바이오인

1. 기술의 정의

유전자 편집기술은 정확한 위치파악 능력을 갖는 핵산분해효소를 이용하여 질병이나 형질에 관여하는 세포 내 유전자를 제거하거나 교정, 삽입함으로써 형질이나 질병의 변화를 꾀하는 기술이다. 유전자편집에 사용되는 도구는 소위 ‘유전자 가위’로 불리는데, 유전자 가위를 사용하여 유전체를 편집하는 방법으로는 크게 (생)체내편집과 (생)체외편집으로 구분할 수 있다. 체외교정은 체외로 세포를 꺼내어 교정 후 체내로 재주입하는 방법이며, 체내교정은 직접 생체 내에 유전자 가위를 도입하여 유전자를 교정하는 유전체 편집기술이 있다. 체외편집기술은 체외로 꺼내어 배양이 가능하고, 다시 체내로 들어갔을 때 원래의 기능을 유지할 수 있는 세포에 한정되어 있어 조혈모세포나 줄기세포, 면역세포를 포함한 혈구 세포에 한정적으로 적용이 가능하다. 하지만 대부분의 유전질환들은 체외로 꺼내는 방법을 사용할 수 없기 때문에 직접 체내에서 교정하는 방법을 사용하여 치료해야 한다. 본 동향소개서에는 체내편집 기술에 대해서 소개하고 관련된 기술적 동향과 주요 이슈에 대해서 기술하고자 한다.

가. 유전자 가위

유전자 가위란 핵산분해효소를 위치파악 능력이 있는 가이드 물질과의 융합을 통해 특정 DNA의 서열의 변화를 유도하는 기술을 말한다. 현재 크게 세 종류의 관련 기술이 개발되었다. 제1세대 기술인 징크핑거뉴클라아제 (Zinc Finger Nuclease: ZFN)는 핵산 3개를 인식하는 Zinc Finger 단백질을 3-5개 조합한 후 핵산 분해효소인 FokI과 융합하여 만든 단백질을 쌍으로 조합하는 기술이다. 2세대 기술은 식물 병원균인 Xanthomonas 유래 단백질인 TALE 모듈을 20여개 조합한 후 FokI을 융합시킨 후 이를 쌍으로 만든 기술로 TALEN(Tranor Activator-Like Effector Nuclease)이라 부른다. 제3세대 기술은 guide RNA와 핵산분해 활성을 갖는 Cas9 단백질이 결합한 후 해당 유전자를 절단하는 CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas9이다 (표1). CRISPR/Cas9기술 이후로 CRISPR/Cpf1, C2c1-3 등 3세대 기반의 다양한 유전자가위 기술들이 소개되었다. 현재 유전자편집에 관한 연구는, 발표 된 것으로만 1만 건에 가까이 존재 하고 있으며, 치료에 적용된 연구 기준으로 1천여 건 이상이 될 정도로 전 세계 생명과학 및 의과학 분야에 엄청난 관심과 파급력을 불러일으키고 있으며 현재도 활발히 진행되고 있다. 그 중 3세대 CRISPR 기술은 미국 사이언스지에 2015년도 최고 혁신기술로 선정되었고, 2017년 한국생명공학연구원에서 발표한 10개 미래유망기술 중에 하나로 소개되었다.

[표 1. 1-3세대 유전자 가위기술의 소개]

출처 : INTECH “Modern Tools for Genetic Engineering”

이들 유전자가위들은 공통적으로 DNA 이중 나선의 절단을 유도하게 된다. 그러면 살아있는 세포는 이러한 이중나선의 절단을 심각한 손상으로 인식하고 이를 복구하기 위한 시스템을 가동한다. 즉, 복구의 속도는 빠르지만 복구원본에 의존하지 않기 때문에 다양한 유전자서열의 변형이 유도되는 NHEJ(Non-Homologous End-Joining)와 주형가닥을 통하여 정확한 복구가 가능한 HDR(Homology directed repair) 두 가지 경로를 이용하여 잘린 DNA가닥을 복구한다 (그림1). 유전자의 제거를 위해서는 NHEJ 경로가, 유전자의 교정 또는 삽입을 위해서는 HDR 경로가 이용되는 셈이다.

[그림 1. DNA 복구기작]
출처 : Nature Protocols 8, 2281–2308 (2013)

나. 체내 교정치료 (In vivo genome editing)

체내 교정치료는 몸에서 세포를 꺼내지 않고 원래 존재하는 상태에서 유전자가위를 주입함으로써 유전자의 변형, 또는 교정을 통해 치료하는 방식이다 (그림2). 체내 교정치료는 다양한 유전자전달 방식을 이용하여 체내에 유전자 가위를 전달하여 질병의 부위를 전신적 혹은 국소적으로 유전자 교정을 하는 방법으로 대부분의 유전질환이 그 대상이다. 뿐만 아니라 암이나 당뇨병 등 난치질환도 치료의 대상이 될 수 있다. 체내 교정치료를 위해서는 유전자 가위 자체 기술도 중요하지만 타겟 조직이나 기관에 유전자가위를 효율적으로 전달하는 약물전달기술의 발전이 동시에 이루어져야 한다. 아무리 유전자가위 효율이 좋다 하더라도 유전자의 변형을 하고자 하는 곳에 도달될 수 없다면 원천적으로 치료가 불가능하기 때문이며 현재로서는 유전자가위 기술보다 유전자 전달기술력이 한계 상황으로 작용한다. 따라서 체내 교정치료를 위해서 중요한 유전자 전달 기술에 대해 알아보고자 한다.   

[그림 2. 유전자 교정치료 방법 (In vivo형/Ex vivo형)]

출처 : 체외 유전체 교정기술 동향 BRIC

다. 유전자 전달체

유전자 가위는 DNA, RNA, 단백질 등 다양한 형태로 전달이 가능하다. DNA형태로 전달하는 경우는 간편하고 안정성이 높으나 면역반응을 일으킬 수 있다는 점과 DNA가 세포내 주염색체에 삽입(integration)되어 안전성의 문제가 발생할 수 있다. RNA 형태 또한 면역반응을 일으킬 수 있는 문제와 안정성의 문제가 우려될 수 있다. 유전자 가위를 단백질 형태로 전달하면 즉각적으로 활성을 띨 수 있고 세포 생존률이 높다는 장점이 있지만 전달 효율이 떨어질 수 있다는 단점이 있다. 높은 치료 효과를 위해서는 유전자 가위의 형태뿐만 아니라 효과적인 전달 방법에 대해서도 고려하여야 한다. 유전자 가위를 체내에 전달하는 방법으로는 크게 바이러스성 전달체를 이용하는 방법, 비 바이러스성 전달체를 이용하는 방법으로 구분할 수 있다.

가) 바이러스성 전달체

바이러스성 전달체를 이용하여 유전자를 전달하는 방법은 바이러스가 세포를 감염시키는 과정에서 바이러스의 핵산물질을 숙주세포에 넣는 특징을 이용하여 전달하는 방법이다. 바이러스 유전자의 일부 필수 유전자를 없애 바이러스의 복제에 제한성을 부여하고 대신 전달하고자 하는 유전자를 삽입한다. 바이러스성 전달체는 크게 DNA 바이러스(Adeno virus, Adeno-associated virus, Herpes simplex virus)와 RNA 바이러스(Retro/Lenti virus)로 구분할 수 있다. DNA 바이러스인  Adeno virus는 약 7.5kb 크기의 유전자를 전달 할 수 있지만 많은 사람들이 기존에 Adeno virus에 노출되기 때문에 급성 면역반응을 일으킬 수 있다는 단점이 있다. Adeno-associated virus(AAV)는 다양한 세포 내에서 발현이 잘되고 분열하는 세포에서 어느 정도 기간 동안 발현을 가능케 하기 때문에 유전자 전달에 가장 많이 활용되는 바이러스성 전달체이다. 다만, 전달할 수 있는 크기가 4.7 kb로 제한되어 있어, Cas9이나 TALEN과 같이 유전자 크기가 큰 가위의 전달에 제한점으로 작용할 수 있다. Herpes simplex virus는 약 20Kb크기를 전달할 수 있고 중추신경계 특이적으로 감염시킬 수 있어서 신경계 질환에 사용하기 용이하다. 하지만 Adeno virus와 같이 대부분의 사람들이 감염경력이 있어 면역반응을 일으킬 수 있어 발현 효율을 저하시키는 문제가 있다. RNA 바이러스인 Retro virus는 8Kb 크기의 유전자를 전달할 수 있고 발현지속성이 있지만 in vivo에서 전달 효율이 떨어진다. Lenti virus는 8Kb 크기를 전달 할 수 있고 Ex vivo에서 가장 널리 사용되는 virus이다. 세포분열 여부와 상관없이 발현이 가능하고 발현 지속성이 6개월까지 확인이 되었고 면역원성이 낮다는 장점이 있다. 하지만 RNA 바이러스 전달체들은 DNA를 주염색체에 삽입시키는 성질이 있어 예상치 못한 돌연변이를 유발할 수 있다는 가능성이 있기 때문에 신중한 선택이 필요하다. 가장 잘 알려진 Lenti virus는 인간면역결핍성바이러스(Human immunodeficiency virus; HIV)를 생체 내로 유전자를 전달시키기 위해 바이러스 유전자를 조작하여 생체 안정성을 향상시킨 전달체이다 (표2).

[표 2. 바이러스성 전달체]

체내 유전체 교정연구에는 전달하고자 하는 세포의 위치, 및 안정성을 고려하여 타겟 세포에 안정적으로 유전자 전달이 가능한 Adono-associated virus(AAV), 중추신경계에 특이적으로 감염시키는 Herpes simplex virus(HSV), 면역반응을 유도하지 않아 신경세포를 타겟으로 하는 Lenti virus를 주로 이용한다.

바이러스성 전달체는 유전자 전달체 연구의 85%를 차지할 정도로 감염세포에 대한 전달 효율이 높아 현재 체내 유전체 교정치료를 위해서 임상 적용 및 연구가 이루어지고 있다. 하지만 아직 면역반응과 전달체 자체의 돌연변이 유발 및 독성의 안정성문제와 전달할 수 있는 유전자의 크기의 제한성을 가지고 있기 때문에 이것을 해결하는 것이 큰 숙제로 남아있다.

바이러스 전달체를 사용할 경우에는 유전자의 크기에 제한이 있기 때문에 1-3세대의 유전자 가위 유전자를 전달하고자 할 때 유전자 가위의 크기가 중요한 요소가 될 수 있다. 1세대 유전자 가위인 ZFN는 2.0 kb 정도로 크기가 작아 다양한 전달체를 이용할 수 있기 때문에 체내 유전자 치료에 적용하기 용이한 측면이 있다. 반면 2세대 TALEN은 크기가 크고 반복서열이 있어서 바이러스 전달체를 사용하기 어렵다. 3세대 CRISPR/Cas9은 높은 효율을 가지고 있지만 SpCas과 같이 비교적 큰 유전자로 구성되어 있기 때문에 이를 바이러스 전달체를 통해 전달하기 쉽지 않다. 이 경우 saCas9, cjCas9등 크기가 작은 경량형 Cas9들이 대안이 될 수 있다. In vivo에서 가장 많이 사용하고 있는 Adeno-associated virus(AAV)는 약 4.7Kb 크기의 유전자만을 전달 가능하기 때문에 ZFN의 경우 전달하기 용이하며, CRISPR/Cas9의 경우 불가능하지는 않지만 제한적으로 전달할 수 있다. 경량형 Cas9과 함께 비교적 작은 Cpf1 등이 활용될 수 있고, 이중벡터 시스템을 활용하여 두 종류의 전달체를 만들어 하나는 Cas9을 다른 한 종류는 guide RNA를 실어 전달할 수도 있다. 표3은 치료제 관점에서 각 세대별 유전자가위 기술이 갖는 특징을 정리하고 있다.

[표 3. 세대별 유전자가위 특징]

나) 비 바이러스성 전달체

비 바이러스성 전달방식은 물리, 화학적 전달방법을 이용하여 유전자를 전달해주는 방법으로 질환부위에 직접 유전자를 전달하는 직접주사 법(Naked DNA injection), 전기적 충격을 통하여 세포 내로 유전자를 전달하는 전기천공 법(Electroporation), 유전자를 미세한 금속으로 코팅한 뒤 유전자 총(Gene gun)을 통해 금속입자와 함께 쏘아 유전자를 전달하는 방법 등의 물리적 전달방법과, 유전자와 전달체가 결합체를 형성함으로써 분해효소들로부터 유전자를 보호하고, 결합체의 표면이 양전하가 되도록 하여 음전하를 띄고 있는 세포표면을 통과할 수 있도록 해주는 지질-유전자 결합체(Lipid-DNA complex : Lipoplex), 폴리머-유전자 결합체(Polymer-DNA complex : Polyplex)와 같은 화학적 전달방법이 있다 (표 4). 비 바이러스성 전달체는 제조방법이 쉽고 면역반응에 대한 우려가 비교적 적으며 유전자의 크기의 제한성이 없다는 장점이 있다. 하지만 전달효율이 떨어지고, 원하는 위치에 전달된다 하더라도 유전자의 발현이 일시적이라는 한계성이 있다. 한계를 보완할 수 있는 비 바이러스성 전달체의 개발이 연구되고 있으며 질환종류 및 전달 위치에 따라 효율적인 전달체의 선택이 중요하기 때문에 바이러스성, 비 바이러스성 전달체의 선택의 다양성을 가지고 목적에 따른 적절한 전달체를 선택하는 것이 필요하다.

[표 4. 비 바이러스성 전달체]

2. 국내외 동향

가. 국외 동향

유전자 가위기술을 이용한 연구 중 체외 교정(Ex vivo)은 64%, 체내 교정(In vivo)은 36%를 차지하고 있고 암과 같은 신생물 질환이 44%, HIV같은 감염성 질환이 39%, 그 외 질환이 17% 이다 (그림3). 임상연구는 총 17건이 진행되고 있고 그 중 1세대 기술인 ZFN가 10건 (61%)을 차지하고 있다. 이중 미국 Sangamo社에서 6건을 수행하고 있다. 임상단계에 진입한 회사는 Sangamo Therapeutics가 유일하다. 2017년 11월 Sangamo는 살아있는 인간에게 ZFN을 활용한 헌터증후군의 유전자치료 임상을 최초로 진행하며 큰 이슈가 되었다. 그 외 B형 혈우병, 헐러증후군 등 열성 유전질환의 치료연구를 수행하고 있다. 3세대 CRISPR 유전자 가위기술은 높은 효율만큼 현재 생체 내 유전체편집에 관한  활발한 연구가 진행 중이다. 2014년 뒤셴 근이영양증 치료, 2015년 청각장애 치료를 목적으로 한 생체 내 유전체 편집기술에 관련한 논문이 게재되었고 꾸준히 연구가 진행 되어 2018년 난소암, 알파 1항 트립신 결핍증, 간질환 치료를 목적으로 하는 생체 내 유전체 편집 에 대한 논문이 발표되었다. 2018년도 4월까지 발표된 논문을 분석하면 1세대 ZFN 기술의 경우 "ZFN & in vivo genome editing"으로 검색 시 21건, 2세대 “TALEN & in vivo genome editing"으로 검색 시 43건이었다. 이에 반해 3세대의 경우 ”CRISPR & in vivo genome editing"으로 검색 시 501건으로 압도적으로 많았다 (그림 3).

[그림 3. 유전자 가위기술을 활용한 치료연구 동향]

출처 : 유전자 가위기술 연구개발 동향 보고서

외국 기업으로는 Sangamo, Editas, Juno, Intellia, cellectis, Servier 등에서 비임상 단계의 연구가 진행되고 있다. 1세대 유전자 가위인 ZFN는 원천특허를 보유하고 있는 만큼 Sangamo Therapeutics가 주도적으로 연구를 진행하고 있고 국가별로는 대부분 미국회사들이 가장 앞서가고 있다. 2세대 TALEN 기술의 경우 Cellectis사와 Servier社에서 연구를 하고 있고 임상시험이 진행 중이다. 가장 연구가 활발한 3세대 CRISPR/Cas9 기술은 Editas, Juno, Intellia 등에서 비임상 단계의 연구를 진행하고 있다. 미국뿐 아니라 중국에서도 쓰촨, 베이징 대학에서 임상 연구가 진행되고 있다. 국가별로 논문과 특허 분석을 해본 결과 미국이 주도적으로 연구를 이끌어가고 있다.

유전자 가위기술이 발전하고 효율이 증대하면서 유전자 가위의 효율이 높은 만큼 비 특이적 절단인 오프타겟(Off-target effect)에 대한 우려와 그것을 개선하고자 하는 연구 또한 진행되고 있다. 특히 3세대 CRISPR/Cas9기술은 타겟 절단 효율이 높기 때문에 in vivo, ex vivo 연구에 활용하기 우수하다. 하지만 타겟하지 않은 부위와 인식하는 20개의 타겟 중에 한, 두개의 뉴클레오타이드가 달라도 절단 가능성이 있다는 위험성이 있어 체내에서 직접 유전체 편집에는 위험성이 따른다. CRISPR의 한 종류인 Cpf1은 Guanine이 많은 부위(PAM)를 인식하여 자르는 Cas9과 달리 Thymine이 많은 부위를 인식하여 절단한다. Cas9보다 오프타겟 위험성이 적다는 연구 결과들이 있어 생체 내 유전체편집의 가능성을 보였다. 세포에 주입할 때 rebonucleoprotein(RNP)형태로 사용하게 되면 세포 내에 protease나 RNase에 의하여 신속한 분해가 가능하기 때문에 Cas9과 Cpf1모두 오프타겟이 줄어들었다는 연구결과가 있다. 특히, eSpCas9, HF-Cas9과 같이 오프타겟이 현격이 준 유전자가위도 개발되고 있다. 오프타겟을 분석하는 방법으로는 전장유전체분석(Whole genome sequencing)이 가능해 지면서 전 유전체에서 발생할 수 있는 오프타겟 위치를 파악하는 방법이 가능해졌다. Digenome-seq, Guide-seq 등 관련된 기술이 보고되었다. 또한 타겟과 유사한 서열을 생물정보학적 도구를 활용하여 찾은 후 그들에 대해 오프타겟이 발생여부를 깊은 수준에서 조사할 수 있는 biased off-target analysis도 행해지고 있다.

최근 bioRXiv에서 유전자 가위의 생체 내 면역반응에 대한 문제가 제기되었다. 널리 사용되고 있는 CRISPR/Cas9의 2가지 종류인 SaCas9(S.aureus hololg of Cas9)과 SpCas9(S.pyogenes homolog of Cas9)은 인체에서 서식할 수 있는 흔한 세균에서 유래한다. SaCas9은 황색포도상구균(Staphlococcus aureus)에서 유래하였고, SpCas9은 화농연쇄상구균(Streptococcus pyogenes)에서 유래하였다. 이 두 균주는 우리가 흔히 접할 수 있는 균주로 스탠퍼드 대학교의 연구진이 혈액샘플을 분석한 결과 참가자의 79%가 SaCas9의 항체를 보유하고 있었고, 65%는 SpCas9의 항체에 양성반응을 나타냈다. 즉 많은 사람들이 이미 그 단백질에 대해서 면역반응을 형성하고 있을 수 있다는 것이다. 이에 따라 CRISPR/Cas9을 생체 내 유전자 치료를 목적으로 한다면 Cas9의 면역성에 대해 심각히 고려해야 할 것이라고 Nature는 경고하고 있다.

유전자 가위기술을 활용한 치료에 대해서는 많은 국가에서 충분한 규제나 가이드라인을 갖추지 못하고 있다. 또한 관련 연구가 빨리 진행되면서 유전자 가위 기술을 어디까지 허용해야 하느냐에 대한 법 규제 논쟁도 가속화 되고 있다. 미국, 영국, 일본 등에서는 희귀 난치병 치료를 위해서는 배아에 관한 기초연구를 허용하고 있고 특히 중국은 관련 규정이 없어 연구가 가장 활발히 진행 되고 있다. 전 세계적으로 인간 생식세포에 대한 연구범위 규제가 완화되고 있는 추세이기 때문에 유전자 가위를 이용한 연구를 통하여 치료 가능한 질환의 범위가 확대될 것으로 기대 된다.

나. 국내 동향

국내는 기초과학연구원(IBS)을 중심으로 유전체편집 연구가 활발히 진행되어왔다. IBS는 1-3세대 국내 원천기술 및 노하우를 확보하고 있고 특히 3세대 CRISPR기술에 대하여 인간 세포 내에서 표적 유전자만 정확하게 절단 할 수 있다는 사실을 처음으로 입증하였다. 2017년 IBS는 미국 연구팀과 공동으로 비후성 심근증 유전자를 보유한 배아세포에서 유전자 가위로 유전자를 교정하는데 성공했다고 최초로 발표하였고 이는 유전자 가위를 이용한 유전자 치료의 성공률을 높임으로써 앞으로의 유전질환 치료의 가능성을 확인할 수 있었다.

또한 2018년 4월 면역반응을 피하여 세포사멸을 최소화 하는 유전자 가위 복합체 도입방식을 개발하였다. CRISPR/Cas9, Cpf1과 같은 유전자 가위를 세포에 주입 시 사용하는 형태인 유전자 가위 복합체(RNP)는 타겟 유전자를 찾아가는 가이드RNA(gRNA)와 Cas9, Cpf1 단백질의 혼합 형태로 제작한다. 이 복합체를 주입할 때, 면역반응이 일어나는 이유에 대해 gRNA말단에 붙은 인산그룹이 외부물질로 인식돼 세포 내 면역반응이 유발되는 것을 확인하였고 gRNA말단의 인산그룹을 제거한 뒤 복합체를 형성함으로써 면역반응을 피하는 방식을 고안하여 실험한 결과 면역반응이 발생하지 않았다. 말단그룹의 간단한 공정을 통하여 면역반응을 일으키지 않는 gRNA를 제작하였고 이는 다양한 세포 내 유전자 치료법에 적용할 수 있을 것으로 평가했다.

서울대학교 연구팀에서는 생체 내 전달이 용이한 캄필로박터 제주니에서 유래한 CjCas9을 개발하여 AAV를 통해 노인성 황반변성 마우스 모델에 전달하였고 신생혈관을 효과적으로 억제하였다는 효과를 확인하였다. CjCas9은 현존하는 유전자 가위 중에 가장 크기가 작아 유전자 치료에 큰 도움이 될 것으로 예상된다. 또한 유전자 가위 복합체(RNP)형태가 세포막 통과가 어려워 전달효율이 떨어진다는 것을 개선하기 위해 양이온 지질(Cation lipid)를 이용해 유전자 가위를 전달하여 Off-target이 거의 없음을 확인하였다.

국내의 유전자가위 기반 임상 연구는 1건도 없다. 다만 툴젠에서 혈액응고인자가 부족해 피가 멎지 않는 혈우병 환자에 대하여 소변에서 세포를 채취하여 역분화 줄기세포(iPSC)를 만들고 유전자 가위를 활용해 교정한 뒤 혈액 응고인자를 만드는 혈관 내피세포로 분화시켜 쥐에 이식한 결과 혈액 응고인자가 생성돼 출혈증상이 개선됨을 확인한 비임상이 진행 되었다. 역분화 줄기세포의 안정성만 확보 된다면 임상 연구에도 적용해 볼 수 있을 전망이다.

우리나라 현행 생명윤리법 등 관련 법령들은 인간배아나 생식세포에 유전자 가위 시술을 하는 연구를 원천적으로 금지하고 있다. 글로벌 연구 경쟁력을 확보하기 위해서라도 인간 배아 연구를 할 수 있게 해줘야 한다는 논쟁이 있으며 대통령령이 정하는 희귀. 난치병 치료 등 일부 조건을 만족할 경우에 한해 인공수정을 하고 남은 잔여배아를 이용한 연구만 허용 하는 규제 완화 의견이 있다. 2017년 배아의 연구범위를 난임치료법, 근이양증, 희귀난치병치료 연구에서 질환을 확대하는 방향으로 개정 되었지만 아직 22개의 희귀난치병에 관한 연구만 가능하다. 배아 연구가 생명윤리를 침해하지 않는 범위 내에서 기초연구가 가능하도록 개정된다면 생명현상의 이해 뿐 아니라 유전자 치료 연구와 다양한 질환의 치료제 개발에 적용 될 수 있을 전망이며, 2018년 현재 관련 생명윤리법의 개정이 국회 발의 중이다.

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