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장내 박테리아의 유전자를 바로 그 자리(in situ)에서 편집하는 Base editing 시스템

BioINwatch(BioIN+Issue+Watch): 24-47

■ 최근 염기 편집기(base editor)를 활용하여 살아있는 마우스의 장 속에 있는 박테리아의 유전자를  그 자리에서 직접(in situ) 편집했다는 연구 결과가 발표

○ 기존에 여러 연구팀이 CRISPR-Cas 편집 시스템을 사용하여 마우스의 장에 있는 유해 박테리아 집단 전체를 사멸시키는 연구결과를 얻었으나,

  - 이번 연구는 특정 유전자만 정밀하게 편집하여 박테리아 집단을 사멸시키기 보다는 유해한 기능만 억제하는 방식을 취하여 장내 미생물 군집 구성에 큰 변화를 일으키지 않음

  - 이를 위해 연구팀은 DNA를 절단 하지 않고 하나의 염기쌍만 바꿔 비교적 안전하다고 평가되는 염기 편집기(base editor)*를 사용

    * 표적 DNA 절단 없이 아데닌(A)을 구아닌(G) 또는 사이토신(C)을 티민(T)으로 단 하나의 염기를 치환

○ 그러나 살아있는 동물 체내에 있는 박테리아를 표적으로 염기 편집기를 전달해야하는 도전과제에 직면

  - 이러한 문제를 극복하기 위해 연구팀은 박테리아를 감염시키는 바이러스인 박테리오파지를 이용

   ※ 지금까지 박테리아를 표적으로 한 염기 편집기는 실험실에서 배양한 박테리아에서 흔히 찾아볼 수 있는 수용체를 통해서만 전달되어 왔음

○ 박테리오파지 λ를 엔지니어링하여 살아있는 마우스의 장 속에 있는 특정 박테리아 집단을 표적화

  - λ 파지가 대장균(E. coli)의 외막 단백질(OmpC)*을 인식하고, 더 잘 결합할 수 있도록 변형

    * 세포 내외로 물질을 이동시키는 통로로, 특정 박테리오파지의 감염 경로로 이용되기도 하고, 특정 항생제의 경우에 OmpC를 통해 세포 내로 들어가기 때문에 OmpC의 발현 수준과 구조 변화는 항생제 감수성에 영향을 미친다고 알려져 있음

< 박테리오파지 λ의 엔지니어링 >

  - 엔지니어링된 λ 파지는 gpJ 키메라*와 STF 키메라**로 변형하여 원래 수용체가 아닌 다른 수용체와 결합할 수 있도록 설계

    * 원래 gpJ는 LamB와 결합하나, 장내와 같이 높은 삼투압 조건에서 발현이 증가하는 OmpC를 인식하여 결합할 수 있도록 변형

   ** 파지가 세포 표면에 더 쉽게 부착할 수 있도록 지원

  - 이는 다양한 세균에 유전자 편집 도구를 전달할 수 있는 유연성을 제공하여 연구 및 치료 목적에 맞게 사용 가능

  - gpH 단백질은 파지가 세균의 외막에 부착한 후, 파지의 DNA가 박테리아 내로 주입되는 과정을 촉진

   ※ 파지 감염 과정에서 필수적인 단계로, gpH는 gpJ 단백질과 협력하여 박테리아의 외막을 뚫고 파지 DNA를 세포질로 전달

■ 비복제성 DNA 코스미드 사용, 높은 염기 편집 효율, 다양한 병원성 균주에 대한 적용 등 기존 연구에 비해 우수한 점을 제시

< 특정 조건에서만 복제되는 코스미드 >

○ 기존 연구에서는 복제 가능한 플라스미드나 바이러스를 사용하였으나, 이번 연구에서는 비복제성 DNA 코스미드를 사용하였으며, 특정 조건에서만 복제되도록 설계

  - Primase가 발현되어야 Primase-Ori에서 복제가 시작되는 방식

  - Primase 유전자는 DAPG(2,4-diacetyl- phloroglucinol)에 의해 유도되는 pPhlF 프로모터에 의해 조절

  - 특정 조건에서만 복제가 가능하여 불필요한 유전물질의 확산을 방지할 수 있으며, 유전자 편집 도구를 안전하게 관리할 수 있음

○ 염기 편집 도구를 사용하여 마우스 장내에 있는 대장균에 항생제 내성을 유발하는 효소인 β-락타마제(β-lactamase) 유전자를 편집한 결과,

  - 한번 투여로 93%의 편집 효율을 보였으며, 유전자가 편집된 박테리아는 최소 42일 동안 마우스 장내에서 안정적으로 유지되는 것을 확인

   ※ 스트렙토마이신을 사용하여 마우스 장내 세균 수를 감소시킨 후, 특정 E. coli 균주를 경구로 투여하여 장내에 정착시킴 → 비복제성 코스미드(β-락타마제 유전자를 표적한 아데닌 염기 편집기(ABE)를 포함)를 포장한 파지 벡터를 경구로 투여 → 마우스의 대변 샘플을 수집하여 편집 효율을 ddPCR(digital droplet PCR)을 통해 정량적으로 분석

  - 대장균의 csgA* 유전자를 편집한 실험에서는 64∼79%의 효율을 보임

    * 대장균 등 그람 음성 세균에서 발견되는 유전자로, curli라는 아밀로이드 섬유 단백질을 합성. 일부 연구에서 curli 섬유는 신경퇴행성 질환 및 자가면역 질환과 관련이 있음을 제시

  - 폐렴을 일으킬 수 있는 Klebsiella pneumoniae ST258의 유전자 편집 실험은 시험관 내(in vitro)에서 수행되었는데, 37∼56%의 편집 효율을 보임

○ 염기 편집 후 장내 미생물 군집 구성에 큰 변화가 없음을 확인하였으며, 염기 편집이 미생물 생태계에 부정적인 영향을 미치지 않음을 입증

  - 이는 기존 연구에서 많이 다루지 않았던 중요한 평가 항목으로, 일정 기간 동안 대변 샘플에서 DNA를 추출하여 16S rRNA 유전자 시퀀싱을 수행

■ 이번 연구는 장 내부의 박테리아를 직접 변형할 수 있는 도구를 개발했다는 점에서 다양한 분야에서 응용 가능할 것으로 기대

○ 특정한 병원성 박테리아의 유전자를 표적으로 제거하거나, 장내 유익한 박테리아의 유전자 편집을 통해 그 기능을 강화하는 등 정밀한 장내 미생물 치료가 가능할 것으로 기대

  - 항생제 내성 세균의 특정 유전자를 편집하여 내성을 제거함으로써, 기존 항생제의 효과를 회복시키고, 항생제 내성 문제를 해결하는 데 기여

   ※ 항생제는 광범위하게 세균을 억제하지만, 유전자 편집 도구는 특정 세균이나 특정 유전자를 정밀하게 표적할 수 있어 부작용을 최소화

○ 특정 유전자를 편집하여 그 기능을 연구하고 유전자-표현형 관계를 밝히는 등 기능 유전체학 연구에 중요한 도구로 활용 가능

  - 질병 모델 개발로 질병의 메커니즘을 연구하고 새로운 치료법을 탐구

○ 유전자 편집 도구를 사용하여 환경 오염 물질을 분해하는 미생물을 개발하여 환경 정화에 사용 가능

  - 특정 유전자를 편집하여 산업적으로 중요한 물질(효소, 바이오 연료, 의약품 등)을 생산하는 미생물을 개발

참고 : 크리스퍼 유전자편집기술의 새로운 트렌드

■ 최초의 크리스퍼 유전자편집 치료제인 카스게비*가 승인된 상황에서 1세대 크리스퍼 기술(CRISPR-Cas9, CRISPR 1.0)을 넘어 더 정밀하고 효율적인 차세대 크리스퍼 기술(CRISPR 2.0)을 주목

DNA-CRISPR-Cas9 결합 구조(보다 다재다능한 유전자편집기술이 치료제 개발에 활용 중)

    * 겸상적혈구병이라는 유전적 헤모글로빈병을 치료하는 CRISPR-Cas9 적용 세포치료제로, 영국에서 ‘카스게비(Casgevy)’를 세계 최초로 승인(2023.11.16.)한 이후 미국에서도 ‘엑사셀(카스게비의 미국 상품명)’을 허가(2023.12.8.)

○ CRISPR-Cas9은 높은 정확성과 효율성 으로 유전자편집기술의 혁명을 선도

  - 미충족 수요가 높았던 희귀·유전· 난치질환, 감염병 등 다양한 질환에 대한 CRISPR-Cas9 치료제가 임상시험 중에 있지만,  

  - 1세대 크리스퍼 기술(CRISPR-Cas9, CRISPR 1.0)은 단순히 표적 DNA의 이중가닥을 절단하여 타겟 유전자의 기능 상실(loss-of-function)만 유도할 뿐 원하는 염기를 치환·삽입하여 유전정보를 교체하는 데에는 한계

< CRISPR-Cas9 치료제의 임상시험 현황 >

  출처: 프로스트앤드설리번, Growth Opportunities in Gene Editing Technologies, 2023.1

■ 1세대 크리스퍼 기술의 한계를 극복하기 위해 차세대 크리스퍼 기술 (CRISPR 2.0)로 진화, 치료제 개발에 활용 중

○ (Base editing) CRISPR-Cas9와 달리 DNA 이중가닥을 절단 없이 원하는 염기쌍 하나를 다른 염기로 바꾸는 단일염기편집 기술(Base editing)

  - (구성) DNA 절단 기능이 결여된 Cas9(dCas9)*에 탈아미노 효소를 부착

     * Cas9 핵산 분해 효소는 2군데 활성 부위(10번째 아스파트산(D), 840번째 알라닌(A))가 있어 DNA 두 가닥을 절단하는데, 이 2군데의 아미노산 돌연변이로 DNA 절삭 기능이 결여

  - (작동 방식) 표적 DNA 절단 없이 아데닌(A)을 구아닌(G) 또는 사이토신(C)을 티민(T)으로 단 하나의 염기를 치환

  - (장·단점) DNA 절단 없이 단 하나의 염기쌍만 치환하여 안전하나, 탈아미노 효소를 기반으로 작동하기 때문에 DNA 단편을 추가 또는 삭제할 수 없으며 아데닌(A)과 사이토신(C) 2개 염기만 치환 가능한 점도 한계

  - (치료제 개발) 낭포성 섬유증, 고콜레스테롤증, 백혈병 치료제 개발에 적용되어 초기 임상시험이 진행 중

< Base editing 치료제의 임상시험 현황 >

  출처: 프로스트앤드설리번, Growth Opportunities in Gene Editing Technologies, 2023.1

○ (Prime editing) DNA 단일가닥만 자르고 RNA 주형에 있는 정보를 타겟 시퀀스에 삽입하는 기술(Prime editing)

  - (구성) DNA 단일가닥만 절단하는 Cas9(nCas9)*에 역전사 효소가 부착. peg(prime editing guide) RNA는 표적 위치를 인식하는 서열과 새로운 DNA 단편의 삽입을 위한 주형 RNA로 구성

     * Cas9 핵산 분해 효소의 1군데 활성 부위(D10A)가 돌연변이로 억제되어 DNA 이중나선 한 가닥만 절단

  - (작동 방식) 표적 DNA 단일가닥 절단 후, 역전사 효소가 RNA 주형에 있는 유전정보를 DNA로 합성한 후 타겟 시퀀스에 삽입

  - (장·단점) DNA 단일가닥만 절단하여 안전하며 원하는 유전정보를 정확히 삽입하나, 이전 기술 대비 설계와 교정법이 다소 복잡하고 최대 90개 이내의 염기만 삽입 가능한 점이 한계

    ※ 연구자들은 게놈의 표적 부위에 훨씬 더 큰 DNA 조각을 삽입하는 방법과 전체 유전자를 대체할 수 있는 방법을 고안 중   

  - (치료제 개발) 최근 미국 FDA는 유전성 면역질환, 만성 육아종증*에 대한 프라임편집 치료제의 임상시험을 승인

     * 식균 작용을 하는 면역세포의 기능 저하로 지속적으로 심한 감염이 발생하는 면역결핍 유전질환

< 크리스퍼(CRISPR) 유전자 편집기술의 발전 과정 >

출처: Howard Hughes Medical Institute, Precision Genome Editing Enters the Modern Era, 2020.6.12.

○ (Epigenome editing) DNA 염기서열 자체를 변화시키지 않고 화학적 변형으로 유전자 발현을 조절(on/off)하는 후성유전체 편집(Epigenome editing) 기술로 발전 중

  - (구성) DNA 절단 기능이 결여된 CRISPR-Cas9(dCas9)에 후성유전 조절 인자(KRAB/VPR)가 부착

     ※ KRAB은 프로모터 부근의 히스톤 H3의 9번째 라이신을 트리메틸화하는 효소로 dCas9과 융합은 450회 이상의 세포 분열 동안에도 유전자 침묵을 안정적으로 지속

     ※ VPR은 VP64, P65(NF-kb), Rta 3개의 전사 촉진제가 결합된 전사조절인자로 dCas9과 융합은 450회 이상의 세포 분열 동안에도 활발한 유전자 발현을 안정적으로 지속

  - (작동 방식) 표적 DNA 절단 없이 DNA 메틸화나 히스톤 단백질 변형을 통해 유전자 발현을 지속적이고 정확하게 제어

  - (장·단점) DNA 염기서열의 변화를 수반하지 않아 안전하나 돌연변이 유전자를 정상 유전자로 복구할 수 없고 유전자 발현만 조절 가능  

  - (치료제 개발) 영장류에서 DNA 염기서열을 변경하지 않고 콜레스테롤 조절 유전자 PCSK9를 비활성화한 연구결과 발표(Tune Therapuetics, 2023.5)

■ 더 정밀하고 안전하며 효율적인 교정 방식의 차세대 크리스퍼 기술 개발은 다양한 질환 치료에 활용될 수 있을 것으로 전망

○ DNA 돌연변이는 유전질환, 암, 노화 등 다양한 질환과 생명 현상의 주요 원인

  - 10년 전 미생물에서 발견한 CRISPR-Cas9을 이용하여 DNA 돌연변이를 교정할 수 있게 되면서 치료제 개발이 어려웠던 유전질환 등 다양한 난치질환을 치료할 수 있을 것으로 기대

  - 더 나아가 차세대 크리스퍼 기반 치료제로 질병 극복 가능성이 한 단계 높아질 것으로 전망

...................(계속)

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