바이오인

숙주-미생물 상호작용체(interactome) 아틀라스

BioINwatch(BioIN+Issue+Watch): 24-24

 ■인체 내 마이크로바이옴은 장 건강 뿐 만 아니라 면역 및 대사질환, 뇌·신경질환까지 광범위하게 연관되어 있는 것으로 보고

○ 하지만 마이크로바이옴을 구성하는 수많은 미생물이 분자 수준에서 어떤 영향을 끼쳐 치는지 거의 알려진 바가 없었는데,

- 최근 연구에서 인체 조직과 미생물 간의 상호작용을 광범위하게 분석한 아틀라스를 발표

- 연구팀은 BASEHIT*라는 새로운 기술을 개발하여 인체 외분비 프로테옴(exoproteome)**과 미생물 간의 상호작용을 대규모로 분석

* Bacterial Selection to Elucidate Host-Microbe Interactions in High Throughput

** 세포 밖으로 분비되거나 세포막에 위치하는 단백질의 집합으로, 세포 간 신호 전달, 면역반응 조절, 조직 구조 유지 등 다양한 기능을 수행

○ BASEHIT는 인체 단백질과 개별 미생물 사이의 결합을 스크리닝 하기 위해 개발된 고속 처리 기술로,

- 인체 단백질을 발현하는 효모 라이브러리, 바이오틴화된 미생물이 핵심 요소이며, 스트렙타비딘 자성 비즈, 차세대 시퀀싱 등 단백질-미생물 결합을 포착하여 분석하는 핵심 기술로 구성

○ 먼저 3,324개의 인체 외분비 단백질(expprotein)을 효모 표면에 발현하는 효모 디스플레이 라이브러리*를 제작

- 이때 외분비 단백질을 코딩하는 유전자 앞에 각각의 단백질 식별을 위한 유전자 바코드를 추가

* 인간 외분비 프로테옴의 60% 이상을 포괄하며, 각 단백질 당 평균 20개의 바코드(식별을 위한 유전자 서열)를 추가

- 또한 이렇게 발현되는 외분비 단백질이 제대로 접혀 단백질-단백질 상호작용을 재현하는 것을 확인

< 효모 디스플레이 라이브러리 제작 과정(상)과 외분비 단백질 발현을 위한 유전자 배열(하) >

¶ 인체 외분비 단백질 서열에 기반한 유전자로 효모 디스플레이 라이브러리로 제작하고, 디스플레이된

각각의 단백질이 제대로 발현되었는지 확인(에피토프, 항체, 리간드 사용)

¶ 인체 외분비 단백질 식별을 위한 바코드 유전자(Barcode), 외분비 단백질이 효모 표면 위치하도록

하는 유전자(Aga2 Signal Sequence), 외분비 단백질을 코딩하는 유전자(Exoprotein) 포함

출처 : Nature, A host-microbiota interactome reveals extensive transkingdom connectivity, 2024.3.20

○ 인체 조직(구강, 피부, 장, 생식기)별로 서식하는 마이크로바이옴에서 519개의미생물 균주를 분리하고, 미생물 표면에 바이오틴(biotin)*을 부착

* 스트렙타비딘 자성 비즈(streptavidin magnetic beads)에 결합하는 특성을 이용하여 미생물-효모 결합체를 쉽게 분리

- 특히, 스트렙티비딘 자성 비즈는 특정 미생물 균주가 결합한 효모를 선택적으로 분리하고 농축하여 BASEHIT 점수를 도출할 수 있게 하는 핵심 사항

※ 이러한 농축 과정을 통해 특정 미생물과 인체 단백질 간의 결합을 세밀하게 탐색할수 있었는데, 이는 인체 외분비 프로테옴과 미생물 간의 복잡한 상호작용 네트워크를구축하는 데 중요하게 역할

○ 농축된 효모의 DNA 바코드를 NGS로 시퀀싱하여 어떤 외분비 단백질이 특정 미생물 균주와 상호작용하는지 식별하고 정량화

- 이 데이터를 통해 효모가 발현하는 인체 단백질과 개별 미생물 사이의 상호작용(결합) 정도를 나타내는 BASEHIT 점수*를 도출

* 각각의 미생물-인간 단백질 상호작용의 상대적인 강도를 나타내며, 이 점수는 효모의 바코드가 초기 라이브러리 대비 얼마나 높은 비율로 농축되었는지를 통해 계산

< 숙주-미생물 상호작용체(interactome) 아틀라스 분석 개요도 >

¶ 3,324개의 인체 외분비 단백질(DNA 바코드 추가)을 발현하는 효모 라이브러리 제작 + 인체 조직(구강, 피부, 장, 생식기)별 미생물 균주(519개)를 분리 → 바이오틴화된 미생물 균주와 효모 라이브러리를 혼합 → 스트렙티비딘 자성 비즈를 통해 미생물-효모 결합체 분리 및 농축 → NGS를 통해 바코드를 시퀀싱 → 바코드 농축의 상대적 정도에 따라 각 단백질의 BASEHIT 점수를 계산 → 170만 개 이상의 잠재적인 상호작용 발견, 3,650개의 유의미한 상호작용 식별

출처 : Nature, A host-microbiota interactome reveals extensive transkingdom connectivity, 2024.3.20

■BASEHIT라는 혁신적인 기술로 숙주-미생물 간의 상호작용을 대규모로분석하였고, 기존에 탐색되지 않은 분자 수준의 네트워크를 제시

○ 연구팀은 인체 단백질과 마이크로바이옴 사이에서 170만 개 이상의 잠재적인상호작용과 3,650개의 유의미한 상호작용을 발견

- 개별 조직(구강, 피부, 장, 생식기)에서 분리한 미생물 균주들은 그 조직에서 주로 발현되는 단백질과 결합하는 조직 특이적 상호작용 패턴을 보였는데,

- 이러한 조직 특이적 결합 패턴은 해당 미생물이 인체 조직과 어떻게 상호작용하는지에 대한 중요한 단서를 제공

※ 이는 미생물이 특정 조직에 정착하고 생존하기 위해 사용하는 메커니즘을 이해하고, 특정 미생물이 질병과 어떤 관련이 있는지 파악하는 데 도움

○ 3,650개의 상호작용은 인간과 미생물 간의 복잡한 관계를 규명할 수 있는방대한 데이터를 통해 미생물이 인체의 건강과 질병에 어떤 영향을 미치는지에 대한 중요한 정보를 제공

- 이 연구는 인간의 생리 및 다양한 질병 상태에서 미생물이 어떻게 역할을하는지 이해하는데 기여

※ 특히, 미생물이 인간의 면역 체계와 어떻게 상호작용하는지, 이러한 상호작용이 건강 및 질병에 어떤 역할을 하는지에 대한 새로운 통찰을 제공

- 숙주-미생물 상호작용에 대한 깊이 있는 이해는 새로운 치료 전략의 개발을가능하게 할 것으로 기대

※ 특정 미생물-숙주 단백질 상호작용을 표적으로 하는 것이 질병 예방이나 치료에 유용할 수 있음

- 인간과 미생물 간의 상호작용을 근거로 맞춤형 건강관리 전략 개발 또한 가능 ※ 프로바이오틱스나 프리바이오틱스와 같이 인간의 미생물군을 조절하여 건강을 개선할 수 있는 방법에 활용 가능

연구팀은 이번 연구를 통해 발견된 숙주-미생물 상호작용의 광범위한네트워크를 기반으로 다양한 후속 연구를 계획

○ 상호작용의 분자적, 생화학적, 구조적 세부 사항을 규명하고, 이러한 상호작용이 인간 건강, 질병, 그리고 미생물의 생리에 어떻게 영향을 미치는지이해하는 것에 중점을 둘 것으로 예상

- 분자적 및 생화학적 분석 : 상호작용이 어떻게 일어나는지에 대한 분자적 메커니즘을 규명하고, 특정 단백질-단백질 결합 부위의 구조를 분석

- 유전체 및 메타게놈 분석 : 상호작용에 관여하는 미생물 유전자를 식별하기 위해 유전체 및 메타게놈을 분석

※ 특정 상호작용이 미생물 내에서 어떻게 조절되고, 미생물의 생태 및 진화에 어떤 역할을 하는지 이해

- 질병 모델을 활용한 기능적 연구 : 특정 상호작용이 질병 발생 및 진행에 어떤 영향을 미치는지를 조사

※ 이는 새로운 진단, 예방, 치료 전략 개발에 기여할 수 있는 중요한 정보를 제공

- 치료적 개입의 가능성 탐색 : 특정 상호작용을 조절함으로써 건강을 개선하거나 질병을 치료할 수 있는 새로운 방법을 탐색

※ 프로바이오틱스, 프리바이오틱스, 또는 합성생물학적 접근 방식을 포함

- 공동체 수준의 상호작용 연구 : 개별 상호작용뿐만 아니라, 다양한 미생물종 사이의 상호작용과 이러한 상호작용이 호스트 건강에 미치는 집단적 영향을 이해하기 위한 연구를 계획

참고1. 공간 전사체(Spatial transcriptomics) 분석으로 숙주-마이크로바이옴의 상호작용 규명

■공간 전사체학 분석기술을 이용하여 숙주와 마이크로바이옴 사이의 상호작용을 규명할 수 있는 새로운 접근방법이 제시

○ 대부분의 마이크로바이옴 연구는 미생물의 DNA/RNA 시퀀싱을 통해 진행되는데, 이러한 방법은 미생물의 공간적 정보, 미생물-미생물, 미생물-숙주 사이의 상호작용을 포착하기 어려움

- 하지만 최근 단일세포 전사체학과 고해상도 이미징 기술을 기반으로 공간정보를 보존하는 동시에 유전자 발현을 측정하는 공간 전사체학이 부상

○ 스웨덴과 미국의 연구팀에서 공간 전사체학을 활용하여 in situ에서 숙주- 마이크로바이옴의 상호작용체(interactomes)를 분석한 연구결과를 발표

- 특히 박테리아와 진균, 숙주의 전사체를 포괄적으로 잡아낼 수 있는 역전사프라이머를 재구성

- 해당 기술은 바코드 역전사 프라이머가 나열된 슬라이드 위에 샘플을 올려 결합하게 한 뒤에 시퀀싱을 거쳐 숙주의 유전자 발현 및 미생물 군집에 대한 공간 지도를 구성

○ 스웨덴 연구팀은 애기장대 잎에 있는 미생물 군집의 공간적 패턴을 분석 - 이를 위해 박테리아와 진균(곰팡이) 그리고 숙주의 RNA를 포착할 수 있는 프라이머를 제작

- 분석 결과, 숙주에서 발현된 유전자와 미생물군이 갖는 RNA 사이에 상당한 중첩이 있음을 관찰

※ Nature Biotechnology, Spatial metatranscriptomics resolves host-bacteria-fungi interactomes, 2023.11.20.

○ 미국의 연구팀도 이와 유사하게 숙주의 mRNA와 박테리아의 16S rRNA를타겟으로 프로브를 제작하여 마우스 장 샘플의 공간 전사체를 분석

- 그 결과, 장 세포들이 미생물 환경에 따라서 특정 유전자 발현에 차이를 나타내는 것을 확인

※ Nature Biotechnology, Spatial host-microbiome sequecing reveals niches in the mouse gut, 2023.11.20.

아직 기술적으로 개선되어야 할 부분이 남아있지만 공간 전사체학을 활용한 분석방법은 마이크로바이옴 연구에 새로운 관점을 제시할 전망

○ 극복해야 할 과제 중 하나는 박테리아, 진균의 RNA가 균일하게 분석 슬라이드 위에 배포될 수 있도록 하는 것

- 세포 용해, RNA 방출 등의 문제로 RNA 접근성에 편차가 생기면 미생물 군집 분석에 왜곡이 발생할 수 있음

- 이외에도 공간 해상도(Spatial resolution)가 다소 떨어진다는 점, 환경적인 오염이나 참조 데이터베이스의 오류로 인한 왜곡, 침습적 조직 샘플링으로 인해 in vivo 연구에 기술 적용이 어렵다는 문제들이 존재 

※ slide-seq, stereo-seq와 같은 spatial RNA 시퀀싱 플랫폼, 형광 in situ 결합, 비침습적 장 샘플링 기기 등 신규 유망기술과 융합 시 문제해결이 가능할 것으로 예상

< 숙주-마이크로바이옴 상호작용 분석 방법 >

 출처: Nature Biotechnology, Spatial methods for microbiome-host interactions, 2023.11.20.

○ 이러한 방법을 통해 미생물과 숙주 사이의 상호작용을 탐색할 수 있게 된다면 새로운 관점의 마이크로바이옴 연구가 가능

- 숙주-병원체, 종양세포/종양-마이크로바이옴, 식물병원균- 마이크로바이옴, 마이크로바이옴-면역시스템 간의 다양한 연구에 활용할 수 있을 것으로 기대

참고2. 단일세포 수준에서 단백질 합성의 공간 아틀라스 (Spatial Atlas)를 생성하는 분석기술 개발

■생물학 연구의 오랜 목표는 단일세포 내에서 공간적으로 잘 이해할 수 있는 수준으로 단백질 번역(translation)을 분석하는 것

○ 기존의 공간 전사체학(spatial transcriptomics)은 생명과학 및 바이오 연구를위한 혁신기술로 등장했지만 활발하게 번역이 진행 중인 mRNA의 공간 매핑 정보를 제공하기에는 부족

- 현재까지 공간 전사체학을 구현하기 위해 mRNA 시퀀싱과 이미징기술 (smFISH 등)을 조합하였으나, mRNA 존재 유무만으로는 단백질 생산과 연계된 기능적 정보를 알아내기에는 한계

* smFISH(single-molecule fluorescence in situ hybridization)

○ 특히, RNA는 DNA 전사에서 시작하여 초기 RNA 합성, 스플라이싱, 내보내기, 번역 및 분해에 이르기까지 풍부하고 역동적으로 변화하는데,

- 특정 조직, 세포 내 RNA 변화를 정확히 알아내기 위해서는 RNA 존재 자체를 검출하기 보다는 현재 번역이 진행 중인 mRNA의 양과 공간적 위치 정보를 한꺼번에 분석하는 것이 중요

■최근 연구에서는 활발하게 번역 중인 mRNA(translating mRNA)의 수가단백질 발현과 더 밀접하게 관련되어 있다는 가설을 두고 번역 중인 mRNA의 공간 프로파일링 분석방법을 개발

○ 연구팀은 단일세포 수준에서 단백질 합성의 공간 차트를 작성하기 위해 리보솜 결합 mRNA 맵핑(ribosome-bound mRNA mapping, RIBOmap)을 고안

- RIBOmap은 3개의 프로브(probe)를 통해 리보솜에 결합하여 단백질 번역이진행 중인 mRNA를 선택적으로 감지하고 증폭하는 전략을 사용

○ 3개의 프로브는 바코드를 포함한 자물쇠(padlock) 프로브, 바코드를 포함한프라이머(primer) 프로브, 리보솜 RNA(ribosomal RNA)와 결합하는 동시에 자물쇠 프로브를 동그랗게 만드는 부목(splint) 프로브로 구성

- 작동 원리는 바코드를 포함한 자물쇠 프로브가 특정 mRNA를 표적으로 결합하고, 바코드를 통해 프라이머 프로브가 자물쇠 프로브와 결합하면 DNA를 복제할 수 있게 되는데, 이 때 리보솜 RNA와 결합하여 자물쇠 프로브를 원형화(circularize)하는 부목 프로브가 필요

- 결과적으로, 복제된 DNA 내 포함된 바코드는 형광물질로 표지된 프로브와결합하여 표적 mRNA의 위치 정보를 제공

< RIBOmap을 구성하는 3개 프로브와 작동 방식 >

■RIBO-map은 리보솜 결합 mRNA를 선택적으로 분석하도록 설계된 3차원 실시간 프로파일링 기술로, 세포 유형별·조직 영역별 공간 아틀라스(spatial atlas)를 생성

○ 연구팀은 RIBO-map을 사용하여 HeLa 단일세포에서 981개 유전자의 번역을 프로파일링하고,

- 세포 배양 과정에서 세포 성장 주기, 단계에 따라 달라지는 mRNA의 번역 패턴을 확인

○ 또한 마우스 뇌 조직에 RIBO-map을 적용하여 119,173개의 단일세포에서5,413개의 유전자를 검출하였는데,

- 희소돌기아교세포 계통 세포에서 전사체(transcriptome)와 번역체(translatome) 사이의 강한 불일치를 관찰하였으며, 또한 해마의 세포 내에서도 위치(cell body와 periphery)에 따른 번역의 차이를 관찰

< 단일세포의 번역체(single-cell translatome) 실시간 정보를 제공하는 RIBOmap >

■RIBO-map은 조직에서 많은 유전자에 대한 공간 매핑을 입증했지만, 여전히 염기서열이 알려진 mRNA만 분석할 수 있다는 점이 한계

○ 복잡한 조직, 세포 내에서 염기서열에 따라 번역하는 mRNA를 공간적으로프로파일링하면 서열 특이적 RNA-단백질 상호작용과 번역 활동을 감지할수 있지만 알려지지 않는 mRNA에 대한 분석은 여전히 과제로 남아 있음 - RNA의 역동적이고 단계적인 생애 주기는 전사부터 번역 및 분해에 이르는선형적인 경로가 아니라 다양한 단백질과의 결합, 다른 RNA에 의해 활발하게 조절

○ 따라서 RNA-단백질 및 RNA-RNA 상호 작용의 위치를 매핑하는 것은 유전자 발현 조절을 이해하는 데 중요하며,

- RNA의 화학적 변형은 안정성과 번역을 변화시키며, 이는 게놈 규모의 공간 매핍에 또 다른 중요한 메커니즘을 제시할 것으로 기대

※ 예를 들어, endonuclease-결합 mRNA를 검출하여 mRNA 분해 속도를 연구할 수 있는 등 3가지 프로브 방법은 RNA 생애 주기별 분석에 적합하게 변형이 가능

○ 향후 RIBO-map은 공간 후성유전체학(spatial epigenomics), 멀티오믹스와 같은 첨단 신기술과 통합하여 RNA 번역을 후성유전학적 제어, 단백질 발현 및 대사 기능과 연결할 수 있을 것으로 예상

- 이러한 접근 방식은 DNA에서 RNA, 단백질 및 세포 기능에 이르는 유전 정보의 흐름을 정의하는 분자생물학의 central dogma를 포괄적으로 이해하는 데에 도움이 될 것으로 기대