전사인자에 의해 조절된다. 전사인자 가운데는 특정한 유전자의 발현을 촉진시키는 역할을 하는 전사 활성인자도 있고 반대로 특정한 유전자의 발현을 억제시키는 역할을 하는 전사 억제인자도 있다. 만일 특정 유전자의 발현을 선택적으로 조절할 수 있는 전사인자를 인위적으로 제작할 수 있다면 이것은 의·약학분야뿐만 아니라 미생물관련 생명공학분야에서도 그 적용 가능성이 매우 크다고 할 수 있을 것이다. 이 글에서는 맞춤형 전사인자의 개념과 이를 이용한 유전자 조절 방법, 그리고 미생물분야에의 응용 가능성을 소개하고자 한다.

2. 맞춤 전사인자

대부분의 전사인자들은 보통 DNA에 결합하는 부분과 functional domain부분으로 구성되어 있으며 두 부분이 조립식으로 작용하는 특징을 가지고 있다. DNA에 결합하는 부분을 주어진 임의의 염기서열에 결합할 수 있도록 변경시킬 수 있다면 이에 적절한 functional domain을 연결함으로써 특정 유전자의 발현을 선택적으로 조절할 수 있는 맞춤 전사인자의 개발이 가능할 것이다.

Zinc finger 단백질은 맞춤 전사인자를 개발하는데 있어 가장 적절한 DNA 결합 모티브로 인식되고 있다. Zinc finger 단백질은 zinc 이온에 의해서 그 구조가 안정화되는 단백질을 통칭하는 것으로써 동물, 식물, fungi등 진핵생물에서 광범위하게 발견되고 있으며 일부 원핵생물에서도 발견된다. Zinc finger 단백질의 생체내 주요 기능은 특정 염기서열과 결합하여 전사인자로 작용하는 것이다. Zinc finger를 포함한 단백질이 zinc finger 부분의 작용으로 특정 염기서열에 결합하면 그 단백질의 다른 부분은 functional domain으로 작용하여 표적유전자의 전사를 조절하는 기능을 나타내게 된다.

Zinc finger 단백질이 맞춤전사인자의 가장 적절한 DNA결합모티브로 생각되는 이유는 첫째 그 구조의 조립성(modularity)에 있다. (그림 1)은 3개의 finger로 구성된 Zif268 zinc finger 단백질이 DNA와 결합하고 있는 X-ray 결정구조이다 (Pavletich and Pabo, 1991).

그림 1. Zif268-DNA complex의 X-ray 결정구조 (Pavletich & Pabo. 1991). 3개의 zinc finger unit 으로 구성된 Zif268단백질이 염기서열 5'-GCG TGG GCG-3'과 결합하고 있는 모습. 원형 반점은 zinc ion의 위치를 나타냄.

이 그림은 각각의 finger들이 서로 독립적으로 DNA의 3bp와 상호 작용함으로써 9bp의 특정염기서열(5'-GCG TGG GCG-3')을 인식하는 것을 뚜렷하게 보여주고 있다. 한 개의 zinc finger unit이 3bp의 염기서열을 인지하기 때문에 G, A, T, C의 3bp 조합을 인식할 수 있는 64개의 서로 다른 zinc finger unit들을 확보하면 주어진 어떤 9bp 이상의 염기서열에 대해서도 그것에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질을 조립하는 것이 가능하다.

Zinc finger가 맞춤전사인자의 가장 적절한 소재가 될 수 있는 두 번째 이유는 자연계에 존재하는 zinc finger 단백질이 인지하는 염기서열이 매우 다양하다는 것이다. Zinc finger단백질들 가운데에는 CF2-II나 Hunchback처럼 AT-rich sequence에 결합하는 것들도 있고 SP1이나 Zif268처럼 GC-rich sequence에 결합하는 것들도 있다. 이러한 사실은 zinc finger 단백질의 유전자 염기 서열 인식 특이성을 인위적으로 조절함으로써 다양한 염기서열에 결합할 수 있는 맞춤형 DNA 결합모티브를 제작할 수 있다는 전망을 가능하게 한다.

이러한 점에 착안하여 Johns Hopkins의 J. Berg 그룹과 Zif268의 구조를 규명한 Pabo 그룹은 각각 site-directed mutagenesis 방법과 phage display 방법을 통해 Zinc finger 단백질의 DNA 결합특이성을 변화시켰다 (Desjarlais & Berg, 1992; Rebar & Pabo, 1994). 그러나 이 방법들은 기술적 숙련과 많은 시간을 필요로 할 뿐만 아니라 zinc finger 단백질이 in vitro에서 제작된 이유로 인하여 생체내에서 활성이 낮을 가능성이 있다. 이러한 단점을 극복하기 위한 시도로 세포내에서 원하는 특이성을 보이는 zinc finger 단백질을 선택하는 방법이 고안되었다. Pabo 그룹은 대장균에서의 ion system을 개발하였고 (Joung et al. 2000) North Carolina의 Juliano 그룹과 본사의 연구진은 각각 독립적으로 효모의 one-hybrid system을 변형한 새로운 ion system을 개발하였다 (Bartsevich & Juliano, 2000). 이들 방법은 기존의 방법에 비해 소요되는 시간과 노력이 훨씬 적을 뿐만 아니라, 특히 진핵생물인 효모를 이용하여 만들어진 zinc finger 단백질은 in vitro에서 만들어진 것보다 생체내에서의 활성도가 훨씬 높다는 것이 본사의 선행실험에서 입증되었다.

3. 맞춤전사인자를 이용한 인위적 유전자 조절

위와 같이 다양한 방법으로 제작된 zinc finger 단백질들은 연결시키는 functional 도메인의 종류에 따라 전사활성인자 또는 전사억제인자로 이용할 수 있다. 즉 효모에서는 zinc finger 단백질을 Gal4 AD, VP16 AD와 같은 활성화도메인에 연결하여 전사활성화인자를 제작할 수 있다 (그림 2A). 또한 Sin3, Ume6와 같은 억제 도메인에 연결시키면 효과적인 전사억제인자를 만들 수 있다 (그림 2B). 또한 zinc finger 단백질은 활성화도메인이나 억제도메인 없이도 결합하는 장소에 따라 그 자체로 전사 억제인자가 되기도 한다. 그림 2C에 나타낸 바와 같이 zinc finger 단백질이 TATA box와 전사개시점 부위에 결합하면 일반 전사인자들의 결합을 방해하여 유전자의 발현을 99%까지 강력히 억제한다.

맞춤형으로 제작된 zinc finger 단백질을 이용하여 유전자의 발현을 조절할 수 있다는 것은 다수의 유전자에 대해 입증되었다 (Kang & Kim, 2000; Kim & Pabo, 1997; Liu et al. 2001; Beerli, et al. 2000).

A. 전사활성인자 (ZFP-GAL4)

B. 전사억제인자 (ZFP-UME6)

C. 전사억제인자 (ZFP)

그림-2. Zinc finger 전사인자의 다양한 작용기작.

4. 맞춤전사인자를 이용한 미생물 형질개량

최근 공개되고 있는 게놈정보에 따르면 많은 미생물에도 zinc finger 단백질을 지정하는 유전자들이 존재한다. 효모의 경우 42개의 유전자가 zinc finger 도메인을 가지고 있다. 실제로 효모에서 인공적으로 제작한 zinc finger 단백질을 발현시켜 리포터 유전자를 활성화시키는 방법으로 스크리닝하는 in vivo ion system은 zinc finger 단백질이 효모내에서 전사인자로 작용할 수 있음을 입증한다. 또한 zinc finger 도메인을 가지고 있는 유전자가 전혀 없는 대장균에서도 효모에서와 유사한 방법으로 zinc finger 단백질을 스크리닝할 수 있다는 사실은 zinc finger 도메인을 지정하는 유전자의 존재유무에 상관없이 zinc finger 단백질이 대부분의 미생물에서도 보편적으로 작용할 수 있음을 시사한다.

산업적으로 중요한 미생물의 유전자발현을 조절함으로써 고부가가치의 유전자 재조합 미생물을 제조하고자 할 경우 맞춤형 전사인자 기술은 유전자의 발현을 정량적으로 조절할 수 있다는 측면에서 그 유용성이 매우 크다. 본 연구진의 선행 연구결과에 의하면 어떤 전사인자를 활용하느냐에 따라 특정한 유전자의 발현을 50%에서 99%까지 억제할 수 있으며 또한 basal level에 비해 2배에서 100배까지 유전자의 발현을 증가시킬 수 있다. 그러므로 전사인자를 이용한 기술은 기존의 유전자 과량발현이나 제거방법에 비해 훨씬 다양한 표현형을 확보할 수 있을 뿐만 아니라, 형질개량에 이용할 수 있는 표적 유전자의 범위도 더욱 넓혀 줄 것이다.

5. 맺음말

맞춤형 전사인자를 이용한 유전자 조절기술은 이미 생명공학산업의 주요한 수단으로 주목받고 있다. Zinc finger 기술에 기반을 두고 있는 회사로는 미국의 Sangamo Biosciences와 한국의 Toolgen 2개의 회사가 있다. 현재 zinc finger를 이용하여 제작된 전사인자들은 신약 개발 및 유전자 치료와 관련하여 활발한 연구가 진행중이며, 또한 그 응용범위가 동물, 식물, 미생물로 점차 넓혀져 가고 있다. 맞춤형으로 제작된 전사인자를 산업적으로 중요한 미생물에 도입하여 유용 형질을 개량하는 방법은 미생물 생명공학 분야에서도 고부가가치의 2차 대사산물 생산수율을 높일 수 있?주요한 수단으로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

6. 참고문헌

Bartsevich, V. V. and Juliano, R. L. (2000) Regulation of the MDR1 gene by tranional repressors ed using peptide combinatorial libraries. Mol. Pharmacol. 58:1-10

Beerli, R. R. Dreier, B. and Barbas, C. F. 3rd (2000) Positive and negative regulation of endogenous genes by designed tranion factors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:1495-1500

Desjarlais, J. R. and Berg, J. M. (1992) Redesigning the DNA-binding specificity of a zinc finger protein: A data base-guided approach. Proteins Struct. Funct. Genet. 12: 101-104

Joung, J. K., Ramm, E. I. and Pabo, C. O. (2000) A bacterial two-hybrid ion system for studying protein-DNA and protein-protein interactions. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:7382-7387

Kang, J. S. and Kim, J.-S. (2000) Zinc finger proteins as designer tranion factors.

J. Biol. Chem. 275:8742-8748

Kim, J.-S. and Pabo, C. O. (1997) Tranional repression by zinc finger peptides: exploring the potential for applications in gene therapy. J. Biol. Chem. 272:29795-29800

Liu, P. Q., Reber, E. J., Zhang, L. et al. (2001) Regulation of an endogenous locus using a panel of designed zinc finger proteins targeted to accessible chromatin regions. ACTIVATION OF VASCULAR ENDOTHELIAL GROWTH FACTOR A. J Biol Chem. 276:11323-11334

Pavletich, N. P. and Pabo, C. O. (1991) Zinc-finger-DNA recognition: crystal structure of a Zif268-DNA complex at 2.1 Å. Science 252:809-817

Rebar, E. J. and Pabo, C. O. (1994) Zinc finger phage: affinity ion of fingers with new DNA-binding specificities. Science 263:671-673