바이오인

1. 기술의 개요

액체생검은 혈액, 소변 등의 인체유래물로부터 암의 정보를 담고 있는 바이오마커를 분리하여 암 진단 및 예후, 항암제 효과 모니터링 등에 활용하는 검사이다. 기존 조직검사는 암이 발병한 부위에 내시경이나 바늘 등의 도구를 직접 삽입하여 조직을 채취하는 것에 반해, 액체생검은 상대적으로 비침습적인 방법이므로 위험부담이 적고, 주기적으로 항암제 효과의 모니터링이 가능하다는 장점이 있다. 혈액 등으로부터 분리한 생체지표들의 유전자 발현량이나 염기서열을 분석하고 암 조직과 비교하여 돌연변이 유무와 내성 유전자 발생 등을 확인할 수 있고, 이를 통해 보다 효과적인 개인 맞춤형 치료에 도움을 줄 수 있다.

지금까지의 암의 진단 및 치료는, 조직검사를 이용한 분자 진단 및 CT 등 이미징 기술을 이용하고, 이를 바탕으로 수술, 방사선 치료, 항암 치료 등 치료법을 결정한다. 이후 각 치료법의 효과 및 암의 진행여부를 파악한 뒤, 그 효과가 미비하면 차선의 치료법을 결정하게 되는데, 이 주기가 수개월이 걸려 적절한 치료시기를 놓칠 가능성이 있다. 그러나, 비침습적인 액체생검을 이용하면 검사를 보다 자주 시행할 수 있고, 따라서 치료법 결정의 시기를 앞당길 수 있어 실질적으로 암 환자의 생존율 향상에 기여할 것으로 기대된다.

액체 생검에 활용되는 대표적 순환 생체지표는 혈액순환종양세포 (circulating tumor cells, CTCs), 엑소좀(exosomes), 혈액순환종양 DNA (circulating tumor DNA, ctDNA)가 있다[그림 1]. CTCs는 원발성 암(primary tumor)으로부터 떨어져 나와 혈액을 타고 순환하는 암 세포를 일컫는다. 원발성 암 조직으로부터 떨어져 나온 세포이기 때문에 암 조직과 같은 유전정보를 가지고 있고 성질이 비슷할 것으로 생각된다. 혈액으로부터 세포 상태로 분리 가능하기 때문에 온전한 유전정보를 얻을 수 있으며 체외배양을 통해 마우스에 종양 모델을 만들거나 세포를 키워 환자에게 특정 항암제를 처방하기 전에 미리 치료효과가 좋고 부작용이 적을 것으로 예상되는 항암제를 선별하는 데 활용할 수 있다 [1]. 그러나, CTCs는 혈액 속에 극미량 (혈구 세포 10억개당 1~10개)으로 존재하기 때문에, 이러한 CTCs를 보다 효과적으로 분리하고 이를 활용해 분자진단을 하는 기술개발이 전 세계적으로 활발히 진행 중이다.

[그림 1. 액체 생검의 대표적인 순환 생체지표와 이를 이용한 분자진단 개념도(2, 3)]

엑소좀은 세포 활동에서 발생하는 40~1000 nm 크기의 나노소포체를 의미한다. 발견 초기에는 세포 부산물로 여겼으며, 면역 반응에 참여하는 것으로 나타나기전까지는 많은 주목을 받지 못하였으나 [4], 최근 종양의 진행과 전이, 세포 신호 전달 등의 세포 활동에 기여하는 중요한 물질이라는 사실이 밝혀졌다 [5]. 엑소좀은 소변, 혈액, 타액, 객담, 복수를 포함한 신체의 모든 체액에 존재하며, 또 유래된 세포의 유전정보 등을 가지고 있어 암을 포함한 각종 질병 상태의 진단 및 치료 평가를 위한 새로운 바이오마커로 이용 가능하며 [6], 약물전달 시스템으로도 주목받고 있다 [7].

ctDNA는 종양세포의 괴사 (necrosis), 세포자살 (apoptosis), 분비 (secretion)에 의해 혈액에 떠다니는 작은 크기의 (~180bp) genomic DNA를 일컫는다 [8]. 최근, 차세대 염기서열 분석기술 (NGS) 및 3세대 PCR (ddPCR) 기술의 발전과 함께 암 진단 및 모니터링의 지표로써 각광받고 있다. 특히, ctDNA는 다른 지표들과는 다르게 종양 특유의 종합적인 유전적 정보 (돌연변이 및 기타 유전적 변화)를 함유하고 있고, ctDNA 특유의 가변성 (혈액 내 반감기 2시간 미만)에 의해 종양의 현재 상태를 조금 더 명확하게 보여 준다고 보고되고 있다 [9, 10]. 따라서 암 치료에 따른 경과를 모니터링 하는데 있어 장점을 가지며, 종양이 저항성을 진화시키고 있는지에 대한 여부 등 종양의 동태를 파악하는데 보다 더 결정적인 단서를 제공한다.

종합적으로 볼 때, 액체생검법을 활용하여 혈액 등의 인체유래물로부터 CTCs, 엑소좀, ctDNA등의 생체지표를 높은 효율로 분리하고, 각 생체지표가 가지는 특유의 성질 또는 복합적인 연관성을 분석할 수 있다면 암 진단 및 치료의 효과를 극대화 시킬 수 있을 것으로 기대된다. 이 글을 통하여 액체생검과 관련한 세 가지의 순환 생체지표를 이용하기 위한 기술적인 요구 및 이를 해결하기 위한 최근 연구 동향을 소개하고, 이에 대한 시사점 및 미래의 전망을 살펴보고자 한다.

2. 기술의 특징 및 주요 이슈

가. 기술적 요구사항

기존의 조직검사는 조직을 채취하기 위해 침습적인 방법을 사용함으로 인해 환자에게 위험부담이 크고 환자 상태에 따라 시행하기 어려운 경우가 많다. 또한 항암 치료 과정 중에 조직샘플을 주기적으로 얻기가 쉽지 않으며 항암제 투약과정 중 즉각적인 변화를 확인하기 어려운 점이 있다. 또한 채취하는 조직의 부위에 따라 결과가 달라질 수 있기 때문에 위양성 (false positives) 판정의 가능성이 있다. 따라서 이러한 조직검사의 단점을 해결하기 위하여 새로운 액체생검이 연구 개발 되어 오고 있으며, 액체생검을 보다 용이하게 수행하기 위하여 미세유체역학 및 다양한 공학기술을 이용한 플랫폼이 활발히 개발되고 있다.

(1) 혈액순환종양세포

CTCs를 액체생검에 활용하기 위해서는 희소세포인 CTCs를 높은 정밀도로 분리, 농축하는 기술이 필요하다. 또한, 분리된 CTCs를 분자진단에 활용하기 위해서는 현존하는 PCR, NGS 등의 장비에서 요구하는 순도를 확보해야 한다. 대표적인 CTCs 분리 방법에는 암세포표면의 특정 단백질 마커에 결합하는 항체를 이용하는 immunoaffinity 차이 기반 분리 방법과 암세포와 혈구세포의 크기 차이를 이용하는 size 기반 분리 방법이 있다. Immunoaffinity 차이 기반 분리 방법에서는 항원-항체 반응을 통해 특이적으로 CTCs를 분리하기 때문에 분리된 CTCs의 순도가 높다. 하지만 각각의 CTCs 표면 특이 단백질의 발현량이 매우 다양하여, 일부 target 발현량이 적은 CTCs의 경우는 회수율이 좋지 않다는 단점이 있다. Size-based separation방법은, 미세유체 칩의 구조나 마이크로 사이즈의 기공을 갖는 멤브레인을 이용하여 크기 차이로 CTCs를 걸러낸다. 이 방법에 의하면 표면특이 단백질 발현량이 다양한 CTCs를 모두 분리할 수 있다. 하지만, CTCs가 8 ~ 20μm, 백혈구가 6 ~ 10 μm의 크기로, 각 세포의 크기 범위가 다양하기 때문에 순도가 높은 CTCs를 분리하기가 어려운 단점을 가진다. 각각의 단점을 극복하여 다양한 CTCs를 순도 높게 분리할 수 있는 기술이 개발 중이며 분리된 CTCs로부터 임상적 의미를 도출하는 보고가 증가하고 있다 [11].

(2) 엑소좀

엑소좀은 나노 수준의 작은 크기(40-1000 nm)와 낮은 밀도(1.13 – 1.19 g/mL) 때문에, 미세한 입자를 효과적으로 분리하기가 쉽지 않다. 세포를 분리하는 원심분리법을 사용할 수도 있지만, 이 경우 150,000 G 이상의 고속 회전 속도를 요구하기 때문에 초고속 원심분리기가 필요하다 [12]. 밀도가 낮은 엑소좀을 분리하려면 그만큼 큰 원심력이 필요하기 때문이다. 또 시료를 준비하는 과정이 복잡하고 처리 시간도 오래 걸리며, 엑소좀과 유사한 밀도 범위를 가진 지질단백질 (high-density lipoprotein)이 함께 분리되는 한계점이 있다[13]. 이러한 문제점을 해결하기 위하여, 초원심 분리 이전에 필터로 불순물들을 걸러주어 엑소좀의 순도를 높이거나, 엑소좀 표면 단백질 마커를 이용한 immunoaffinity 차이 기반 분리 방법이 개발 되었지만, 비싼 비용, 낮은 수득율, 특정 항체를 포함하지 않는 엑소좀은 분리하기 어렵다는 문제점이 있다 [14,15]. 따라서, 보다 쉽게 항체특이성과 무관한 엑소좀을 높은 수득율로 분리하는 기술 개발이 요구된다.

(3) 혈액순환종양 DNA

혈액의 혈장에서 ctDNA를 분리하기 위한 대표적인 방법으로는, 실리카 표면을 활용한 고체상 DNA 추출법이 이용되고 있다 [16]. DNA 추출법의 기본 원리는 혈액순환종양 DNA와 함께 존재하는 단백질 및 지질 등 불순물의 분해, DNA 흡착 및 추출로 이루어지며, chaotropic salt 등 DNA 흡착 매개체가 이용된다. QIAamp CNA kit 등의 ctDNA를 분리하기 위한 상용화 키트가 개발되어 사용되고 있다. ctDNA는 길이가 짧고, 아무런 보호 장치 없이 혈액 안을 떠돌아다니며, 이를 분해시킬 수 있는 DNase 등의 생체효소로부터 노출되어 있어 반감기가 2시간 이내로 짧다는 특성이 있다 [8, 9]. 따라서, 다른 생체분자보다 농도가 극히 적으며 짧은 시간 안에 분리 해야만 한다. 이와 관련하여, 최근 약 180 bp의 짧은 길이를 가지는 ctDNA의 특성을 이용한 추출 방법이 보고되었지만, 제한된 샘플의 양, 긴 추출 시간, 복잡한 전처리 과정 등의 단점을 개선하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다.

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