바이오인

줄기세포 유래 세포외소포치료제 품질, 비임상 평가정보집 ◈목차 서론 1. 배경 2. 도입 품질평가 1. 일반사항 2. 품질관리 및 특성분석 비임상 독성 평가 1. 면역독성/면역원성 2. 종양원성/종양진행성 맺음말 참고문헌 ◈본문 1. 배경 줄기세포는 미분화 상태의 세포로서 다양한 조직재생 및 난치병 질환의 치료에 적용되고 있다.하지만 줄기 세포치료제의 경우, 여전히 체내 투여 시 줄기세포의 낮은 생존율, 체내 안전성에 대한 문제를 비롯한 다양한 부작용(면역 반응, 종양 유발, 조직 석회화 등)이 존재하고 있다. 이러한 줄기세포치료제의 부작용을 해결하기 위해 대체 치료제에 대한 연구가 활발히 보고되고 있으며, 특히 줄기세포의 치료 효과의 상당 부분이 줄기 세포가 분비하는 세포외소포(Extracellular Vesicles, EV)에 의한 것으로 밝혀지면서 세포외소포의 역할에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 세포외소포는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포신호는 표적 세포의 성장, 이동, 분하, 사멸을 포함한 세포 거동을 조절한다고 알려져 있다. 세포외소포는 50-200 nm 정도의 직경을 갖는 소포체로 세포막 구조와 동일한 이중인지질막으로 이루어져 있으며, 표면에는 특이적인 바이오마커들이 발현되어 있다. 특히 인테그린(integrins), MHC 분자, 세포 골격 단백질 등이 포함되어 있으며, 이 중 CD9, CD63, CD81 등과 같은 테트라스파닌(tetraspanin) 단백질은 세포외소포를 확인할 수 있는 주요한 마커 단백질로 사용되고 있다. 또한 줄기세포 유래 세포외소포는 단일 성분이 아닌 다양한 생체활성 인자(단백질, mRNA, 지질, 대사물질 등)들을 포함하고 있어 줄기세포치료제를 대체할 수 있을 것으로 기대된다. 2. 도입 본 자료집의 발간 목적은 중간엽 줄기세포 유래 세포외소포치료제의 품질 및 비임상 안전성 평가에 활용 할 수 있는 최신자료를 제공하는 것에 있다. 세포외소포를 치료제로 개발하기 위해서는 품질관리 및 특성분석이 필요하며, 특히 이러한 품질관리 기준은 세포외소포 생산에 있어 배치 간 변동성(batch-to-batch variation)을 최소화하는 것이 중요하다. 세포외소포치료제는 유래되는 세포의 종류, 생산과정 등에 따라 안전성 및 유효성의 기준이 다를 수 있기 때문에 모든 종류의 세포외소포치료제를 동일한 기준으로 평가하는 것은 어렵다. 따라서 줄기세포 기반 세포외소포를 이용한 의약품의 품질평가 및 비임상 평가(면역독성, 종양원성 등)에 본 자료집을 참고할 수 있다. 다만, 세포외소포의 원료물질로 사용한 줄기세포의 특수성을 고려하여 선택적으로 활용하며, 세포의 종류와 기원에 따라 추가적인 평가가 필요할 수 있음을 고려해야 한다. 품질평가 *세포외소포치료제 품질, 비임상 및 임상평가 가이드라인(2018)'에는 세포외소포치료제에 대한 품질관리 항목으로 성상, 세포외소포 수, 세포외소포 크기, 마이코플라스마부정시험, 외래성 바이러스부정시험, 무균 시험, 엔도록신시험, 확인, 순도 및 역가시험이 제시되어 있다. 본 자료집에서는 그 중 일부 항목에 한하여 최신 시험법 및 고려사항 등에 대한 정보를 제공하고 있다. 1. 일반사항 본 자료집에 설명하고 있는 줄기세포는 성체줄기세포 중 지방 유래 중간엽 줄기세포이다. 중간엽 줄기 세포가아닌 조혈모줄기세포(hematopoietic stem cell), 배아줄기세포(embryonic stem cell), 유도만능 줄기세포(iPS, induced pluripotent stem cell), 세포주(cell line), 그리고/또는 세포 배양액의 품질관리에도 활용 가능하나, 각각의 세포의 특성에 따라 원료물질의 품질관리 항목(세포 확인(CD marker 등), 세포외소포의 품질관리 항목(농도, 내부인자 등)에 대해서는 유연하게 세부 항목의 변경 및 추가가 필요하다. 또한 본 자료집은 사람 유래 세포에서 생산되는 세포외소포를 이용하여 개발되는 세포외소포치료제에 활용할 수 있으며, 사람 외의 세포（예, 동•식물세포 또는 미생물）에서 분비되는 세포외소포치료제를 개발할 경우에는 본 자료집에서 제시하는 내용 외에도 세포의 특성을 반영한 추가적인 자료가 필요하다. 2. 품질관리 및 특성분석 세포외소포는 세포의 상태나 제조공정 등에 따라 크게 영향을 받기 때문에 특정 제조공정으로 분리 정제된 세포외소포가 일관된 특성을 가지는 것을 보여주기 위하여 단백질, RNA 및 지질의 조성과 함량에 대한 프로 파일 분석이 필요하다. 일반적으로 세포 종류에 따라 지질의 조성은 다르지만 동일한세포 및 동일 생산 공정 에서 얻어진 지질의 조성 및 함량은 유사하게 나타나야 하며 관리 기준을 정하고 그 기준 설정의 범위 안에서 관리되고 있다는 일관성을 보여야 한다. 프로파일 분석을 위해서는 최대한 많은 수의 단백질, DNA, RNA, 지질 등이 분석될 수 있도록 최신의 기술（예: LC-MS/MS, miRNA array）을 이용하여 분석하는 것이 필요하다. 또한 불순물에 대한 특성 분석과 이에 대한 관리가 필요하다. 배양공정 과정에서 사용되는 물질 중 오염 및 잔류물（serum albumin, 싸이토카인, 항생제, 세균，진균, mycoplasma, 외래성 바이러스，숙주세포 유래 DNA, 숙주세포 유래 RNA 등）에 대하여 배양공정 중 또는 배양완료 후, 잔류물의 제거 방법과 잔류물질의 농도에 대한 관리 기준을 정하고 그 설정된 기준값의 범위 안에서 관리되고 있다는 일관성을 보여주는 평가자료가 필요하다. 1) 세포외소포 수 세포외소포 농도(수) 는 Nanoparticle tracking analysis（이하 NTA） 등을 이용하여 측정할 수 있다. NTA 분석 법은 용액 내에 분포하는 입자에 빛을 조사하여 입자의 브라운 운동（Brownian motion）으로 인하여 산란된 빛을 분석하는 방법이다. NTA 분석은 분석자에 따라 측정에 차이가 있을 수 있어, particle/ frame, threshold 등에 대한 기준을 확립하여 세포외소포의 농도(수)를 분석하여야한다. 또한 세포외소포가 아닌 입자도 측정되기 때문에, 세포외소포의 주요 성분인 단백질의 총량과 비교 분석하여 반정량적인 분석이 필요하다. ...................(계속) ☞ 자세한 내용은 내용바로가기 또는 첨부파일을 이용하시기 바랍니다.

[BIO ECONOMY REPORT] 줄기세포 유래 세포외소포를 활용한 뇌졸중치료제 개발 ◈목차 1. 서론 가. 뇌졸중 나. 뇌졸중 치료제 2. 뇌졸중 치료에서 줄기세포 유래 세포외소포의 역할 가. 세포외소포의 특성 나. 줄기세포 유래 세포외소포의 기능 다. 뇌졸중 치료를 위한 후보물질 3. 줄기세포를 이용한 뇌졸중 치료제 개발 동향 가. 줄기세포를 이용한 뇌질환 치료제 개발 동향 나. 줄기세포 유래 세포외소포 치료제 개발 동향 4. 맺음말 5. 참고문헌 ◈본문 1. 서론 및 개요 가. 뇌졸중 뇌졸중은 뇌혈관이 막히거나 파열로 인해 뇌조직에 손상이 발생하는 질환으로 전세계적으로 6명 중 1명은 앓게 되는 흔한 질환이다. 국내에서만 매년 15만명의 새로운 환자가 발생하며, 사망 및 장애의 주요 원인이 된다. 출혈성 뇌졸중보다 급성 허혈성 뇌졸중이 환자가 더 많으며, 급성 허혈성 뇌졸중은 뇌의 일부분에 혈액공급이 안되어 신경 기능이 상실되는 것이 특징인 만성질환으로 뇌동맥의 혈전이나 색전증 장애에 의해 발생한다. 허혈성 뇌졸중의 병태생리학적 반응은 매우 복잡하며, 발생한 뇌손상 후 복구하는 치료법은 아직 없다. 현재 사용되는 치료법으로는 재개통술 또는 혈전 용해제, 항고혈압 치료제, 항혈소판 치료제, 혈액응고 방지제 등의 치료가 있지만, 급성기 허혈 손상을 치료하는 공인된 치료법은 플라즈미노겐 활성제(tPA)로 재조합 DNA 기술을 이용해 개발한 혈전 용해제뿐이다. 이러한 치료 접근법도 4.5시간 이내로 제한되고 있다. 나. 뇌졸중 치료제 수십년에 걸쳐 신경보호나 신경회복을 위한 신약 후보 물질들이 뇌경색환자 임상시험을 통해 유효성을 확인하는데 모두 실패하였으며, 최근 급성뇌경색 환자에서 nerinetide의 효과에 대한 ESCAPE-NA1의 3상 임상시험에서도 유의한 효과를 보는데 실패하였다(Lancet 2020). 이러한 상황에서 중간엽 줄기세포는 다양한 뇌질환에서 손상된 세포의 대체, 염증 감소와 같은 역할을 하는 것으로 알려지면서 유망한 치료법으로 각광받아 다수의 줄기세포치료제의 임상시험이 있었으나 그 효과를 검증하지 못하였다. 실패의 주된 원인으로 급성기 뇌졸중 환자에게 바로 적용하지 못하는 세포치료제의 한계와 줄기세포치료제의 효능부족, 세포 관련 부작용으로 생각되어지고 있다. 따라서 줄기세포 작용기전인 paracrine 효과를 가지며, 면역반응, 종양발생, 혈관폐색 등을 피할 수 있고, 신속적용이 가능한 장점이 있는 줄기세포 유래 EV 치료제가 새롭게 주목받고 있다. 2. 뇌졸중 치료에서 줄기세포 유래 세포외소포의 역할 가. 세포외소포의 특성 세포는 크기와 생물발생(biogenesis)에 따라 엑소좀(Exosomes), 미세소포(Microvesicles), 세포자멸체(Apoptotic body)의 세가지 주요 유형의 세포외소포(EV)를 생성한다. 다중소포엔도좀(multivesicular endosome, MVEs)가 성숙하는 과정에서 엔도좀 막이 안쪽으로 들어와 내강 소낭(intraluminal vesicles)이 생성되었다가, 다중소포엔도좀이 세포표면과 결합하여 내강소낭이 세포 밖으로 분비되어 생성되는 엑소좀과 원형질막이 바깥으로 솟아 나와 분리되어 세포외로 분비되는 미세소포로 분류되며, 세포외에서는 이들을 구분하기는 어렵기 때문에 통칭하여 세포외소포라 한다. 식약의약품안전처 가이드라인을 비롯하여 국내외 학회에서 현재 ‘세포외소포’라는 명칭을 사용하고 있다. 세포외소포는 줄기세포를 비롯한 수많은 세포 유형에서 50-1,000nm 크기의 막소포 형태로 분비되며, 유래하는 세포들의 상태를 반영한다. 혈액, 소변, 타액 및 모유와 같이 쉽게 접근할 수 있는 인체 체액에 존재하여 분리할 수 있어 다양한 병리적 기능을 수행하기 때문에 진단 및 예후 바이오마커의 매력적인 소스로 여겨지기도 한다. 세포외소포는 세포의 종류와 상태에 따라 DNA, RNA(mRNA, ncRNA), 지질, 단백질을 비롯한 다양한 생리활성물질이 함유되어 있으며, 이 함유물질들은 이중 인지질막에 의해 뉴클레아제, 프로테아제, pH 및 삼투압 농도의 변동 등 기타 환경 요인으로부터 보호된다. 또한 이들 세포외소포 함유물질들을 표적세포에 전달하며 표적세포의 성장, 분화, 발달 및 사멸을 조절함으로써 세포 간 신호전달 매개체로서의 역할을 한다고 알려져 있다. 나. 줄기세포 유래 세포외소포의 기능 중배엽 줄기세포는 주변 환경 요인에 따라 다른 세포로 분화할 수 있는 다중 분화능을 가진 세포로 항염증, 면역조절 및 재생 능력이 있는 것으로 알려져 있으며, 중배엽 줄기세포로부터 분비된 세포외소포는 중배엽 줄기세포가 가지는 대부분의 능력을 보유해 다양한 치료 효능을 보일 수 있으면서, 생체내 주입된 줄기세포의 낮은 생착률, 종괴형성 유발, 혈관 폐색으로 인한 경색 및 혈액뇌장벽(blood-brain-barrier) 통과의 어려움 해결할 수 있는 능력으로 인해 뇌질환을 치료할 수 있는 새로운 효과기로 부각되고 있다. 줄기세포 유래 세포외소포는 줄기세포와 손상된 세포 간의 정보 교환에 중요한 역할을 하고 표적세포를 변화시킬 수 있다. 또한 줄기세포 또는 전구세포를 자극해 허혈성 손상 후 신경재생, 신생혈관 생성을 촉진 및 면역조절 하는 것이 보고됨으로써 뇌졸중 후 회복기전에 직접적으로 관여할 가능성이 있다. (Bang, Prec Fut Med 2017; Kim, PLoS One 2012 ...................(계속) ☞ 자세한 내용은 내용바로가기 또는 첨부파일을 이용하시기 바랍니다.

줄기세포 유래 세포외소포 치료제 연구개발 및 규제동향 ◈목차 서론 줄기세포 유래 세포외소포의 개요 줄기세포 유래 세포외소포 치료제의 개발현황 줄기세포 유래 세포외소포 치료제의 품질평가법 연구개발 현황 줄기세포 유래 세포외소포의 안전성 평가법 현황 줄기세포 유래 세포외소포 규제 현황 맺음말 참고문헌 ◈본문 서론 줄기세포 유래 세포외소포 치료제는 줄기세포에서 분비되는 세포외소포를 이용하여 각종 질병을 치료하는 목적으로 사용되는 세포 유래 바이오의약품이다. 줄기세포 유래 세포외소포 치료제는 주로 조직 재생 치료제로 개발되고 있으며, 장기 이식 시 발생할 수 있는 면역 반응을 억제하거나, 손상된 조직의 재생 효능을 촉진하여 치료하는 역할을 하기 때문에, 기존 줄기세포 기반 치료제의 다양한 한계점을 극복하여 향후 새로운 형태의 바이오 신약으로 발전할 것으로 예상되고 있다. 특히 조직 재생 치료제로서 줄기세포 유래 세포외소포가 각광받는 이유는 기존 줄기세포 치료제에서 발생하는 면역 반응 발생, 암 형성 유발, 조직 석회화 촉진 등 다양한 부작용을 극복하면서 조직재생을 유도할 수 있기 때문이다. 또한, 손상조직에 주입된 줄기세포의 낮은 생존율로 인해 나타나는 치료효능 저하에 대한 문제점도 해결할 것으로 보인다. 줄기세포 유래 세포외소포 치료제로 사용하는 세포의 종류는 현재 대부분 중간엽 줄기세포 (Mesenchymal stem cell)를 들 수 있으며, 세포외소포 자체를 치료제로 사용하는 경우뿐만 아니라 약물전달체로 응용하거나 세포를 파쇄하여 수득하는 소포체도 개발되고 있다. 현재 세포외소포 치료제의 시장은 연평균 23.8%의 성장률을 보이고 있으며, 시장의 규모는 2024 년까지 2억 6,400만 달러 이상으로 성장할 것으로 추정된다. 특히 세포외소포 치료제 중 줄기세포 유래 세포외소포 치료제 분야는 급속하게 시장규모가 증가하고 있으며, 활발한 연구의 진행으로 수년 내에 국내•외에서 임상 승인 제품까지도 기대되고 있다. 본 보고서에서는 현재 개발 되고 있는 줄기세포 유래 세포외소포의 분리•정제법, 특성 평가법, 세포외소포 치료제 개발 기업 및 임상연구 현황에 대해 소개하고, 품질평가 및 안전성 평가 동향을 중점적으로 다루어보고자 한다. 최근 연구 동향을 파악함으로서 관련 연구자 및 심사자에게 줄기세포 유래 세포외소포의 연구, 제품 개발 및 상용화에 기여할 수 있는 참고자료로 활용되기를 기대한다. ...................(계속) ☞ 자세한 내용은 내용바로가기 또는 첨부파일을 이용하시기 바랍니다.

[NRF R&D Brief-2021-23] 줄기세포 및 오가노이드 ◈목차 1. 줄기세포 및 오가노이드 2. 왜 주목받고 있나? 3. 최근 많은 연구가 이루어지고 있나? 4. 최근 국내·외 연구 동향은? 5. 기초연구사업 지원 현황은? 6. 향후 기초연구사업에서 어떤 연구들이 필요한가? 7. 기초연구사업 결과들이 원천기술 확보로 이어지려면? 8. 향후 중점적으로 추진하여야 할 연구주제가 있다면? 참 고 자 료 ◈본문 1. 줄기세포 및 오가노이드 ㅇ 줄기세포란 체내 모든 종류의 세포로 분화할 수 있는 미분화 세포를 의미하며, 크게 배아줄기세포와 성체줄기세포로 존재함. 오가노이드는 이러한 줄기세포로부터 체외에서 만들어지는 3차원 조직 모사체 및 미니 장기임. ☞ 배아줄기세포란 배반포 단계의 초기 포유류 배아에서 파생된 줄기세포로, 개체에 있는 모든 조직의 세포를 만들 수 있는 만능성(pluripotency)을 가짐. ☞ 성체줄기세포란 성체의 조직 혹은 기관에 존재하고 있는 줄기세포로, 특정 세포들로 분화가 가능한 다분화능(multipotency)을 가짐. ☞ 오가노이드는 배아줄기세포 또는 성체줄기세포로부터 만들어지는 3차원 구조체로, 실제 장기의 구조 및 기능을 모사함. ※ 출처 : Hans Clevers. “Modeling Development and Disease with Organoids”. Cell, Vol.165, no.7, 2016, 1586-1597. 신근유 교수(포항공과대학교) 검토(2021.09.30.) 2. 왜 주목받고 있나? ㅇ 배아줄기세포는 개체에 존재하는 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 만능성을 가짐과 동시에 체외에서 무한히 배양하는 것이 가능함. 이 두 가지 특징 때문에 세포 분화 과정에 대한 기초 연구에서부터 질병 모델링과 세포치료제 개발을 위한 플랫폼으로 활발하게 활용되고 있음. ㅇ 성체 줄기세포의 주요 역할은 조직이나 기관의 세포를 유지하고 손상된 세포를 치료하는 것이기에 조직별 성체 줄기세포 분화과정에 대한 이해와 조직 특이적 분화 기술 확보는 차세대 재생의료 분야에 활용이 가능함. ㅇ 오가노이드는 체외에서 배양이 가능한 3차원 미니 장기유사체가 가진 특징으로 인해 질병발생의 기작을 이해하기 위한 기초의학을 비롯하여 재생의학과 인공장기 개발, 질병 모델링, 신약 개발 등 차세대 바이오연구 및 산업에 전반적으로 활용이 가능함. ☞ 과거 세포 모델은 암세포나 불멸화된 세포주가 주축을 이루었으나, 실제 체내에 존재하는 세포와 비교하여 생물학적 특성과 반응성에서 큰 차이를 보였음. 배아줄기세포는 암세포가 아님에도 무한히 증식할 수 있고, 다양한 조직 세포를 생산해 낼 수 있으므로 기존의 세포주 모델을 대체하는 새로운 플랫폼을 제공하였음. 특히 인간 배아줄기세포의 경우, 인간의 초기 발생을 연구하고, 다양한 인간조직 세포를 생산함으로써, 동물 모델의 한계점을 보완하는 역할로 주목받고 있음. ※ 출처 : Charles E. Murry & Gordon Keller. “Differentiation of Embryonic Stem Cells to Clinically Relevant Populations: Lessons from Embryonic Development”, Cell, Vol.132, Issue 4, 2008, 661-680. 장지원 교수(포항공과대학교) 검토(2021.09.14.) ☞ 신체 조직의 복구 과정과 재생 과정에서 성체 줄기세포와 조직 내 주변 미세환경의 상호조절 및 분화 기작을 이해하여 질병을 극복하는데 줄기세포를 활용한 치료법이 재생 의료 분야에서 대안으로 제시되고 있음. ※ 출처 : Huimin Xia, Xin Li, Weiwei Gao, Xin Fu, Ronnie Fang, Liangfang Zhang & Kang Zhang. “Tissue repair and regeneration with endogenous stem cells”, Nature Reviews Materials, no.3, 2018, 174-193. 최세규 교수(포항공과대학교) 검토(2021.09.30.) ☞ 인간 질병을 연구하는데 기반이 되었던 과거의 2차원 세포배양 모델과 동물 모델은 세포 유사성 및 생체 조직 구조의 모사성이 낮다는 점과 인간과 동물과의 궁극적인 차이점이 존재한다는 한계점을 가지고 있었음. 줄기세포 및 오가노이드는 이러한 한계점을 극복한 인간 조직 모델로, 인공장기 개발, 질병 모델링, 독성 테스트, 신약 개발 및 환자 맞춤형 치료제 개발 등의 분야에서 주목받고 있음. ※ 출처 : Aliya Fatehulla, Si Hui Tan&Nick Barker. “Organoids as an in vitro model of human development and disease”, Nature Cell Biology, Vol.18, no.3, 2016, 246-254. 신근유 교수(포항공과대학교) 검토(2021.09.30.) ...................(계속) ☞ 자세한 내용은 내용바로가기 또는 첨부파일을 이용하시기 바랍니다.

신호전달 세포소기관으로서 미토콘드리아는 포유류 줄기세포 운명을 제어한다. ◈목차 1. 서론 2. 미토콘드리아의 여러 기능 3. 줄기세포에서 미토콘드리아의 재평가 4. 미토콘드리아 활성산소는 줄기세포 운명을 조절한다. 5. TCA 회로 대사산물에 의한 줄기세포 운명의 조절 6. NAD+/ NADH 비율은 줄기세포의 운명과 기능을 조절한다. 7. 피루브산 대사는 줄기세포의 운명과 기능을 지휘한다. 8. 미토콘드리아 역동성은 줄기세포 운명을 조절한다. 9. 결론 ◈요약문 최근 보고된 증거들은 미토콘드리아 대사가 줄기세포의 운명을 결정하는데 필요하다는 개념을 뒷받침한다. 역사적으로 미토콘드리아 대사는 각각 adenosine triphosphate (ATP) 및 tricarboxylic acid (TCA) 회로 대사산물의 생산과 연결되어 줄기세포 생존과 성장을 지원하는 것으로 알려져 왔다. 그러나, 이제 이러한 대표적인 역할을 넘어서 신호전달 세포소기관(signaling organelles)으로서, 미토콘드리아가 줄기세포의 운명과 기능을 조절한다는 것이 분명해졌다. 이 리뷰에서는 미토콘드리아가 활성산소(Reactive Oxygen Species, ROS) 생성, TCA 회로 대사산물 생산, NAD+/NADH의 비율 조절, 피루브산(pyruvate) 대사 및 미토콘드리아 역동성(mitochondrial dynamics)을 통해 어떻게 포유류 줄기세포의 운명과 기능을 제어하는지에 대한 핵심적이고 개념적인 발상에 중점을 둔다. 키워드: TCA cycle, pyruvate, epigenetics, ROS, acetyl-CoA, L-2-HG, mitochondrial dynamics 분야: Biochemistry, Cell_Biology, Developmental_Biology ◈본문 1. 서론 줄기세포는 줄기세포 pool을 유지하기 위해 세포 분열을 겪을 뿐만 아니라, 조직 항상성을 생성하고 유지하기 위해 전구 세포 집단으로 분화하기도 한다. 많은 성체 줄기세포(adult stem cell)들은 휴면 상태(quiescence)를 유지하다가, 다양한 세포 운명이 결정되면서 대사의 변화를 동반한다. 줄기세포는 독특한 영양소 가용성을 가진 다양한 미세환경(niche)에 존재하며, 그것은 줄기세포 대사의 변화에도 반영된다. 전통적으로 대사는 줄기세포, 전구세포 또는 분화된 세포의 다양한 대사적 수요를 지원하기 위해 줄기세포 운명의 변화와 동반되는 것으로 생각되었다. 그러나, 지난 10년간의 여러 연구들은 대사의 변화가 줄기세포의 운명을 좌우할 수 있으며, 전사 네트워크가 줄기세포의 운명을 제어하는 방법과 유사하게 기능할 수 있음을 보여주었다. 이것은 줄기세포 대사가 손상된 조직을 재생하거나, 정상적인 노화 과정의 조직을 회춘(rejuvenation)시키기 위한 목표가 될 수 있다는 인식으로 이어졌다. 본 리뷰는 줄기세포 대사에 관한 모든 문헌에 대한 철저한 검토가 아니며, 미토콘드리아 대사가 어떻게 활성산소(Reactive Oxygen Species, ROS) 생산, TCA (Tricarboxylic acid) 회로 대사산물 생성, 감소된 nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+/NADH)에 대한 산화율, 피루브산(pyruvate) 대사와 관련되는지, 그리고 미토콘드리아 역동성(mitochondrial dynamics)이 어떻게 생체 내에서(in vivo) 쥐와 인간 줄기세포 운명을 좌우하고, 쥐와 인간 줄기세포의 만능성(pluripotency) 상태를 유지하는 것과 관련되는지에 대한 주요 발전을 강조하고자 한다. 2. 미토콘드리아의 여러 기능 미토콘드리아 대사는 세포 생존과 증식을 지원하고 다양한 세포 상태를 조정한다. 미토콘드리아를 ‘세포의 동력원’으로 간주하는 고전적인 기능은 산화적 인산화(oxidative phosphorylation, OXPHOS) (즉, 이화작용)에 의해 ATP (adenosine triphosphate)를 생성하는 것이다 (그림 1). 이에 상응하는 핵심 기능으로 지질 및 뉴클레오타이드(nucleotides)와 같은 거대분자를 생성하는 citrate, oxaloacetate 등의 TCA회로 대사산물을 생산함으로써, 동화작용(anabolic)을 지원하는 것이 있다 (그림 1). 산화적 TCA 순환 기능은 기능적으로 전자전달계(electron transport chain, ETC)와 연결되어 있다. 그러나, TCA 회로는 전자전달계가 손상되었을 때, 주로 aspartate 생산을 위해 pyruvate carboxylase (PC)를 사용하여 피루브산에서 oxaloacetate (OAA)를 생성하고, citrate 합성을 위해 글루타민(glutamine) 의존적 환원 카르복실화(carboxylation)를 사용하는 환원 기전에 의해 계속해서 대사산물을 생성할 수 있다. 전자전달계 복합체 III는 de novo pyrimidine 합성의 핵심 속도 제한 효소인 DHODH (dihydroorotate dehydrogenase) 활성에도 필요하다. 해당 과정(glycolysis)과 TCA회로 흐름은 동화작용의 수요를 충족시키기 위해 대사산물을 생성한다는 점을 유의하는 것이 중요하다. 그림 1. 생체 에너지 및 생합성 소기관으로서 미토콘드리아는 줄기세포 생존 및 증식을 지원한다. 포도당 및 여러 다른 기질(예: fatty acids 및 glutamine)은 생합성 중간체 및 NADH 및 FADH2와 같은 환원 등가물을 생성하는 TCA 회로에 공급된다. 또한, 미토콘드리아 1탄소 대사(one-carbon metabolism, 1CM)는 생합성 중간체를 제공한다. 중간 기질은 지질 및 뉴클레오타이드와 같은 거대 분자의 합성에 사용되며 환원 등가물은 줄기세포 생존 및 증식을 지원하는 산화적 인산화에 의한 ATP 생성을 위한 연료를 공급한다. (Ac-CoA, acetyl-coenzyme A, acetyl-CoA ; OAA, oxaloacetate; DHO, dihydroorotate; MPC, mitochondrial pyruvate carrier; ACLY, ATP citrate lyase; DHODH, dihydroorotate dehydrogenase; PDH, pyruvate dehydrogenase.) 지난 20년 동안의 연구를 통해 미토콘드리아에서 이질적(disparate) 신호 전달의 일부분이 세포의 운명과 기능을 제어한다는 미토콘드리아 대사의 세 번째 기능이 알려졌다 (그림 2). 표준 신호 전달 경로는 종종 미토콘드리아 ATP, acetyl-coenzyme A (acetyl-CoA) 및 활성산소를 각각 필요로 하는 인산화(phosphorylation), 아세틸화(acetylation) 및 산화(oxidation)를 포함하여 단백질 내 아미노산의 번역 후 변형에 관여한다. 미토콘드리아는 cytochrome c를 방출하여 케스페이스 의존적 세포 사멸(caspase-dependent cell death)을 시작하고 미토콘드리아 DNA (mtDNA)를 방출하여 다중 염증성 연쇄반응(multiple inflammatory cascades)을 시작할 수 있다. 또한, 미토콘드리아는 유리 칼슘(free Ca2+)의 주요 조절자 역할을 하여 다양한 Ca2+ 의존적 신호 전달 연쇄반응 및 전사 네트워크를 제어한다. 미토콘드리아 외막(outer membrane)은 미토콘드리아 항 바이러스 신호 단백질(mitochondrial antiviral signaling protein, MAVS)의존성 선천성 면역 반응 및 Bcl-2 (B-cell lymphoma 2) 의존성 세포 사멸과 같은 다양한 신호 전달 복합체의 물리적 플랫폼으로써 기능한다. 또한, 미토콘드리아 모양과 역동성은 세포의 운명과 기능을 결정하는데 중요한 원인으로 작용할 수 있다. 최근 개념은 소포체(endoplasmic reticulum) 및 리소좀(lysosomes)과 미토콘드리아 상호작용(crosstalk)이 세포 운명과 기능을 조절할 수 있다는 것이다. 이와 더불어 리소좀에 의한 미토콘드리아 품질 관리는 줄기세포 운명에 영향을 미친다. 핵심적인 부분은 미토콘드리아 기능의 변화가 줄기세포 운명에 결정적인 전사(transcription)의 변화보다 앞선다는 것이다. 따라서 미토콘드리아는 신호전달 세포소기관(signaling organelles)이며, 본 리뷰에서는 줄기세포의 운명과 기능을 제어하는 핵심 접점으로 미토콘드리아 대사의 이러한 측면을 개념적으로 강조한다. 그림 2. 신호전달 세포소기관으로서 미토콘드리아는 줄기세포의 운명과 기능을 조절한다. 미토콘드리아는 줄기세포 유지, 전구 집단에 대한 운명 결정 및 다양한 세포 유형으로의 분화를 제어하기 위한 세포 신호로 작용할 수 있는 ROS 및 다양한 대사산물을 생성한다. (SC, stem cell; PC, progenitor cell; DC, differentiated cell.) 3. 줄기세포에서 미토콘드리아의 재평가 21세기 대사 연구의 부흥은 1920년대 종양 절편이 충분한 산소가 있는 상태에서 포도당(glucose)을 흡수하고, 젖산(lactic acid)을 분비한다는 Otto Warburg의 관찰과 관련이 있다. 실제로 여러 연구에서 줄기세포가 Warburg 효과를 나타낸다고 보고했다. 더욱이 해당 과정의 전사 활성화 인자로 알려진 저산소증 유발 인자(hypoxia- inducible factors, HIFs)가 줄기세포 운명을 조절하는 것으로 입증되었다. 조혈모줄기세포(hematopoietic stem cells, HSC)에서 MitoTracker Green (MTG)과 같은 염료를 사용하여 미토콘드리아 함량을 평가하였다. 그 결과, 조혈모줄기세포에서 다능성 전구 세포(multipotent progenitors, MPPs)로 전환되는 동안 미토콘드리아 함량이 감소함을 보여주었다. 이러한 연구는 해당 과정이 줄기세포 운명을 조절하는 주된 대사 표현형이라는 단순한 발상을 이끌어 냈다. 그러나, 최근 연구에서는 조혈모줄기세포가 MTG를 적극적으로 배출하는 xenobiotic efflux pumps를 포함하고 있기 때문에 미토콘드리아 함량을 측정하기 위한 염료로써, MTG를 사용하는 것에 의문을 제기했다. 방출 펌프(efflux pumps)의 저해제인 verapamil을 추가하면 조혈모줄기세포에서 MTG 염색이 하위 전구조혈집단보다 더 많이 증가했다. 이러한 결과는 미토콘드리아 대비 핵 DNA 함량을 측정함으로써 확인되었다. 경쟁적인 이식 실험에서 verapamil 처리 후 MTG가 높은 조혈모줄기세포가 장기적인 재집단(repopulation) 활성을 나타냈다. 미토콘드리아 함량의 또 다른 측정 방법으로 cytochrome c oxidase의 소단위 VIII에 미토콘드리아 표적 신호가 융합된 형광 단백질인 mito-Dendra2를 보유한 쥐는 조혈 계통에서 다능성 전구 세포보다 조혈모줄기세포에서 더 높은 mito-Dendra2 형광 신호를 보였으며, 경쟁 이식 분석(competitive transplantation assays)에서는 높은 mito-Dendra2 형광 신호를 가진 조혈모줄기세포가 장기적인 재집단 활성을 가지고 있는 것으로 나타났다. 또한, ATP 생성을 위해 해당 과정에 의존하는 만능성 및 휴면 상태의 성체 줄기세포는 일반적으로 완전히 기능하는 미토콘드리아를 풍부하게 가지고 있다. 또한, 인간 만능줄기세포(human pluripotent stem cell, hPSC)는 분화된 세포와 유사한 산소 소비율을 나타낸다. 중요한 것은 지난 몇 년 동안 쥐를 대상으로 한 유전 연구에서 Ptpmt1 (PTEN-like mitochondrial phosphatase 1), 피루브산 또는 지방산 산화(fatty acid oxidation), 미토콘드리아 분열/ 융합(fission/ fusion)이 생체 내에서 줄기세포 운명을 조절하는데 미토콘드리아 전자전달계가 기능한다는 사실이 입증된 것이다. 따라서, 줄기세포는 해당 과정과 미토콘드리아 대사에 의해 생성된 별개의 대사산물을 통합하여 줄기세포의 운명과 기능을 조절한다. 배아 발달과 성체 조직 항상성 및 복구는 self-renewal을 겪고 다른 계통의 세포를 생성하는 줄기세포 집단에 의존한다. 줄기세포의 감소는 노화와 많은 퇴행성 질환의 특징이다. 당연히 미토콘드리아 기능 장애는 이러한 표현형과 관련이 있다. 예를 들어, mtDNA polymerase gamma (POLG) 돌연변이 쥐는 조혈 전구 세포(hematopoietic progenitor cells, HPC), 신경 줄기세포(neural stem cells, NSC) 및 장 줄기세포(intestinal stem cells, ISC)를 포함하여, 다른 줄기 및 전구 세포의 기능 장애를 초래하는 mtDNA 돌연변이를 축적한다. 종합적으로, 이러한 연구는 다양한 맥락에서 줄기세포의 운명과 기능을 제어하는데 있어 미토콘드리아의 중요성을 강조한다. 4. 미토콘드리아 활성산소는 줄기세포 운명을 조절한다. 활성산소는 산소를 함유하는 자유기(oxygen-containing free radicals) 또는 화합물을 지칭하며, 산소 분자보다 반응성이 크다. 세포 내 활성산소에는 4가지 주요 형태가 있다: superoxide radical anion (O2-), hydroxyl radical (•OH), hydrogen peroxide (H2O2) 및 lipid hydro-peroxides (LOOH). 미토콘드리아 전자전달계 복합체 I, III 및 세포질 막 결합 NADPH (reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate) 산화 효소(NOX)는 O2- 생성의 주요 부위이다 (그림 3a). O2-는 생성 즉시 미토콘드리아 기질의 superoxide dismutase 2 (SOD2)와 미토콘드리아 막간 공간 및 세포질에서 superoxide dismutase 1 (SOD1)의 작용에 의해 보다 안정적인 H2O2로 환원된다. H2O2는 단백질의 기능, 안정성 및 세포 내 위치에 중요한 특정 황 함유 아미노산(즉, cysteine과 methionine)을 직접 산화시킴으로써, 신호분자 역할을 한다. 이러한 산화는 일반적으로 항산화제의 작용에 대해 가역적이다. Peroxiredoxins은 H2O2를 물(H2O)로 변환하는 주요 해독제이다. 또한, H2O2는 철(Fe2+)의 존재 하에, •OH를 생성할 수 있다. 다중 불포화 지방산(polyunsaturated fatty acids, PUFA)은 •OH와 반응하여 페롭토시스(ferroptosis)를 유발할 수 있는 LOOH를 생성한다. 유비퀴논(ubiquinone, Q)의 유비퀴놀(ubiquinol, QH2)로의 Glutathione peroxidase 4 (GPX4) 및 ferroptosis suppressor protein 1 (FSP1) 의존적 환원은 LOOH를 해독할 수 있다. 항산화 유전자의 발현은 forkhead box protein O (FOXO) 계열 구성원 및 nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2 (NRF2)를 포함한 다양한 전사인자(transcription factors)에 의해 조절되며, 활성산소가 줄기세포에 손상을 줄 수 있는 수준으로 증가하는 것을 방지한다. 포유류 만능줄기세포(pluripotent stem cells, PSC)의 미토콘드리아 활성산소 매개 조절과 관련된 일반적인 논제는 iPSC 및 배아 줄기세포가 유전체 무결성(genome integrity)을 유지하기 위해 낮은 수준의 내인성 활성산소를 가지며, 적절한 활성산소 수준은 다른 계통으로의 분화에 필요하다는 것이다. 참고로, 삼배엽(three germ layers)의 모든 세포를 생성할 수 있는 PSC는 preimplantation epiblast의 내부 세포 덩어리(inner cell mass, ICM), early post-implantation epiblast 또는 epiblast stem cells (EpiSCs)로부터 분리될 수 있다. 또한, PSC는 만능성 관련 전사인자(pluripotency-associated transcription factors)를 발현하여 체세포에서 확립될 수 있다. PSC는 세포 배양 조건에 의존하는 primed (보다 발생학적으로 분화된 상태)와 naïve의 두 가지 다른 상태로 배양될 수 있다. Naïve 및 primed PSC는 일반적으로 각각 ICM 및 early post-implantation epiblasts의 세포와 분자 특성을 공유한다. 미토콘드리아 호흡 사슬의 억제 또는 미토콘드리아 막 전위(mitochondrial membrane potential, MMP)의 탈분극(depolarization)은 PSC 분화를 방지하지만, 만능성을 유지한다. mtDNA의 돌연변이는 미토콘드리아 H2O2 생산을 증가시키고 iPSC 리프로그래밍 효율성과 self-renewal을 감소시킨다. 미토콘드리아 H2O2 생산을 감소시키는 mitochondria-targeted ubiquinone (MitoQ)을 처리하면 이러한 결함을 완화시킨다. 그러나 MitoQ의 추가는 wild-type iPSC 및 신경줄기세포에 독성을 유발한다. 종합적으로, 이러한 결과는 PSC의 생존력(viability)을 유지하기 위해 낮은 기저 수준의 미토콘드리아 H2O2가 필요하며 미토콘드리아 H2O2의 증가는 줄기세포능(stemness) 손실을 유발하고 분화에 필요함을 나타낸다. 미토콘드리아 활성산소는 성체 줄기세포의 휴면 상태, 활성화, 증식, 분화 및 고갈의 중요한 조절자로써 관련되어 있다. 휴면 상태, self-renewing 성체 줄기세포는 일반적으로 낮은 기저 수준의 활성산소를 유지하며, 이는 줄기세포의 운명 결정(commitment)과 증식 및 분화 중에 적당히 증가한다. 활성산소 수준이 가장 낮은 조혈모줄기세포는 self-renewal 잠재성이 가장 높다. FOXO 계열 전사인자는 다양한 항산화 유전자의 발현을 활성화하여 성체 줄기세포에서 활성산소 수준을 낮게 유지한다. FOXO3 결핍 또는 FOXO1/3/4-deficient 쥐 신경줄기세포 및 신경전구세포(neural progenitor cells, NPC)는 출생 직후 급속한 증식과 뇌 크기의 증가를 보이며, 그 후 신경줄기세포 및 신경전구세포 둘 다 세포의 수와 self-renewal 능력이 급격히 감소한다. 쥐 조혈모줄기세포 및 골격근 줄기세포(skeletal muscle stem cells, MuSC) 또는 ‘‘satellite cells’’는 self-renewal 능력 유지를 위해 FOXO3의 유사한 필요 조건(similar requirement)을 나타낸다. 산화 스트레스를 조절하는 것 외에도 FOXO는 미토콘드리아 산화 대사를 조절한다는 점에 유의하는 것이 중요하다. 새로운 통합 개념은 성체 줄기세포 self-renewal 및 정지를 위해 낮은 수준의 미토콘드리아 활성산소가 필요하고, 정상적인 줄기세포 증식 및 분화를 위해서는 미토콘드리아 H2O2 생산의 증가가 필요하다는 것이다 (그림 3). 대조적으로, 비정상적으로 높은 미토콘드리아 H2O2 수치는 줄기세포 고갈을 유발한다. 예를 들어, mitochondrial carrier homolog 2 (MTCH2)의 손실은 미토콘드리아 질량, ATP 및 활성산소 수준의 증가를 유발하고 조혈 줄기 및 전구 세포(hematopoietic stem and pro-genitor cells, HSPC)의 세포주기 진입을 촉진한다. 여러 다른 연구에 따르면, 낮은 기저 수준의 활성산소는 정원 줄기세포(spermatogonial stem cells), 신경줄기세포 및 기도 기저 줄기세포를 포함한 다양한 성체 줄기세포의 self-renewal 능력을 유지하는데 필수적이라는 것을 보여주었다. 줄기세포에서 미토콘드리아 전자전달계 생성 활성산소의 생산을 제어하는 요인이 무엇인지는 알려져 있지 않다. 한 가지 단서는 조혈모줄기세포가 조혈모줄기세포의 유지 및 기능을 위해 미토콘드리아 지방산 산화(FAO)를 필요로 한다는 관찰에서 비롯된다. FAO는 NADH 및 FADH2 (dihydroflavine-adenine dinucleotide)를 통해 전자전달계에 전자를 제공하여 조혈모줄기세포의 운명 및 기능을 위한 활성산소를 생성할 수 있다. 미토콘드리아 H2O2 수준의 중간 정도의 생리학적 증가는 조혈모줄기세포, 각질 줄기세포, 기도 기저 줄기세포, 골격근 줄기세포, 신경줄기세포 및 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells, MSC)를 포함한 다양한 성체 줄기세포의 운명 결정, 증식 및 분화에 필요하다. AKT1/2 double-deficient 조혈모줄기세포에서 감소된 미토콘드리아 H2O2수준은 분화의 정지 및 결함을 증가시키며, 이는 이러한 세포에서 약리학적으로 미토콘드리아 H2O2 수준을 증가시킴으로써 완화될 수 있다. 증가된 미토콘드리아 H2O2는 주로 p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) 및 FOXO 전사인자 계열의 활성을 조절함으로써 쥐 조혈모줄기세포의 분화를 유도한다. 또한, 방사선이 치사수준으로 조사된 쥐(lethally irradiated mice)에 조혈모줄기세포를 이식 후, 초기 증식과 호밍(homing) 동안 미토콘드리아 H2O2 수준의 증가가 필요하며, 이는 활성산소가 골수(bone marrow) 미세환경에서 조혈모줄기세포 호밍에 필수적일 수 있음을 나타낸다. 그림 3. ROS는 줄기세포의 운명과 기능을 조절한다. a. 미토콘드리아 전자전달계와 세포질 NADPH 산화효소(NOX)는 세포에서 superoxide radical (O2_)을 생성하는 두 가지 주요 부위이다. 미토콘드리아 복합체 I은 미토콘드리아 기질에서만 O2_를 생성하는 반면, 복합체 III는 기질과 막간 공간 모두에서 O2_를 생성한다. 생성 직후, O2_는 superoxide dismutases (SOD2 in the matrix, SOD1 in the intermembrane space and cytosol)에 의해 보다 안정적이고 막투과성인 H2O2로 전환된다. 또한 미토콘드리아 O2_는 voltage-dependent anion channels (VDAC)을 통해 미토콘드리아를 빠져나갈 수 있으며 세포질에서 H2O2로 전환된다. H2O2는 줄기세포의 운명과 기능에 중요한 산화 환원 민감성 단백질의 특정 황 함유 아미노산(주로 cysteine)을 산화시켜 기능, 안정성 및 세포 내 위치를 제어할 수 있다. 과량의 H2O2는 Fe2+ 산화와 결합된 Fenton 반응을 통해 hydroxyl radical (•OH)을 생성할 수도 있다. •OH는 다중불포화지방산(PUFA)을 산화시키고 ferroptosis에 의해 세포사를 유도할 수 있는 지질 과산화수소를 생성할 수 있다. 과도한 ROS는 독성이 있으므로 세포는 ROS 항상성을 유지하기 위해 peroxiredoxins (PRX) 및 glutathione peroxidases (GPX)와 같은 다른 ROS scavengers를 가지고 있다. (GSH, glutathione; GSSG, glutathione disulfide; QH2, ubiquinol; MOM, mitochondrial outer membrane; IM, intermembrane space; MIM, mitochondrial inner membrane.) b. 줄기세포는 self-renewal 능력의 유지를 위해 낮은 기초 수준의 ROS가 필요하다. FOXO 단백질은 다양한 ROS scavengers의 발현을 활성화하여 낮은 ROS 수준을 유지하는데 도움이 된다. ROS의 적당한 생리학적 증가는 전구 세포에 대한 운명 결정과 다른 세포 유형으로의 분화에 필요하다. 그러나, 과도한 ROS 축적은 줄기세포 고갈로 이어진다. (SC, stem cell; PC, progenitor cell; DC, differentiated cell.) 과도한 활성산소 축적은 줄기세포의 노화 및 세포자멸(apoptosis)뿐만 아니라, 휴면 상태의 소실(loss of quiescence) 및 줄기세포 고갈을 초래한다. 예를 들어, FOXO3 손실로 인한 활성산소 수준의 증가는 조혈모줄기세포 휴면 상태의 소실을 초래한다. 유사하게, ATM-deficient 쥐에서 증가된 활성산소 수준은 p38-MAPK 경로를 활성화하여 조혈모줄기세포 고갈을 유발하며, 이는 항산화제 또는 p38-MAPK 억제제로 장기간 치료하면 되돌릴 수 있다. 또한, 줄기세포의 미세환경은 휴면 상태와 분화 사이에서 활성산소 균형을 유지할 수 있다. 예를 들어, 골수에서 al-pha-smooth muscle actin (a-SMA)를 발현하는 단핵구(monocytes)와 대식세포(macrophage)의 드문 집단(rare population)이 정상 상태 조건(steady-state conditions)과 sublethal-irradiation 유발 스트레스 조건에서 조혈모줄기와 전구세포를 보호하는 것으로 밝혀졌다. a-SMA+ 단핵구와 대식세포는 높은 수준으로 cyclooxygenase 2 (COX2)를 발현하고, COX2 유래 prostaglandin E2 (PGE2)는 조혈모줄기세포에서 protein kinase AKT의 억제를 통해 활성산소 생성을 감소시킨다. 참고로, 낮은 활성산소 수준을 가진 조혈모줄기와 전구세포는 일반적으로 휴면 상태이며, 장기 repopulation 능력이 우수한 반면, 활성산소 수준이 높은 조혈모줄기와 전구세포는 단기 repopulation 능력이 있으며, 골수 분화에 대한 편향을 나타낸다. 또한, PGE2는 조혈모줄기세포와 전구세포의 케모카인(chemokines) CXCR4와 근처 기질 세포의 CXCL12의 발현을 증가시킨다. CXCR4-CXCL12의 상호 작용은 조혈모줄기세포의 휴면에 필수적이다. 또 다른 연구에 따르면, 조혈모줄기세포에서 발현되는 gap junctions의 connexin 구성 요소인 connexin-43 (Cx43)은 조혈모줄기세포에서 기질 세포(stromal cells)로 전달되는 활성산소에 의한 산화 스트레스 유발 노화(oxidative-stress-induced senescence)로부터 조혈모줄기세포를 보호한다. 미세환경의 낮은 산소 장력(tension)은 조혈모줄기세포의 활성산소 수준을 낮게 유지하는데 도움이 된다. 예를 들어, perisinusoidal 골수 영역에는 투과성이 낮은 동맥 혈관이 포함되어 있어 쥐의 휴면 조혈모줄기세포에서 활성산소 수준을 낮게 유지하는데 도움이 된다. 반면에, 투과성이 더 높은 sinusoids (가는 혈관)는 활성산소 수준을 높이고, 조혈모줄기와 전구세포의 활성화, 이동 및 분화를 유도한다. 따라서, 세포는 자기 재생 능력과 기능을 보호하기 위해 줄기세포에서 비정상적인 활성산소 수준을 방지해야 한다. LOOH는 줄기세포의 주요 독성 활성산소일 가능성이 있지만, LOOH 생성을 방지하는 유전적 개입으로 검증될 필요가 있다. 앞으로의 연구는, H2O2 또는 다른 활성산소가 줄기세포의 운명과 기능을 유지하기 위한 경로를 구체적으로 표적화하는 방법에 대해 상세히 규명할 필요가 있다. 5. TCA 회로 대사산물에 의한 줄기세포 운명의 조절 다른 세포와 마찬가지로 줄기세포의 정체성과 기능은 주로 유전자 발현 프로파일에 의해 결정된다. 진핵세포에서 유전자 전사는 전사인자와 염색질(chromatin) remodelers 및 modifiers 간의 정교한 조정을 통해 제어된다. DNA와 뚜렷한 히스톤 메틸화(methylation)는 종종 성체 줄기세포의 self-renewal능력을 촉진하는 반면, 탈메틸화(demethylation)는 줄기세포 활성화와 증식 및 분화를 초래한다. 다양한 TCA 회로 대사산물은 많은 염색질 변형 효소(chromatin-modifying enzymes)의 기질이며, 염색질 변형을 제어하여 유전자 발현을 조절할 수 있다 (그림 4). 예를 들어, 활성 염색질 변형인 히스톤 아세틸화(acetylation)는 histone acetyltrans-ferases (HAT)에 의해 촉매되며 기질로 acetyl-CoA가 필요하다. 마찬가지로, DNA와 히스톤 메틸화 및 탈메틸화는 유전자 발현 조절과도 관련이 있다. 단계적 산화를 촉매함으로서 시토신(cytosine) 메틸화 역전에 참여하는 Jumonji-C-도메인 함유 ten-eleven Translocation (TET) 효소와 히스톤 탈메틸화효소(JmjC-domain-containing histone demethylases, JHDM)는 a-ketoglutarate (a-KG) 의존성 dioxygenases이며 줄기세포 운명 및 기능의 주요 조절자이다. a-KG와 구조적으로 유사한 succinate, fumarate 및 2-hydroxyglutarate (D 및 L 동형 모두)는 TET 및 JHDM을 경쟁적으로 억제하여, 유전자 발현을 조절할 수 있다. 또한 미토콘드리아 1 탄소 대사(one-carbon metabolism, 1CM)는 히스톤과 DNA 메틸화에 필요한 S-adenosylmethionine (SAM)의 cellular pool에 기여한다. 유사하게 전사 후 유전자 발현을 조절하는 RNA N6-methyladenosine 메틸화 및 탈메틸화는 각각 SAM 및 a-KG에 의해 조절될 수 있다. 본 리뷰에서는 포유류 배아 및 성체 줄기세포 운명의 조절에서 두 TCA회로 중간체인 acetyl-CoA 및 a-KG의 역할에 초점을 맞추었다. 히스톤 아세틸화(histone acetylation)에 필요한 세포질 acetyl-CoA는 각각 citrate와 acetate를 기질로 사용하는 ATP citrate lyase (ACLY) 및 acyl-CoA synthetase short-chain family member 2 (ACSS2)에 의해 생성된다. 쥐 및 hPSC는 DNA 저메틸화(hypomethylation), 풍부한 활성 히스톤 변형 (예: H3 and H4 acetylation and H3K4 trimethylations) 및 낮은 이질염색질(heterochromatin)을 특징으로 하는 개방형 염색질 구조를 갖는다. 이 독특한 염색질 상태를 유지하기 위해 PSC는 분화된 세포에 비해 뚜렷한 대사 요구 사항을 가지고 있다. 예를 들어, 만능줄기세포는 풍부한 히스톤 아세틸화 마크와 만능성 및 self-renewal 능력을 유지하기 위해 높은 acetyl-CoA 수준을 필요로 한다. 그러나, acetyl-CoA의 공급원은 인간 만능줄기세포와 쥐 배아줄기세포(mouse embryonic stem cell, mESC) 간에 서로 다르다. mESC에서 포도당과 트레오닌(threonine) 이화작용(catabolism)은 높은 acetyl-CoA 수준에 기여한다. 참고로, 트레오닌 이화작용은 미토콘드리아에서 acetyl-CoA와 글리신(glycine)을 생성하며, mESC는 이 과정에 크게 의존한다. 반면에, hPSC에는 트레오닌 탈수소 효소(threonine dehydrogenase, TDH)가 부족하며, acetyl-CoA는 주로 포도당 유래 피루브산에서 생성된다. hPSC에서 미토콘드리아 acetyl-CoA는 cit-rate 형태로 세포질로 방출된다. Citrate는 ACLY 효소에 의해 acetyl-CoA로 다시 전환되며 H3K9/K27 아세틸화에 필요하다. 대조적으로, hPSC의 초기 분화 동안 해당 과정에서 파생된 ace-tyl-CoA는 citrate를 통해 세포질로 방출되지 않으며, H3K9/K27 아세틸화 지표의 손실과 관련이 있다. 중요한 것은 acetyl-CoA의 전구체인 acetate를 처리하면 H3K9/K27 아세틸화 지표가 증가하고 hPSC 및 mESC의 초기 분화가 지연되므로 acetyl-CoA 수준의 감소는 아마도 히스톤 아세틸화 표시를 감소 시켜 염색질에 대한 접근성을 떨어뜨림으로써, PSC의 초기 분화를 유도한다는 것을 나타낸다. 반대로, 성체 줄기세포에서 ACLY에 의해 생성된 acetyl-CoA는 부분적으로 유전자 발현의 히스톤-아세틸화-매개 조절을 통한 분화에 필요하다. 따라서, TCA- 사이클 생성 acetyl-CoA는 mESC 및 hPSC의 줄기세포능 및 성체 줄기세포의 분화를 제어한다. 그림 4. TCA 주기 대사산물과 NAD+/NADH 비율은 염색질 변형을 통해 줄기세포의 운명과 기능을 조절한다. Citrate-derived acetyl-CoA는 histone acetyltransferases (HAT)의 기질이다. NAD+-dependent histone deacetylases인 sirtuin은 histone acetyl marks를 제거할 수 있다. 미토콘드리아는 sirtuin의 활성을 조절하는 세포 NAD+/NADH 비율의 핵심 조절자이다. 유사하게, 미토콘드리아 1탄소 대사(1CM)는 histone & DNA methyl-transferases (각각 KMT 및 DNMT)의 기질인 S-adenosyl methionine (SAM)의 생산에 기여한다. 또한 cytosine methylation의 역전(reversal)과 관련된 Jumonji-C-domain-containing ten-eleven translocation (TET) 효소 및 histone demethylases (JHDM)는 α-KG를 필요로 하며, 이들 효소는 succinate, fumarate 및 L-2-HG에 의해 경쟁적으로 억제될 수 있다. (OAA, oxaloacetate; MPC, mitochondrial pyruvate carrier; ACLY, ATP citrate lyase; LDH, lactate dehydrogenase; MDH1, malate dehydrogenase 1; MDH2, malate dehydrogenase 2; PDH, pyruvate dehydrogenase; TDH, threonine dehydrogenase.) DNA와 히스톤 메틸화는 메틸 공여자인 SAM에 의해 진행된다. Naïve hPSC는 활성 염색질의 특징적인 표시인 H3K4 트리메틸화(trimethylation)를 조절하기 위해 SAM 수준을 제어한다. 그러나, SAM은 naïve hPSC에서 낮은 수준으로 유지되어, 억제성 H3K27 트리메틸화 지표도 낮은 수준으로 유지한다. SAM을 소비하는 Nicotinamide N-methyltransferase (NNMT) 효소는 hPSC에서 상향 조절되며, SAM 및 H3K27 트리메틸화 마크를 낮은 수준으로 유지하는데 필요하다. Nicotinamide N-methyltransferase (NNMT)의 knockdown은 SAM 수준과 H3K27 트리메틸화 지표를 증가시키고, HIF를 활성화하고, Wnt 신호를 억제하며, naïve 상태에서 primed 상태로 전환을 유도한다. 반면에, JHDM과 TET는 a-KG를 기질로 사용한다. a-KG는 naïve와 primed된 포유류 PSC의 운명에 다른 영향을 미친다. naïve mESC는 일반적으로 글루타민과 포도당 이화작용을 통해 높은 수준의 a-KG를 유지한다. Naïve mESC는 높은 a-KG/succinate 비율과 DNA 및 히스톤 저메틸화를 나타내어 고도로 접근 가능한 유전체를 유지한다. 글루타민은 naïve PSC 배양에 없어서는 안되지만, 글루타민이 없는 배지에서 배양된 naïve mESC는 a-KG 수준이 감소하고, 총 트리메틸화가 증가하며 H3K9, H3K27, H3K36 및 H4K20 잔기에서 총 모노메틸화(monomethylations)가 감소한다. 중요한 것은 세포 투과성 dimethyl a-KG (DMKG)로 처리하면, mESC에서 H3K27 및 H4K20 트리메틸화 지표의 증가가 역전되므로 트리메틸화의 증가가 실제로 세포의 a-KG 수준 감소로 인해 발생한다는 것이 확인된 바 있는 것이다. 또한, naïve mESC의 자발적인 분화 동안에도 a-KG 수준이 감소하고, cell-permeable dimethyl a-KG (DMKG) 처리로 인해 유전자좌에서 DNA 및 히스톤 탈메틸화가 활성화되어, 만능성인자 발현의 억제를 늦춤으로써 분화를 지연시킬 수 있다. 또한, DMKG는 mESC 만능성 및 self-renewal 능력을 촉진하는 것으로 나타났다. naïve mESC의 세포 내 a-KG 수준은 만능성을 유지하도록 phos-phoserine aminotransferase 1 (Psat1) 효소에 의해 조절된다. Psat1의 발현은 핵심 만능성 인자 Oct4, Sox2 및 Nanog에 의해 조절된다. Psat1은 3-phosphohydroxy-pyruvate와 glutamate의 3-phosphoserine 및 a-KG로의 전환을 결합하는 de novo serine 합성 경로의 효소이다. 대조적으로, a-KG 수준의 증가는 primed hPSC 및 쥐 EpiSC (mEpiSC)의 분화를 촉진하는 반면, 글루타민으로부터 a-KG 생산의 억제는 primed hPSC 분화를 지연시킨다. Succinate 축적, succinate dehydrogenase A (SDHA)의 약리학적 억제 또는 genetic knockdown에 의해 유도된 a-KG/succinate 비율의 감소는 primed hPSC 분화를 지연시킨다. 이 효과는 a-KG/succinate 비율을 증가시키는 DMKG 처리에 의해 완화될 수 있다. 또한, a-KG/succinate 비율의 증가 또는 감소는 TET 및 JHDM 효소를 각각 활성 또는 억제함으로써, primed PSC의 운명을 조절하는 것으로 보인다. Self-renewing 성체 줄기세포는 종종 저산소(hypoxic) 미세환경에 상주하며 일반적으로 해당 작용을 한다. 저산소증은 미토콘드리아 전자전달계 기능을 감소 시켜, L-2-hydroxyglutarate (L-2-HG)와 succinate 축적을 증가시킨다. 결과적으로 높은 succinate/a-KG 또는 L-2-HG/a-KG 비율은 각각 TET 및 JHDM 효소의 활성을 저해하고 DNA 및 히스톤 탈메틸화를 억제함으로써, 성체 줄기세포의 self-renewal 능력을 유지하는데 도움이 될 수 있다. 대조적으로, 활성화된 성체 줄기세포에서 관찰된 바와 같이 상승된 OXPHOS는 일반적으로 a-KG 수준을 증가시키고, succinate 또는 L-2-HG 수준을 감소시켜 히스톤 및 DNA 탈메틸화를 유발함으로써, 줄기세포 활성화, 증식 및 분화를 가능하게 한다. 이 분야에서 충분히 해결되지 않은 핵심적인 질문은 이러한 대사산물(acetyl-CoA, a-KG, succinate, fumarate, and L- or D-2-HG)의 변화가 특정 유전자좌에서 특정 히스톤 아세틸화 및 메틸화 지표 및 DNA 메틸화 지표를 수정하여, 줄기세포 운명을 결정하는데 필요한 유전자 발현을 조절하는 방법이 무엇인지이다. 6. NAD+/ NADH 비율은 줄기세포의 운명과 기능을 조절한다. TCA 사이클은 OXPHOS에 연료를 공급하기 위해 각각 전자전달계 복합체 I 및 II에 의해 NAD+ 및 FAD로 순차적으로 산화되는 환원 등가물 NADH 및 FADH2를 생성한다. 따라서, 미토콘드리아는 줄기세포를 포함한 다양한 세포 유형의 운명과 기능을 조절할 수 있는 세포 NAD+/ NADH 비율의 중요한 조절자 역할을 할 수 있다. PSC 및 성체 줄기세포의 운명과 기능은 다른 단백질에서 다양한 acyl groups (e.g., acetyl, succinyl, malonyl, glutaryl, or long-chain acyl groups)을 제거하는 NAD+-dependent deacylases의 부류인 sirtuins에 의해 조절될 수 있다. 포유류에는 7개의 sirtuins (SIRT1-SIRT7)이 있으며 특정 세포 위치에 존재한다. SIRT1 및 SIRT2는 핵 또는 세포질에 위치하는 반면 SIRT6 및 SIRT7은 핵 단백질이다. SIRT3, SIRT4 및 SIRT5는 미토콘드리아 매트릭스에서 발견된다. mESC와 hPSC는 모두 증가된 SIRT1 단백질 수준을 갖고, 분화 중에 감소하며, SIRT1은 naïve mESC 만능성을 유지한다. SIRT2와 SIRT6 모두 PSC의 적절한 lineage commitment에 필요하다. 그러나 현재까지, 미토콘드리아 NAD+/ NADH 비율의 변화가 줄기세포 운명을 조절하기 위해 이러한 핵 SIRT를 제어하는지 여부는 명확하지 않다. 미토콘드리아 복합체 I는 NAD+를 재생하는 능력을 가지고 있어 미토콘드리아 기질에서 단백질의 SIRT3 의존성 아세틸화를 조절한다. 조혈모줄기세포는 SIRT3가 풍부하다. 나이가 들어감에 따라 SIRT3 발현이 감소하고, 노화된 쥐의 SIRT3 손실은 조혈모줄기세포 pool을 감소시키며, 연속 적인 이식 스트레스(serial transplantation stress) 시 조혈모줄기세포 self-renewal를 손상시킨다. 또한 SIRT3 과발현은 산화 스트레스를 줄이고, 노화된 조혈모줄기세포의 기능적 결함을 완화시킨다. 유사하게, 노화된 쥐의 골격근 줄기세포는 미토콘드리아 기능 장애와 낮은 NAD+ 수준을 나타낸다. NAD+의 전구체인 nicotinamide riboside (NR)를 사용한 치료는 골격근 줄기세포의 미토콘드리아 기능 개선과 함께 노화로부터 보호하고, 골격근 줄기세포의 수를 증가 시키며, 근육 재생 능력을 향상시킨다. 또한 NR 치료는 신경줄기세포와 멜라닌 줄기세포(melanocyte stem cells)를 노화로부터 보호한다. 그러나, NR 치료의 유익한 효과는 골격근 줄기세포에서 SIRT1이 없는 쥐에서 사라져 이 과정에 SIRT1이 필요함을 나타낸다. 휴면 상태의 골격근 줄기세포의 활성화는 FAO에서 해당 과정으로의 전환을 수반하여 세포 NAD+ 수준과 SIRT1 활성을 감소시킨다. 쥐에서 SIRT1의 deacetylase domain의 결실은 조기 골격근 줄기세포 분화를 유도하고 근육 재생을 손상시킨다. 전체 NAD+ 수준은 부분적으로 NAD+ 인양 경로의 속도 제한 효소인 NAMPT (nicotinamide phosphoribosyltransferase)에 의해 제어되며, 이는 쥐 해마를 포함한 여러 조직에서 나이에 따라 감소한다. 성체 신경 줄기 및 전구 세포에서 NAMPT의 결실은 nicotinamide mononucleotide (NMN; a precursor of NAD+) 보충에 의해 완화될 수 있는 oligodendrocytes의 self-renewal, 증식 및 생성 능력을 감소시킨다. 이러한 연구는 NAD+가 정상적인 노화 과정에서 줄기세포 운명의 주요 조절자임을 강조한다. 미토콘드리아 NAD+/ NADH 비율이 줄기세포 기능에 영향을 미칠 수 있는 직접적인 방법 중 하나는 L-2-HG를 생성하는 것이다. 미토콘드리아 전자전달계 손상, 산도(acidity) 또는 저산소증은 NAD+ 재발생을 저해하여 NAD+/NADH 비율을 감소시키고 L-2-HG 수준을 증가시킨다. D-2-HG와 달리 돌연변이 isocitrate dehydrogenases (IDH1 / 2), lactate dehydrogenases (LDHA 및 LDHC), 세포질 및 미토콘드리아 malate dehydrogenases (각각 MDH1 및 MDH2)에 의해 생성된 암 대사산물은 a-KG를 무차별 기질로 사용하고 NADH를 조효소로 사용하여 L-2-HG를 생성할 수 있다. α-KG와 구조적으로 유사하기 때문에 L-2-HG는 JHDM 및 TET를 포함한 α-KG 의존성 dioxygenases를 경쟁적으로 억제할 수 있다. a-KG는 히스톤과 DNA 메틸화를 조절하여 줄기세포의 운명과 기능을 조절할 수 있기 때문에 L-2-HG는 줄기세포 생물학의 주요 조절자일 수도 있다. 태아 쥐 조혈모줄기세포에서 미토콘드리아 전자전달계 복합체 III 소단위 Rieske iron-sulfur protein (RISP)의 손실은 NADH/ NAD+ 비율을 증가시키고, 재생 능력에 영향을 주지 않으며, MPP로의 분화를 손상시키는 수준의 L-2-HG를 유발하여, 결과적으로 배아 치사(embryonic lethality)를 초래한다. 성체 쥐 조혈모줄기세포에서 RISP의 손실은 휴면 상태를 방해하고, 심각한 범혈구감소증(pancytopenia)과 치사를 유발한다. RISP가 결핍된 조혈모줄기세포는 DNA와 히스톤 과메틸화(hypermethylation)뿐만 아니라, 히스톤 저아세틸화(hypoacetylation)를 보여준다. 흥미롭게도, 암 유전적으로 형질전환된 조혈모줄기세포에서 미토콘드리아 복합체 III 기능의 손실은 증식과 종양 진행을 감소 시켜, 정상 조혈모줄기세포와 암 유전적으로 형질전환된 조혈모줄기세포 사이의 미토콘드리아 의존적 증식 경로를 강조한다. 종합적으로, 이러한 연구는 미토콘드리아 복합체 III이 조혈모줄기세포의 증식에 없어서는 안되지만, HSC 분화 및 휴면 상태의 지배적인 조절자임을 나타낸다. 증가된 L-2-HG가 후성유전학적 변형을 통해 분화 또는 휴면 상태의 소실을 손상시키는지는 알려져 있지 않다. ...................(계속) ☞ 자세한 내용은 내용바로가기 또는 첨부파일을 이용하시기 바랍니다.

유도만능줄기세포 기반 뇌 오가노이드를 이용한 질환 모델링 연구 ◈ 서론 뇌-신경 질환의 근본적인 메커니즘을 이해하는 것은 치료제 개발에 있어서 가장 중요한 문제이다. 사람의 뇌는 다양한 기능을 가진 세포와 이들간의 복잡한 network에 의하여 구성되어 있으며, 환경, 유전형 등 여러 요인들이 복잡하게 작용하여 뇌-신경질환이 발생하는 것으로 알려져 있다. 최근 급속도로 발전하고 있는 뇌-신경계의 다양한 연구에도 불구하고 아직까지 많은 뇌-신경 질환치료제의 개발에 어려움을 겪고 있으며, 이는 복잡한 뇌-신경 네트워크의 이해를 위한 다양한 접근법이 필요하다고 볼 수 있다 [1-2]. 이러한 시도로 진행된 여러 genome-wide association studies (GWAS)연구는 뇌-신경 질환에 영향을 미치는 다양한 유전적인 변이를 보고 하였다. GWAS 데이터를 기반으로 한 질병 모델링은 유전 변이와 뇌 질환 사이의 상관 관계를 비교적 정밀하게 제시할 수 있었으며, 최근 뇌 질환의 메커니즘을 이해하는 필수적인 기술로 자리 잡았다 [3-4]. 이러한 시도와 더불어 최근 뇌-신경 질환 연구의 새로운 질환 모델로 환자 특이적인 유도만능줄기세포 (induced pluripotent stem cells, iPSCs)를 기반으로 하는 2D 뉴런 분화 및 뇌 오가노이드가 주목받고 있다. 일반적으로 질환 동물 모델은 유전적 돌연변이에 의해 유발되는 뇌-신경질환의 모델에 주로 사용되었으나, 설치류의 경우 인간과 다른 뇌-신경 네트위크 구조 및 발달 과정 등에 의하여 정확한 인간의 뇌 질환 표현형의 재현에 어려움이 보고 되고 있다 [5]. 또한 실제 환자의 조직 등의 시료를 사용하는 경우에도 환자 조직의 가용성, 조작의 어려움, 윤리적인 문제들이 제시되고 있다 [6]. 이러한 문제점을 해결하기 위하여 환자의 iPSC를 기반으로 하는 2D 뉴런 분화 및 뇌 오가노이드가 그 대안으로 여겨지고 있으며 광범위한 연구가 진행되고 있다. 이번 리뷰에서는 여러 유전성 뇌-신경질환의 모델링을 위하여 사용되고 있는 뇌 오가노이드에 대한 여러 접근법에 대하여 다루도록 한다. ◈ 뇌 질환 연구를 위한 2D 분화 및 3D organoid 시스템 인간 iPSC를 사용한 뉴런 분화에 대한 첫 번째 연구는 2001년 Thomson 그룹에서 진행되었다 [7]. 해당 연구에서는 iPSC로부터 제작된 embryonic body (EB)에 fibroblast growth factor 2 (FGF-2)처리시 neural-tube를 형성하고 있는 neural rosette가 생성되는 것을 관찰하였다. 이후 여러 연구를 통하여 이러한 rosette가 ventricular radial glial cell, intermediate progenitor 및 outer radial glial cell등으로 둘러싸인 epithelial의 구조를 형성할 수 있는 것을 보여 주었으며, 이러한 구조는 인간의 뇌에서 볼 수 있는 ventricular zone (VZ) 및 subventricular zone (SVZ)과 유사함을 확인하였다 [8-9]. 이러한 분화 프로토콜은 점차 세분화되어 세로토닌 뉴런, 도파민 성 뉴런, 운동 뉴런, GABA 성 뉴런, 감각 뉴런 및 microglia 등의 특정 세포로 분화되는 프로토콜들이 확립되었다. 이와 같은 2D 배양 기반의 다양한 분화 기술은 기존의 뇌-신경질환의 메커니즘을 이해하는데 많은 기여를 했지만, 인간 뇌의 복잡성을 파악하는 데는 한계가 있었다. 특히 2D 기반의 배양기술은 뇌의 특정 영역만을 재현할 수 있으며, 이는 다양한 신경세포들의 네트위크를 파악하기에는 어려움이 있었다. 무엇보다 2D 배양을 위해서는 인위적인 세포 외 기질 (extra cell matrix, ECM)을 코팅할 필요가 있었으며, 이에 따른 세포와 ECM간의 상호작용은 실제 조직에서 보여주는 세포-세포 상호작용과는 일부 상이한 특성을 보이고 있다. 이러한 점을 극복하기 위하여 intestinal (내배엽) 및 kidney (중배엽) 오가노이드등의 기존에 개발된 분화 기술을 참조하여 뇌 오가노이드 기술이 개발되었다. 단지 내배엽/중배엽의 오가노이드와는 다르게 뇌 (외배엽)오가노이드는 성장신호인자(growth factor)를 제거로 부터 시작됨이 알려졌다. 일반적으로 뇌 오가노이드 분화는 패턴화 방식에 따라 두가지 접근법을 보인다. 먼저 외부의 조절 인자를 최소화 하는 방법으로 이를 통하여 self-guided 오가노이드 형태를 제작하는 방법이다. 다른 방법으로는 외인성 페터닝 방법으로 BMP, FGF, Nodal 및 Sonic Hedgehog등의 외인성 인자들을 추가하여 원하는 특정 영역의 오가노이드를 제작하는 방식이다 [10]. Self-guided 오가노이드의 경우는 Knoblich 그룹에서 처음 시도되었으며, 3D neuroepithelial spheroids를 matrigel에 embedded시킨후 hypoxia 및 spinning 환경에서 제작하는 방식으로 실제 인간 뇌의 발달 과정을 모방하였다 [11]. 외인성 페터닝 방법은 Sasai그룹 및 Pasca그룹에서 처음 시도되었으며, 다양한 외인성 인자를 사용하여 원하는 뇌 영역을 제작하는 방법이다 [12-13]. 이와 같은 뇌 오가노이드 기술은 최근 환자특이적인 iPSC와 접목되어 down 증후군, Rett 증후군 등의 다양한 뇌-신경계 질환에 적용되고 있다 (그림 1). 또한 최근에는 유전자가위 기술을 이용하여 좀 더 정밀한 질환 모델링이 가능해지고 있으며, 기존에 밝혀지지 않았던 다양한 치료 타겟을 제시할 것으로 기대되고 있다. ◈ 뇌 오가노이드의 한계와 가능성 뇌 오가노이드 기술은 기존의 2D 배양 및 동물모델에서 제공할 수 없었던 혁신적인 접근 방식을 제공하지만 극복해야 할 몇 가지 한계점이 존재한다. 첫째, 실제 인간 뇌의 복잡성과 재현성을 모두 만족하는 뇌 오가노이드를 제작하기 어려운 점이다. 일반적으로 복잡성을 최대한 구현하기 위해서는 다양한 방식의 외부인자를 기반으로 하는 외인성 페터닝 방식이 적용되고 있으나, 이는 필연적으로 배치간의 큰 변동성을 유발한다 [14]. 이와는 반대로 특정 부위만을 모방하는 뇌 오가노이드의 경우 배치간의 높은 재현성을 보여주지만, 뇌의 복잡한 영역들을 적절하게 표현할 수 없었다 [15]. 다른 한계는 뇌 오가노이드의 크기가 커짐으로써 발생할 수 있는 불충분한 산소 및 영양소 공급이다. 현재 개발된 대부분의 프로토콜의 경우 일반적인 확산에 의한 산소 및 영양소 공급 방법을 사용하고 있으며, 이는 뇌 오가노이드 중앙 부분에 충분한 공급이 어려워 조직의 괴사를 유발하는 것으로 알려져 있다. 최근에는 이러한 문제를 해결하기 위하여 혈관 등의 다른 세포와의 결합을 유도하는 프로토콜이 개발되고 있다 [16]. ◈ 결론 뇌 오가노이드 기술의 개발은 in vitro 시스템에서 인간 뇌의 발달 과정과 뇌-신경 질환에 대한 병인을 관찰할 수 있는 새로운 기회를 제공하였다. 최초의 뇌 오가노이드가 개발된 후 매우 짧은 시간에 광범위한 연구가 진행되고 있으며, 뇌-신경 질환 연구에 핵심 기술로 자리잡고 있다. 아직은 몇 가지 기술적인 한계로 인하여 모든 질환에 적용될 수 없으나, 나노 기술, 생체 재료 등의 다양한 방식과의 접목을 통하여 이러한 문제점을 해결하기 위한 연구들이 진행되고 있다. 멀지 않은 미래에 뇌 오가노이드 기술이 기존의 시스템을 통하여 확인하지 못하였던 뇌-신경 질환의 메커니즘을 규명하고 치료 타겟을 제시할 수 있을 것으로 기대한다. 그림1. 다양한 뇌-신경질환의 뇌 오가노이드를 이용한 모델링 ◈ 참고문헌 1Geschwind DH, Flint J (2015) Genetics and genomics of psychiatric disease. Science 349:1489-1494. https://doi.org/10.1126/science.aaa8954 2Llinares-Benadero C, Borrell V (2019) Deconstructing cortical folding: genetic, cellular and mechanical determinants. Nature Reviews Neuroscience 20:161-176. https://doi.org/10.1038/s41583-018-0112-2 3Sullivan PF, Daly MJ, O’Donovan M (2012) Genetic architectures of psychiatric disorders: the emerging picture and its implications. Nat Rev Genet 13:537-551. https://doi.org/10.1038/nrg3240 4Grove J, et al. (2019) Identification of common genetic risk variants for autism spectrum disorder. Nat Genet 51:431-444. https://doi.org/10.1038/s41588-019-0344-8 5Rosenthal N, Brown S (2007) The mouse ascending: perspectives for human-disease models. Nat Cell Biol 9:993-999. https://doi.org/10.1038/ncb437 6Quadrato G, Brown J, Arlotta P (2016) The promises and challenges of human brain organoids as models of neuropsychiatric disease. Nature Medicine 22:1220-1228. https://doi.org/10.1038/nm.4214 7Zhang S-C, Wernig M, Duncan ID, Brüstle O, Thomson JA (2001) In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol 19:1129-1133. https://doi.org/10.1038/nbt1201-1129 8Shi Y, Kirwan P, Smith J, Robinson HPC, Livesey FJ (2012b) Human cerebral cortex development from pluripotent stem cells to functional excitatory synapses. Nature Neuroscience 15:477-486. https://doi.org/10.1038/nn.3041 9Edri R, Yaffe Y, Ziller MJ, Mutukula N, Volkman R, David E, Jacob-Hirsch J, Malcov H, Levy C, Rechavi G, Gat-Viks I, Meissner A, Elkabetz Y (2015) Analysing human neural stem cell ontogeny by consecutive isolation of Notch active neural progenitors. Nat Commun 6:6500. https://doi.org/10.1038/ncomms7500 10Clevers H (2016) Modeling Development and Disease with Organoids. Cell 165:1586-1597. https://doi.org/10.1016/j.cell.2016.05.082 11Lancaster MA, Knoblich JA (2014) Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc 9:2329-2340. https://doi.org/10.1038/nprot.2014.158 12Kadoshima T, Sakaguchi H, Nakano T, Soen M, Ando S, Eiraku M, Sasai Y (2013) Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. PNAS 110:20284-20289. https://doi.org/10.1073/pnas.1315710110 13Paşca AM, Sloan SA, Clarke LE, Tian Y, Makinson CD, Huber N, Kim CH, Park J-Y, O’Rourke NA, Nguyen KD, Smith SJ, Huguenard JR, Geschwind DH, Barres BA, Paşca SP (2015) Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nature Methods 12:671–678. https://doi.org/10.1038/nmeth.3415 14Lancaster MA, Renner M, Martin C-A, Wenzel D, Bicknell LS, Hurles ME, Homfray T, Penninger JM, Jackson AP, Knoblich JA (2013) Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature 501:373-379. https://doi.org/10.1038/nature12517 15Velasco S, Kedaigle AJ, Simmons SK, Nash A, Rocha M, Quadrato G, Paulsen B, Nguyen L, Adiconis X, Regev A, Levin JZ, Arlotta P (2019) Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature 570:523. https://doi.org/10.1038/s41586-019-1289-x 16van Duinen V, Trietsch SJ, Joore J, Vulto P, Hankemeier T (2015) Microfluidic 3D cell culture: from tools to tissue models. Current Opinion in Biotechnology 35:118-126. https://doi.org/10.1016/j.copbio.2015.05.002 저자약력 2001-2005성균관대학교 약학대학, 학사 2005-2007성균관대학교 약학대학, 석사 2007-2011성균관대학교 약학대학, 박사 2012-2018Stanford University School of Medicine, Post-doc/연구교수 2018-현재성균관대학교 약학대학, 조교수 2020-현재Imnewrun Biosciences Inc, 부사장/팀리더 ☞ 자세한 내용은 내용바로가기 을 이용하시기 바랍니다.

상피-중간엽(epithelial-mesenchymal) niche가 줄기세포 분화에 미치는 영향 ◈ 요약문 최근의 줄기세포 연구들, 특히 상피줄기세포에 대한 연구들은 줄기세포가 주변의 미세환경에 의해 크게 좌우되는 양방성의 역동적인 상태에 있음을 보여준다. 줄기세포의 미세환경은 “niche”라 불리며 이는 줄기세포와 줄기세포로부터 분화되어 나온 상피성 자손세포(progeny), 그 주위를 둘러싸고 있는 다양한 중간엽성 세포들 그리고 세포외기질들로 구성된다. 본 글은 위장관의 발생과 위장상피의 항상성 유지 및 재생과정에 관해 축적된 다양한 연구들을 살펴봄으로써 상피-중간엽 niche가 줄기세포에 미치는 영향을 살펴보고자 하였다. 발생학적 연구들은 선구적인 실험들을 통해 장의 상피와 중간엽의 기원이 되는 내배엽과 중배엽 간 상호작용을 조직 수준에서 일찍이 규명하였다. 하지만, 발생과정의 역동적인 변화를 개별 세포 수준에서 설명하는 데는 어려움이 있었다. 이후 발생과정에 비해 비교적 그 변화는 덜하면서도 성체에서 그 과정을 일부 재현하는 재생과정에 대한 연구가 활발해 지면서 줄기세포와 그 주변 세포들 간의 상호작용에 대한 구체적인 그림이 그려지기 시작한다. 이 연구들에 따르면 위장관의 발생은 초기에서부터 Hh, BMP, Wnt, Notch 등의 신호전달계를 통한 내배엽과 중배엽 간의 상호작용에 의해 이뤄지며, 발생 이후에도 동일한 기작을 바탕으로 한 상피-중간엽 간의 상호작용을 통해 장기의 항상성이 유지되고 재생이 일어난다. 재생과정의 연구로부터 밝혀진 세포 간의 상호작용기작은 더욱 복잡한 발생과정을 줄기세포와 niche 세포들 간의 상호작용이라는 관점에서 다시 이해할 수 있는 기초를 제공할 것으로 보인다. ◈ 목차 1. 서론 2. 본론 2.1. 발생과정 중 내배엽과 중배엽 간 상호작용 2.1.1. 위장관의 발생 2.1.2. 위장관 발생과정 중 내배엽과 중배엽 간 상호작용 2.2. 발생 이후 상피-중간엽 niche의 역할 2.2.1. 장상피 항상성 유지와 상피-중간엽 niche의 역할 2.2.2. 위상피 항상성 유지와 상피-중간엽 niche의 역할 3. 결론 4. 참고문헌 ◈ 본문 1. 서론 줄기세포는 오랜 기간동안 자기복제를 할 수 있으며 다양한 세포로 분화할 수 있는 능력을 가진 세포로 정의된다 [1, 2]. 배아 발생에 대한 연구 그리고 조혈줄기세포에 대한 연구들은 다분화능을 가지며 자가복제를 하는 줄기세포가 transit-amplifying 세포를 거쳐 최종분화단계에 도달한다는, 단방향성의 계층적 분화경로(unidirectional, hierarchal differentiation trajectory)를 제시하였다 [3]. 조직 내 엄격한 세포계층(cell hierarchy)을 강조하는 이 전통적인 개념에 따르면 줄기세포들은 계통계층(lineage hierarchy)의 맨 꼭대기에 위치하며, 일단 분화가 시작되면 그 과정은 비가역적으로 진행된다 [4]. 하지만 최근의 줄기세포 연구들, 특히 상피줄기세포에 대한 연구들은 줄기세포가 주변의 미세환경에 의해 크게 좌우되는 양방성의 역동적인 상태에 있음을 보여주었다 [5]. 상피는 신체의 표면 혹은 장기 및 관(tract)과 강(cavity)의 경계를 이루는 최전방의 보호막으로써 탈락되거나, 손상된 세포들을 빠르게 대체할 수 있는 재생능력을 가져야 한다. 상피줄기세포는 환경변화에 대응하기 위해 높은 가소성과 적응력을 가지며 주변환경, 즉. niche와 활발한 상호작용을 통하여 자신의 상태를 결정한다 [6, 7]. ...................(계속) ☞ 자세한 내용은 내용바로가기 또는 첨부파일을 이용하시기 바랍니다.

[BRIC View 리뷰논문요약] 근육 줄기세포 지지 그룹: 근육 재생 과정 중 조직적인 세포 반응 최정문(Georgia Institute of Technology) 요약문 골격근은 조직 특이적인(tissue-specific) 근육 줄기세포 덕분에 뛰어난 조직 재생 능력을 가지고 있다. 그러나, 효과적으로 조직을 재생하기 위해서는 국소적인 환경(local milieu)에 존재하는 다른 세포들의 존재와 역할 역시 중요하다. 이 리뷰에서는 골격근 재생에 기여하는 추가 세포들을 논평한다. Key Words 근육 줄기세포 (muscle stem cell), 골격근 재생 (muscle regeneration), 국소적 환경(local milieu) 본 자료는 A Muscle Stem Cell Support Group: Coordinated Cellular Responses in Muscle Regeneration Dev. Cell 46(2) 2),135 143 (2018 의 논문을 한글로 번역 , 요약한 자료입니다 [목 차] 1. 서론 2. 근육 줄기세포(Muscle stem cells; MuSCs) 2.1. 근육 줄기세포 2.2. 줄기세포 지지 그룹 : 조직 재생 환경의 세포들 2.3. 근육성 세포로의 분화능(Myogenic potential) 을 갖는 간질 세포 (Interstitial cells) 3. 섬유 지방성 전구세포(Fibro adipogenic progenitors; FAPs) 4. 면역 세포 4.1. 대식 세포 4.2. 추가 면역 세포 : 호산구(Eosinophils), 조절 T 세포(Regulatory T cells), 호중구(Neutrophils) 5. 내피 세포(Endothelial cells) 6. 주피 세포 (Pericyte) 7. 결론 1. 서론 골격근은 신체 총 질량의 약 35% 를 차지하는 가장 큰 기관계이다 움직임에 필요한 에너지를 생성하고 저장할 뿐만 아니라 조직의 손상 시에 뛰어난 재생 능력을 갖는다는 특징이 있다 재생 과정은 고도로 조직적인 세포 과정 (cellular process) 이며 , 염증 반응으로 시작해 괴사 주기를 거쳐재생 단계로 이어진다 원인을 불문하고 적절한 조직 재생이 필요 시에 일어나지 않는다면 생물체에 심각한 영향을 미치게 되므로 부상 이후 일어나는 근육 재생에 대해 구조적 , 기능적인 측면에서많은 연구가 이뤄져 왔다. 이 리뷰의 목적은 부상 이후의 세포 과정 cellular process) 을 설명하 는 것이며 구체적으로는재생 중 근육 줄기세포 (muscle stem cells; 기능에 영향을 미치는 비 근육성 세포 nonmyogenic cells) 들에 대해 알아보는 것이다. 이에 앞서 재생 과정에서 가장 주목받고 연구가 많이 이루어진 MuSCs 에 대해 간단히 리뷰하고 넘어가겠다 ...................(계속) ☞ 자세한 내용은 내용바로가기 또는 첨부파일을 이용하시기 바랍니다.

[BRIC View 리뷰논문요약] 임상적용을 위한 생물공학적 기술을 이용한 줄기세포 배양법 한민준(아스트라제네카) 요약문 유도 만능 줄기세포(induced pluripotent stem cells)가 여러 가지 다양한 질병의 치료를 위한 제품으로 사용되기 위해서는 대량생산(large scale production)이 필수적으로 요구된다. 하지만, 현재까지 개발된 유도 만능 줄기세포의 배양 조건은 MEF (mouse embryonic fibroblastfeeder), matrigel, vitronectin과 같은 기질(matrix)의 사용이 요구되며 이러한 배양 조건은 유도 만능 줄기세포의 특성인 다분화능의 상태(pluripotent state)에 큰 영향을 미치게 되어 그동안 임상시험에 필요한 대량생산에 큰 문제점 중의 하나였다. 따라서 임상시험에 필요한유도 만능 줄기세포의 대량생산의 개발은 필연적으로 여러 줄기세포의 특성(다분화능, 세포성장, 세포 생존능력)을 실시간으로 모니터하면서 측정할 수 있는 방법들과 함께 공동으로개발되었다. 더군다나 이러한 줄기세포의 대량생산을 위해서는 세포가 기질에 부착되어 배양하는 2D 방식이 아닌 세포가 배양액에 부유하면서 배양하는 3D 방식의 세포배양법이 반드시 필요하다. 본 리뷰에서는 이러한 대량생산에 필요한 다양한 세포 배양액(cell culturemedia), 부유 생산 방식(suspension modalities), 생산에 필요한 품질관리(quality control)와모니터 기술들에 대해 논의하고자 한다. Key Words: iPSC, Bioprocess, large-scale production 본 자료는 Bioprocess Technologies that Preserve the Quality of iPSCs. Trends Biotechnol.(2020).의 논문을 한글로 번역, 요약한 자료입니다. 목 차 1. 줄기세포 생산의 도전 과제들 2. 최적화된 유도 만능 줄기세포 배양법의 개발 3. 유도 만능 줄기세포의 부유배양생산을 위한 주요 고려 사항들 3.1. Aggregates 3.2. Microcarriers 3.3. Microencapsulation 4. 유도 만능 줄기세포 생산에 필요한 품질관리(QC)5. 결론 1. 줄기세포 생산의 도전 과제들 줄기세포와 연관된 다양한 세포치료 방법은 그동안 여러 분야(종양학, 심장병학, 면역학그리고 신경학)에서 시도되었고 임상시험을 통해서도 좋은 결과를 보여주고 있다. 먼저 배아줄기세포(embryonic stem cell)는 pluripotency와 self-renewal 같은 줄기세포가 가지고 있는 특성을잘 간직한 세포이기에 이를 이용한 세포치료의 좋은 모델이었다. 그렇기 때문에 배아 줄기세포를처음 발견하였을 때부터 재생의학의 적용을 고려 해왔고, 실제로 많은 긍정적인 결과를나타냄으로써 오랜 시간 세포치료의 훌륭한 재료로 사용되어왔다. 2007년 Dr. Yamanaka와 그의동료들이 인간의 체세포를 역분화 시켜 처음으로 배아줄기세포와 매우 유사한 줄기세포를성공적으로 생산해내는 기념비적인 기술을 선보였다. 이 줄기세포는 나중에 “유도 만능줄기세포(induced pluripotent stem cell)”라 명명되어졌다. 인간의 배아를 희생해서 생성할 수 밖에없는 배아줄기세포와 비교하여 윤리적 종교적 문제에서 자유로운 유도 만능 줄기세포는 다양한연구와 치료에 매우 적합한 환경을 제공할 뿐 아니라 상대적으로 낮은 면역 거부 반응 보여준다.또한 환자 유래의 줄기세포라는 관점에서 여러 가지 다양한 유전적 질병의 모델로 사용이 가능하며 이러한 모델을 이용하여 신약개발과 임상시험의 기회를 제공해 줄 수 있다. 또한, 이러한줄기세포의 특성을 이용하여 환자 유래의 세포를 무한정 제공할 수 있기에 세포치료의 좋은 재료로사용될 수 있다. 앞서 말한 여러 가지 장점들로 인해 유도 만능 줄기세포 기술은 재생의학과 맞춤형치료의 무한한 잠재력을 보여주고 있다. 현재 한 번의 세포치료를 위해서는 cGMP (current GoodManufacturing Practice) 환경에서 배양된 10^8 -10^10 개 이상의 많은 세포가 필요하다. 하지만,줄기세포는 세포 배양시 기질(matrix) 의존도가 높으며 이러한 배양 환경에 따라서 줄기세포의특성을 쉽게 잃어버리는 성질로 인하여 기존의 세포배양법을 적용하여 대량생산을 이루어 내기가어렵다. 따라서 이러한 줄기세포의 대량생산은 우리가 직면하고 있는 커다란 당면과제 중 하나이다. 또한 생산된 유도 만능 줄기세포의 품질 또한 배양과정에서 우리가 면밀하게 관찰하여야한다. 세포 치료를 위한 생산 및 배양과정 중 줄기세포의 특성들(pluripotency와 self-renewal)을 잃지않도록 유지하여야 하기 때문에 세포의 상태(다분화능, 세포 성장, 세포 생존능력)를 실시간으로확인할 수 있는 방법의 개발이 줄기세포의 대량생산에 있어서 필수적이다. 따라서 현재 개발되어있는 여러 배양 기술과 배양액들이 cGMP 기준에 맞게 최적화를 시켜야 하며 대량생산에 필요한 생물 공학적 기술의 개발과 생산 단계에서 줄기세포의 특성들을 실시간으로 모니터링할 수 있는다양한 기술들의 개발이 필수적이다. ...................(계속) ☞ 자세한 내용은 내용바로가기 또는 첨부파일을 이용하시기 바랍니다.