바이오인

합성생물학 핵심기술 및 활용 현황

2023년도 KRIBB 워킹그룹 이슈페이퍼 제3호

 저자 : 한국생명공학연구원 합성생물학연구센터 이대희 외 10명

◈ 목차

1. 개요

2. 주요 동향 및 이슈

  2.1 합성생물학 핵심기술

  2.2 합성생물학 기반 기후위기 대응기술

3. 결론 및 시사점

◈본문

1. 개요

□ 합성생물학

○ 바이오기술을 통한 경제·사회 이슈 해결을 목적으로, 생명체의 기능적 소프트웨어인 ‘DNA’ 부품을 조합하여 논리적인 회로를 설계하고 이를 공학적으로 새로운 생명시스템을 제작·합성·활용에 이용하거나 기존의 생명체를 재설계하여 활용하는 기술 및 학문 분야

○ 바이오기술은 환경, 에너지, 질병 등 다양한 사회문제에 대한 지속 가능한 해결책을 제공할 수 있음

※ UN이 선정한 2030 지속가능한 발전 전략(Sustanable Development Goals) 17개 항목 중 11개 이상에 바이오기술을 통한 기여 가능 (2015, UN)

                                                                                          출처 : 맥킨지 글로벌 인스티튜트

[그림 1] 합성생물학의 주요 활용 분야

 ○ 합성생물학의 글로벌 시장규모는 2022년 약 114억 달러에서 연평균 25.6%로 빠르게 성장해 2027년 약 357억 달러에 이를 것으로 전망(MarketsandMarkets, 2023)

- 범용 기술로서의 합성생물학의 영향력은 농업, 의료, 화학, 에너지, 환경, 식량, 생필품 등 폭넓은 분야로 확대

- 합성생물학은 전 과정(설계(Design)-제작(Build)-검증(Test)-학습(Learn))을 자동화한 바이오파운드리* 도입으로 혁신 가속화 전망

* 바이오파운드리란, 합성생물학 DBTL 기반의 위탁제조기술/시설로, AI·로보틱스로 이루어진 자동화 플랫폼을 활용해 생물학 실험 및 제조공정을 수행

□ 합성생물학 핵심기술

○ 최근 유전자 합성과 편집 기술 등 합성생물학을 가속시키는 기술이 확충되고, AI와 로보틱스 등 IT 기술과의 융합을 통해 새로운 전기를 맞음

- (유전자 합성) 합성생물학의 상향식(Bottom-up) 접근을 위한 유전체 합성은 기존의 짧은 길이의 DNA 화학 합성 문제를 극복하기 위해 무주형 DNA 합성 효소, 바이오파운드리 기반 어셈블리 등 다양한 기술이 개발됨

- (유전자 편집) 3세대 유전자 편집기술(CRISPR)은 의료 분야 외에도 합성생물학 유전체 무결점 합성을 위한 다중 교정이 가능함

- (AI 융합) AI, ML, ITC, 로보틱스, 증강현실 등 신기술이 바이오 R&D 및 산업현장에 적용되면서 연구 속도/규모가 대폭 향상되고 바이오의 고질적 문제인 장기간의 연구와 고비용의 한계를 극복할 수 있는 가능성을 제시함

□ 합성생물학 기반 기후위기 대응기술

○ 글로벌 이슈인 탄소중립을 위한 생물학적 탄소포집 및 유기화합물 생산 바이오 프로세스 필요성 대두

- 탄소배출을 억제하기 위한 직접 규제 및 시장원리 활용 간접 규제 정책 시행

※ 탄소중립은 기업의 경영화두인 ESG(Environmental, Social, Governance)의 최우선 해결 과제

※ EU는 재생 에너지 지침(Renewable Energy Directive, RED) 가이드라인 제작하였으며, 2026년부터 탄소국경조정제도(CBAM)에 따른 탄소 국경세 부과 예정임. 이와 더불어 EU 및 비 EU국가 탄소세 부과(평균세율 32.8 USD/tCO2e) 및 온실가스 배출권 거래제 시행

- 미세조류, 메탄자화균 등 탄소중립을 위한 합성생물학 기반 미생물 공장 개발 필요

2. 주요 동향 및 이슈

 2.1 합성생물학 핵심기술

□ (Design) AI 기반 화학 합성 경로 예측

○ 머신러닝 기반의 Retro synthesis 예측 연구

- 1969년 처음 제시된 Retro synthesis는 목적 화합물에서부터 상업적으로 이용 가능한 시작 분자에 도달할 때까지 대상 화합물을 더 단순한 빌딩 블록으로 반복적으로 분해하는 반응 설계를 뜻함

- Retro synthesis는 가능한 화학적 변형의 수가 방대하여 검색 공간이 방대하여 최적 경로를 선택하는 것이 어렵다는 기술적 한계로 확장성에 제한이 있었음

※ 방대한 화학적 변형의 수로 인해 전문가의 경우에도 가능한 수많은 역합성 경로 중에서 최적의 경로를 선택하는 것이 쉽지 않은 기술적인 한계를 가짐. Retro synthesis의 기술적인 한계를 극복하기 위해, 컴퓨터 기반 화학 합성 예측 연구가 진행되었으나 부정확성, 높은 계산 비용으로 인한 제한된 확장성을 지님

- 최초로 시도된 AI 기반 Retro synthesis 예측 프로그램은 Deep-learning neural network 알고리즘을 이용하여 알려진 단일 유기화학반응을 학습하여 구축됨. 학습된 AI 알고리즘을 이용해, 사용 가능한 출발 물질을 찾아낼 때까지, 다단계 합성 및 분자 해체의 과정을 반복해 실제 화학 합성 경로를 제안함

- 글로벌 제약사 Merck는 인공지능 기반 화학 합성 예측 분야의 선두 기업인 Chematica를 인수하는 등 화학 기반 제약 회사들의 연구 보조로써 인공지능 화학 역합성 예측 프로그램이 적극 사용될 것으로 기대됨

□ (Build) 무주형 DNA 합성 효소

○ DNA polymerase의 한 종류인 무주형 DNA 합성 효소는 주형 DNA 없이 인공적인 DNA 합성이 가능하여 차세대 DNA 합성 기술로 주목

※ 2000년대 중반 NGS(next generation sequencing) 등장 이후 DNA read는 폭발적으로 방대한 유전 정보를 분석할 수 있게 되었으며, 2010년 이후 기존 화학적인 합성은 200bp 이상 합성하기 어려운 기술적인 한계가 있었기 때문에, DNA write(synthesis)는 차세대 DNA 핵심 기술로 각광받음

- 무주형 DNA 합성 효소(TdT, terminal deoxynucleotidyl transferase)는 DNA 조각의 말단에 붙어(5′ to 3′) 주형 DNA 없이 4 종류의 뉴클레오타이드(A, T, G, C)를 무작위로 붙이는 효소

- 설계된 DNA 서열 합성을 위해 reversible termination을 이용하여 3′ 위치에 terminator를 이용하여 단일 반응 동안 한 개의 뉴클레오타이드만 붙게 하여 정확한 서열의 DNA를 합성

- DNAscript사는 무주형 DNA 합성 효소를 이용한 bench-top DNA 합성 장비인 SYNTAX를 상용화함

                                                                               출처 : Nature Reviews Chemistry (2023)

[그림 2] 무주형 DNA 합성효소 기반 유전자 합성 기작

□ (Build) mRNA 합성

○ (필요성) mRNA 기반 백신은 코로나19 팬데믹을 극복하기 위해 진행된 다양한 연구 중 획기적으로 발전

- mRNA 기반 백신은 단순히 염기서열을 변형하면 된다는 점에서 새로운 항원에 대해 편리한 적용성을 가짐

- mRNA 백신은 또다른 감염병에 대해서도 신속한 대응이 가능할 것으로 기대

○ mRNA 합성

- mRNA의 구조는 5′ cap, 5′ UTR, ORF, poly(A)tail 으로 이루어짐

- 5′ cap : 7-methyl guanosine 5′(m7G), 5′-triphosphate bridge(pppGpN) Capping 구조를 지니고 있음. mRNA 전사 과정에서 Cap analogue의 추가를 - 통한 capping 방법이 가장 일반적임

- UTR : 코딩 영역의 Upstream과 Downstream에 존재하는 비코딩 서열로 mRNA의 안정성 및 번역 효율에 큰 영향을 미쳐 서열 최적화 과정이 필요함

- ORF : mRNA에서 단백질을 코딩하는 서열. 빈번한 코돈의 사용 및 번역 속도의 안정화를 위해 코돈의 최적화가 필요함

- Poly(A)tail : RNA exo-nuclease의 분해 과정을 늦춰 안정성, 생체 내 반감기를 증가시켜 번역 효율 향상에 큰 도움을 줌. DNA 주형에 Poly(A)tail을 포함해 전사하는 방법과 전사 후 추가하는 방법이 있음

○ mRNA의 정제

- mRNA는 전사 후 Tangential flow filtration 방법을 이용해서 순도 90~95%의 수율로 정제됨

- Size exclusion, ion exchange, affinity chromatography 등의 방법을 이용해 더 높은 수율로 보완되어 정제됨

□ (Build) 크리스퍼 유전자가위

○ (개념) 핵산분해효소(nuclease)인 크리스퍼(CRISPR) 단백질과 가이드 RNA(gRNA)로 구성된 시스템으로, 가이드 RNA서열과 상보적인 DNA 이중가닥을 절단함으로써 표적 유전자를 교정할 수 있는 기술

- 크리스퍼 유전자가위는 생명 시스템의 설계도인 DNA 염기서열을 교정하거나 그 발현을 조절하는 데 용이하여 생명 시스템을 변형 또는 합성하는 합성생물학의 발전을 가속화

- 합성생물학의 설계-제작-시험-학습(Design-Build-Test-Learn)의 공정 과정 중 특히 제작(Build) 단계에서 정확한 유전체 제작 및 유전자 발현 조절에 유전자가위 이용

                                                                                                 출처 : Science (2014)

[그림 3] 크리스퍼 유전자가위의 모식도

                                                                                                                                                               출처 : Nature communications (2018)

[그림 4] 크리스퍼 유전자가위의 활용

○ (특징) 크리스퍼 유전자가위는 용이성 및 경제성, 광범위한 유전자 다중 교정의 수월성 측면에서 강점

- 기존의 1, 2세대 유전자가위*가 목표 유전자에 따른 단백질 변이를 요구하는 반면, 3세대 크리스퍼 유전자가위는 RNA 염기서열 변경만이 필요하므로 단백질 기반 유전자 가위에 비해 저렴한 비용으로 빠르고 쉽게 유전자 교정이 가능

* 1세대 유전자가위 ZFN와 2세대 유전자가위 TALEN 기술은 원하는 DNA 염기를 단백질의 조합으로 인식하는 시스템을 사용

- RNA 기반 유전자 교정 기술이라는 특징으로 인해 다양한 염기서열을 가진 핵산 라이브러리를 구축하고 세포에 도입하여 유전체 단위로 다중 교정이 가능

※ 다양한 염기서열을 가진 RNA가 크리스퍼 유전자가위와 결합하도록 설계하여 단백질에 광범위한 변이를 도입하여 목표한 변이 단백질 선별에 성공

- 유전자 변이를 유도한 유전체의 주요 위치를 크리스퍼 유전자가위가 절단을 유도하여 항생제 선별법*을 사용하지 않고 세포 선별 가능

* 항생제 선별법: 목표한 유전자가 발현할 때, 특정 항생제에 저항해 생존 또는 사멸하도록 세포에 항생제 내성 유전자를 넣어 세포를 선별하는 방법. 항생제에 부작용 발생의 위험이 있으며 다중 선별이 어려움

○ (활용) 정밀 DNA 교정을 통한 인공유전체 합성 – 상향식(Bottom-up) 유전체 제작

- 상향식 유전체 제작은 기존 유전체를 합성 DNA로 단계적으로 대체하여 유전체를 제작하거나 여러 합성 DNA를 조합하는 방식

- 유전체 대체는 미생물의 경우 상동재조합(homologous recombination) 방식을 주로 활용해왔으나, 최근 크리스퍼 유전자가위를 활용하여 보다 정확한 유전자 교정을 통해 합성 유전체 개발에 성공

※ 2016년 개발된 CRISPR-Cas9을 이용한 합성 DNA(>100kb) 대체법을 이용하여 2019년 코돈수를 줄인 대장균 인공유전체 합성 성공

- 여러 합성 DNA를 조합한 유전체의 오류를 크리스퍼 유전자가위로 교정하여 목표 유전체의 오류를 제거하고 정확하게 합성하는 데 성공

※ 2017년 조합한 합성 DNA의 모든 변이를 크리스퍼 유전자가위로 교정하여 ~536kb의 효모의 여러 유전체 중 5번째 유전체를 인공 염색체로 제작

[표 1] 크리스퍼 유전자가위 기반 주요 미생물 유전체 교정

                                                                                                                                                 출처: Journal of Microbiology (2023)

○ (활용) 생존에 불필요한 유전체 제거 - 하향식(Top-down) 유전체 제작

- 하향식 유전체 제작은 기존 유전체에서 불필요한 유전자 또는 DNA 서열을 제거하거나, 필요 시 다시 제거한 유전자를 도입하는 방식으로 최소 유전체 제작

- 상동재조합을 쓰기 어려운 동물 세포의 합성 유전체 제작을 위해서는 정확하고 빠르게 거대 유전자를 제거 및 삽입할 수 있는 새로운 방법이 필요

- 최근 크리스퍼 유전자가위 기반 기술이 거대 유전자를 교정(제거, 삽입)할 수 있는 가능성을 제시

※ 2022년 크리스퍼 유전자가위 기반 유전자 교정 기술을 활용하여 동물세포에서 1~10kb의 유전자를 제거하고 수십 bp(≤60bp)의 합성 DNA 삽입 성공

○ (활용) 정교한 유전자 발현 조절을 통한 생명체의 대사 제어 - 유전자회로 구성

- 정확하게 유전자 발현을 조절하기 위해서는 정교한 유전자회로 구성이 필수적임. 기존의 전사 인자(transcription factor) 단백질을 통한 유전자 발현 조절은 내재 인자들과의 상호작용 때문에 모듈화(modularity), 프로그래밍화(programmability), 직교화(orthogonality)가 어려움

- 크리스퍼 유전자가위를 활용한 유전자회로 구성은 이러한 단점을 극복하고 보다 간단한 방법(RNA 염기서열 변화)으로 다양한 유전자의 발현 조절이 가능함

- 크리스퍼 유전자가위는 전사 억제 또는 활성 인자와의 융합을 통해 특정 유전자의 발현 조절*이 가능하여 전사인자를 대체할 수 있음

* 전사조절 크리스퍼 유전자가위는 크리스퍼 활성 시스템(CRISPRa), 크리스퍼 억제시스템(CRISPRi)이 있으며 절단활성을 제거한 비활성 Cas 단백질(dead Cas, dCas)을 사용하여 표적 DNA를 인식하나 절단하지 않음. 전사조절 단백질을 이용하여 표적 DNA의 전사조절이 가능함

                                                                                                                                         출처 : Biochemical Society Transactions (2020)

[그림 5] 크리스퍼 유전자가위를 활용한 전사 제어 예시

- 최근 크리스퍼 억제시스템(CRISPRi)를 이용한 지능형 유전자회로 제작을 통해 무항생제 제조합 플라스미드 선별시스템 개발

※ 무항생체 시스템으로 항생제 내성 유전자의 확산 위험을 줄이고 기존 항생제 기술보다 플라스미드 선별효율이 높고 단백질 생산량 증가를 입증함

※ 바이오제품 대량생산의 제조공정에는 인체 전달율과 항원 발현율에 유리한 작은 크기의 플라스미드를 선별하는 것이 중요함. 플라스미드 선별 마커로 항생제 내성 유전자가 아닌 매우 작은 가이드 RNA를 이용한 해당 시스템은 플라스미드 크기를 줄일 수 있는 특장점을 가짐

□ (Test-Learn) Artificial intelligence(AI, 인공지능)/Machine learning(ML, 머신러닝) 기반 합성생물학

○ 합성생물학의 유전자 설계/제작, 바이오파운드리 기반 자동화시스템, 바이오공정 개발 등은 인공지능/머신러닝 등과 연계하여 보다 정확한 예측과 설계가 가능함

○ 단백질/효소 개량

- 기존 단백질/효소 개량은 대량의 표현형과 유전형질 분석이 필요함. 이를 해결하기 위해 최근 AI/ML을 기반으로 보다 효율적이며 적은 수의 실험을 통한 개량이 진행됨

- 타깃 단백질의 상동 서열 국소 잔기 간 관계와 단백질 서열-구조 특징을 통합하는 deep learning 알고리즘인 ECNet(evolutionary context-integrated neural network)을 개발하여 beta-lactamase의 활성증가를 높은 성공 확률로 진행함

- AI기반 단백질 구조 구축과 반응 화학물질 주변 잔기 설계를 통해 다양한 기질에 반응하는 신규 합성 luciferase를 개발함

○ 대사경로 개량

- 합성생물학 DBTL 순환공정과 AI/ML의 연계는 더 적은 순환공정을 이용하여 정확한 예측과 최적의 물질생산을 가능하게 함

- 바이오부품 13개를 조합하고, 인공 유전자회로를 이용하여 데이터를 만들어 ML을 이용한 분석을 통해 Yeast에서 트립토판 생산을 74% 증가시킴

- 효모의 모든 promoter의 DNA 서열정보와 세기 데이터를 이용하여 모델을 구축, 대사경로 조절 설계에 사용함

○ 바이오공정 개선

- 산업적 대규모 생산은 노동/자원 집약적이기 때문에 공정 개발에 어려움이 있음. 이를 해결하기 위해 디지털 트윈(digital twin) 등 모델을 이용한 최적의 공정 개발을 시도함

- 최근 fluid dynamics와 대사 모델링을 이용하여 기질의 heterogeneity를 해결하여 생산성을 증대시킨 결과가 보고됨

...................(계속)

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