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과학기술부(장관 蔡永福) '21세기프론티어사업'의 지원을 받은 '작물유전체기능연구사업단(단장 崔良燾)'의 포항공대 안진흥(安鎭興) 교수팀은 벼 유전자의 기능을 대량으로 분석할 수 있는 DNA 풀 방법을 세계 최초로 구축하였다.

병충해나 가뭄, 추위 등에 잘 견디게 하는 신품종을 만들거나 맛 좋고 영양가가 높은 쌀을 생산하기 위해서 는 이를 조절하는 유전자를 우선 확보하고 연구해야 한다. 그런데 최근에 중국, 미국, 일본 등 연구팀에서 벼의 유전체 염기서열을 거의 대부분 밝혔다고 보도되었다. 이에 의하면 벼에는 3만 2천 내지 5만 5천 정도 의 유전자가 있는 것으로 추정되는데, 이들 중 기능이 밝혀진 것은 수백 개 정도밖에 안된다. 이에 따라 벼 유전자 기능 연구에 대한 치열한 경쟁이 시작되었다.

국내에서는 작물유전체기능연구사업단을 중심으로 여러 연구실에서 벼 유전자 기능연구를 활발하게 진행하 고 있는데, 특히 포항공대 안진흥 교수 연구실에서는 벼 유전자 기능을 대량으로 분석할 수 있는 자원을 개 발하여 매년 10,000개 유전자의 기능을 연구할 수 있는 DNA 풀 방법을 벼에서는 세계 최초로 개발해 내었다.

DNA 풀 방법은 유전자의 기능을 밝히는데 중요하게 이용할 돌연변이체를 신속히 선발하는데 사용하는 기술 로 다른 식물이나 동물에서 유전자 기능을 분석하는데 이용되고 있으나 벼에서는 아직까지 개발되지 않아 벼 유전자 연구를 하는데 어려움이 많았다.

안 교수팀은 유전자 이식 방법을 사용하여 벼의 유전체에 무작위로 인위적인 표지를 삽입하여 대단위로 돌 연변이체를 생산하였다. 이를 50개 단위로 묶어서 DNA를 추출하여 400개의 풀을 얻었다. 이어서 평균 10개 의 풀을 섞어 40개의 DNA 슈퍼 풀을 만들었다. 따라서 각 슈퍼 풀은 평균 500라인의 sample로 구성되었다.

 이 DNA 풀을 대상으로 특정 유전자에 표지가 삽입된 돌연변이체가 존재하는 풀을 PCR 기법으로 탐색할 수 있다. 그런 다음에 50개 돌연변이체를 대상으로 해당 돌연변이체를 추적하면 특정 유전자의 기능이 상실 된 돌연변이체를 확인할 수 있고 그 특성을 분석하면 그 특정 유전자의 기능을 알 수 있다.

이 자료는 계속해서 그 규모를 늘려갈 예정이며 국내외 타 연구자에게도 보급하여 벼 유전자 연구에 활력 을 일으킬 것으로 전망된다. 이미 국내 6개 실험실과 외국 2개 실험실에게 DNA 풀을 배포하여 유용성을 검 정 받은 바 있다. 벼는 옥수수, 밀 등 타 주곡과 유전자 구성이 비슷하여 벼에서 연구된 주요 유전자들은 타 작물에도 활용될 수 있을 것으로 추정된다. 한편 애기장대의 경우에는 세계적으로 유수한 기관에서 이러 한 DNA 풀을 생산하고 이 방법을 널리 활용하여 그 유용성이 검정된 상태이나 벼의 경우는 이번 연구 결과가 처음으로 기록된다.

[단어 해석]

PCR 기법 : 중합효소연쇄반응(PCR; polymerase chain reaction)기법은 유전자증폭기법을 말하며 이 발명 으로 지난93년 미국의 캐리 B 멀리스 박사가 노벨 화학상을 수상했다.

자료 문의 : 안진흥 교수

포항시 효자동 포항공과대학교 생명과학과

전화 054-279-2176 011-9850-2176

팩스 054-279-2199

작물유전체 기능연구사업단

전화 031-290-2649

팩스 031-292-9757

cfgc@plaza.snu.ac.kr

역유전 방법에 의한 벼 유용 유전자 대량 분석(MADS 유전자를 중심으로)

포항공대 분자생명과학부 안 진흥(genean@postech.ac.kr)

벼의 염기서열 분석이 완료됨으로써 유전자 기능 연구에 많은 관심이 집중되고 있다. 본 연구실에서는 유전 자 기능 분석을 용이하게 하기 위한 인프라 구축을 위해 T-DNA를 이용한 삽입 돌연변이체 (insertional mutant) 집단을 만들어 왔다. 지난해 21C 프론티어 사업이 시작되면서 이 라인들의 효과적인 활용을 위해 역유전 (reverse genetics) 방법에 의한 유전자 knockout 변이 색출 기반을 구축하고 있다. 삽입 돌연변이 체 집단의 DNA 풀 제작 및 이의 활용을 아래에 간략히 소개하고자 한다.

1. DNA 풀 제작

T-DNA 삽입변이 집단을 구축하는데 사용한 품종은 동진벼이며 이식 유전자를 담은 벡터는 pGA2144이다 (그림 1).

각각의 형질전환체는 포장에서 키워서 종자를 채취하였으며 이를 라인이라고 명명하였다. 각 라인에는 평 균 1.4 의 T-DNA가 삽입된 것으로 밝혀졌다. 삽입 돌연변이체를 평균 50 라인 씩 묶어서 하나의 풀로 정의하였다. DNA를 추출하기 위한 샘플확보를 위해 각 풀에 속한 라인 당 5 립의 종자를 모아 총 250 개체 를 2주 온실에서 키운 후 잎으로부터 DNA를 추출하였다. 지난 해에는 19,535 라인에서 367 개의 DNA 풀을 제작하였으며 평균 10 개의 풀을 섞어 39 개의 DNA 수퍼 풀을 만들었다. 따라서 각 수퍼 풀은 평균 500 라 인의 sample로 구성되었다.  

2. PCR을 이용한 역 유전 방법 구축

DNA 수퍼 풀로부터 knockout 돌연변이체를 얻기 위한 PCR 조건을 알아보았다. 이를 위해 이미 T-DNA가 들어 간 위치를 알고 있는 돌연변이체(라인0-307-15)가 포함된 풀 및 수퍼 풀을 대상으로 template의 양, annealing 온도, 및 기타 PCR 조건을 테스트해 보았다. 표 1은 우리 연구실에서 사용하는 PCR 조건 및 primer 서열이다. 문헌에는 hot 가 자주 쓰이나 본 연구실에서는 hot 와 cold 사이에 큰 차이를 발견하지 못하였으며 hot 가 번거로움이 많아 cold 를 택했다. DNA 수퍼 풀 크기는 1500 까지 가능하였으나 T-DNA 삽입 위치가 먼 경우 PCR 효율이 떨어질 것으로 예상되어 500으로 잡았다.

3. 벼의 MADS 유전자 knockout 돌연변이체 선발

본 연구실에서 수년간 연구해 꽃 및 기타 여러 기관의 분화 발달에 중요한 역할을 하는 MADS box 유전자 군 을 연구하고 있다. 벼에는 대략 70개 정도의 MADS box 유전자들이 있는데 N-terminal 쪽의 56 아미노산으 로 구성된 MADS box 부위가 잘 보존되어 있다. DNA 풀의 유용성 여부를 검증하기 위해 MADS box 유전자 군 중 AGL2/AGL6 family를 대상으로 T-DNA 삽입변이체를 색출 연구를 수행하였다 (그림 2).

가. primer 제작 및 테스트

색출하고자 하는 유전자가 2-3 kb 이하의 경우 하나의 primer 제작으로도 T-DNA 삽입을 색출할 수 있다. 이 경우 promoter나 terminator 부위에 primer를 제작하면 된다. T-DNA가 양방향으로 삽입됨으로 2 set의 실험이 이루어 져야 한다. 따라서 39x2=78 PCR이 요구된다. 유전자가 큰 경우 하나 이상의 primer가 요구된 다. Taq polymerase가 합성할 수 있는 뉴클레오티드의 길이를 약 3~4 kb로 보면, 7 kb 이하의 유전자의 경 우 2개의 primer를 유전자 중간 지점에서 고안하면 된다. 7 kb 이상의 경우 primer의 숫자를 더욱 증가할 필요가 있다. 2개의 primer를 고안할 때 primer간의 간격을 0-3-0.5 kb 정도를 두고 서로 마주보게 하면 다 음과 같은 이점이 있다. 우선 primer의 제작이 잘되었는지를 genomic DNA를 template로 PCR하여 간편히 조 사할 수 있다 (그림 2B). PCR된 DNA 절편은 추출하여 1차 스크리닝의 DNA blot 실험에 사용할 probe으로 쓸 수 있다. 또한 T-DNA 삽입위치가 primer에 매우 가까우면 PCR 밴드가 gel에서 빠져나가는 경우가 있음으 로 이를 방지하기위해서도 위와 같은 고안을 추천한다.

여럿의 유사한 유전자를 한번에 스크리닝하기 위하여 degenerated primer를 사용할 수 있다. 이 경우 degeneracy가 높을수록 스크리닝 효율이 감소함으로 가급적이면 낮게 하는 것이 중요하다. MADS box 유전자 의 경우 보존된 MADS box 부분가N-terminal 부위에 있어 이곳에서 2 set의 서로 마주보는 degenerated primer를 제작했다 (그림 2A). Primer는 중국 벼 유전체database (http://btn.genomics.org.cn/blast/blast.html)에서 blastn search를 통해 잘 고안 되었는지 확인하는 것 이 중요하다. 상동성이 높은 부위가 많이 뜨면 이를 피해야 한다. 제작된 primer는 DNA 풀을 스크리닝하기 전 0.5 ~1 ng의 wild type DNA를 대상으로 PCR하여 눈에 잘 보일 정도로 증폭되는지 확인하였다.

나. 수퍼 풀 스크리닝

수퍼 풀의 DNA 농도는 15 ng/ l 정도로 맞추어 사용하였다. 한 번 PCR에 사용되는 template 양은150~200 ng 이므로 각 수퍼 풀 당 15 l의 sample을 사용하였다. Primer는 12 pmol/ l로 만들어서 1 l를 사용하였다.

PCR은 39개의 수퍼 풀과 1개의 positive control 총 40개의 DNA를 대상으로 수행하였다. positive control 에 쓰인 primer 쌍은 0-307-15f와 gus를 사용하였는데, 2.6 kb band를 증폭한다. 2개의 degenerated primer 를 gus 및 hph primer와 각각 PCR을 하였음으로 총 4 set의 PCR 실험을 수행하였다. PCR이 끝난 후, 전체 부피 (40 l) 중 7 l를 mini gel에서 전기영동 한 후 눈으로 일단 확인하고 (band가 안 보여도 괜찮음) 바 로 membrane으로 transfer 하였다. 혼성화 반응에 필요한 probe는 primer 테스트에 만들어진 PCR product 를 사용하였다. 그 결과 36번 수퍼 풀에서 positive spot을 얻었다 (그림 2C).

다. 풀 및 각 라인 스크리닝

36번 수퍼 풀은 7개의 풀로 만들어 졌다. 따라서 각각의 풀을 대상으로 위의 실험에서 positive를 보인 primer 쌍으로 PCR을 수행하였다. 그 결과 한 개의 풀에서 band를 얻을 수 있었다 (그림 2D). 또한 그 풀 에 속한 50개의 돌연변이 라인들의 DNA를 template로 하여 PCR한 결과 1개의 라인에서 band를 얻을 수 있었 다 (그림 2E). 풀과 라인 스크리닝에서 DNA gel blot의 필요성은 없었다. T-DNA 삽입 위치를 알기 위해 PCR 된 DNA 절편을 추출하여 염기서열을 분석하였다. 그 결과 OsMADS6 유전자의 첫번째 intron에 T-DNA가 삽입 되었음이 확인되었다 (그림 2F).

4. 수퍼풀 DNA 분양

수퍼 풀을 사용하고자 하는 연구실은 간략하게 사용 목적을 기술하여 포항공대 안진흥 교수 (genean@postech.ac.kr)에게 연락하면 된다. 분양은 한번에 한 set이다. 39개의 수퍼 풀과 wild type DNA 그리고 positive control 등 총 41개의 DNA 샘플을 제공하고 있으며 그 양은 PCR 20회 분량에 해당된다. 하 나의 유전자를 스크리닝하는데 2-4 번의 PCR이 필요하므로 5-10 개의 유전자를 테스트 할 수 있다. Degenerated primer를 고안해서 연구하면 보다 많은 유전자의 knockout을 screening할 수 있을 것이다. 여 러 개의 primer를 섞어서 screening하는 방법도 있다. 본 실험실에서는 3개의 primer를 섞어서 positive 결 과를 얻을 수 있었다. 더 많은 primer를 섞을 수 있는지 연구 중이다 이 때 forward primer 끼리 또는 reverse primer 끼리 섞어야 하며, 섞은 primer 사이에 band가 나오지 않아야 한다.

제공하는 변이체 풀은 T-DNA 외에도 벼의 endogenous한 retrotransposon인 Tos17이 4 새로 삽입되어 있어 이에 의한 삽입변 이체 스크리닝도 가능하다. 현재까지 수퍼 풀이 분양된 실험실은 다음과 같다. 김민균 교수 (서울대), 조성호 교수 (인하대), 이상열 교수 (경상대), 김성룡 교수 (서강대), 김병철 박사 (포항공대), 박훤범 교수 (수원대), 우용민 박사 (금 호 생명과학 연구소), P. Ronald (University of California, Davis), T. Okita (Washington State University).