바이오인

[바이오신약] 신약 개발을 위한 인간화 마우스의 연구 동향

유대열 / 한국과학기술한림원 정회원, 지에이치바이오(주) 기술고문

◈ 목차

1. 인간화 마우스 개발의 필요성

2. 면역부전 마우스의 개발 동향

  가. 누드마우스

  나. SCID 마우스

  다. NOD-SCID 마우스

  라. Rag1^-/- 마우스

  마. Rag2^-/- 마우스

  바. NSG/NOG/NIG 마우스

  사. BRG 마우스

  아. NRG 마우스

3. 면역부전 마우스의 인간화 모델 연구

  가. 인간화 마우스의 발달

  나. 혈액/림프(Hematolymphoid) 인간화 마우스의 특성

  다. 질환 연구를 위한 인간화 마우스 모델

4. 향후 전망

◈본문

1. 인간화 마우스 개발의 필요성

동물 모델은 의과학 연구, 특히 인간 질환의 병인 연구는 물론 신약 개발을 위한 비임상 연구에 아주 중요한 연구 자원이다. 이 중 마우스는 해부학적•︎유전학적으로 인간과 유사한 면이 많고 크기가 작아 관리하기 용이하며 연구자가 쉽게 이용할 수 있어 다양한 용도의 동물 모델로 의과학 연구에 중요한 역할을 하여 왔다. 그러나 마우스와 인간은 대사 및 면역학적인 측면에서 근본적으로 달라, 마우스 연구 결과를 인간에 곧바로 적용하는 데 한계가 있다. 이러한 점에서 인간과 가장 가까운 동물인 영장류를 신약 개발에 활용하고 있으나, 영장류는 고가이고 특히 윤리적인 면에서 접근하기가 어렵다는 단점이 있다. 이상을 고려할 때, 기능성 인간 세포 또는 조직으로 이식된 마우스인 인간화 마우스(humanized mice)는 소동물의 생체 내 환경하에서 인간 세포와 조직의 기능과 발달에 대한 연구를 가능하게 하는 고유한 장점을 지니고 있다. 그동안 다양한 범주의 인간화 마우스를 개발하기 위해, 면역시스템 성분, 간세포, 피부조직, 췌장 소도, 자궁내막, 그리고 신경세포를 포함하는 각종 인간 세포와 조직이 마우스에 이식되어 왔고, 이들 중 기능성 인간 면역시스템 성분들로 이식된 인간화 면역 시스템을 지닌 마우스는 인간화 마우스의 원형으로 가장 널리 연구에 활용되고 있다.

우리나라도 대학, 출연연 및 기업의 일부 연구실에서 면역부전 마우스를 이용한 인간화 마우스 연구에 관심을 갖고 있으며 연구가 활발히 진행 중에 있다. 그동안 인간화 연구를 위한 면역부전 마우스는 대부분 미국과 일본으로부터 수입에 의존하고 있었으나 최근 본사를 비롯한 일부 기업에서 하나 둘 국산화가 진행되어 연구 현장에서 활용되고 있다. 인간 세포를 지닌 인간화 마우스는 국내에서 확보하기 어려워 대부분 외국으로부터 수입에 의존하고 있으며 상당히 고가이므로 일반 연구자들이 접근하기 어려운 실정이다. 따라서 우리나라가 신약 개발 및 의과학 연구를 활성화하기 위해서는 비임상 모델로써 인간화 마우스 개발연구가 절실한 상황이다.

본 글에서는 면역부전 마우스와 이 면역부전 마우스를 이용한 인간화 마우스의 개발 및 연구 활용 현황을 살펴보며, 우리나라의 비임상 마우스 모델의 연구개발 및 활용의 활성화를 기대한다.

2. 면역부전 마우스의 개발 동향

 면역부전 마우스의 역사를 살펴보면(표 1), 1962년 T 세포가 결손된 누드마우스의 발견이 첫 번째 면역부전 마우스이다. Balb/c 마우스 사육 중 자연발생적으로 태어나는데, 실험동물로 연구 개발되어 오늘날도 전 세계적으로 유용하게 활용되고 있으며, 1983년 T 세포와 B 세포가 결손된 중증 복합 면역부전증[severe combined immnunodeficiency(SCID)]을 일으키는 SCID 마우스가 두 번째 면역부전 마우스로 발견되었고 인간 조혈모세포(Human Hematopoietic Stem Cells; HSCs)의 이식이 가능하나 효율이 낮아 이를 개선하기 위해 NOD/ShiLtSz 마우스와 교배하여 생산된 NOD-SCID 마우스가 1995년 개발되었다. 하지만 NOD-SCID 마우스는 선천적인 면역체계가 아직도 남아 있어 인간 조혈모세포의 이식률의 향상을 위한 연구가 필요하였다. T 세포가 완전히 결손 되었거나, 결손이 심한 것이 특징인 인간의 X-연계된 중증 복합 면역부전증(X-SCID)은 IL-2 Receptor γ 체인 유전자가 돌연변이된 것으로 알려져 있다. 이 점을 착안하여 NOD-SCID 마우스에서 IL-2 Receptor γ가 결손(knockout)된 면역부전 마우스를 만들기 위해 NOD-SCID 마우스와 IL-2 Receptor γ^-/- 마우스를 교배한 결과, T 세포, B 세포는 물론 NK 세포가 거의 완전히 결손된 것이 확인되었다. 이 방법으로 NOG 및 NSG 마우스가 2002년과 2005년 개발되었고, 오늘날 대표적인 중증 면역부전 마우스로 전 세계적으로 널리 연구에 활용되고 있다. 한편 1992년 Rag2의 결손에 의해 T 세포와 B 세포가 결손된 Balb/c 마우스가 개발되었고 2004년 Rag2^-/- 마우스에 IL-2 receptor γ 유전자가 결손되어, NSG/NOG 마우스처럼 B, T, NK 세포가 결손된 BRG 마우스가 개발되었다. 최근 본 연구팀도 유전자 교정기술에 의해 NOD-SCID 마우스에 직접 IL-2 receptor γ 유전자를 결손시켜 NSG 마우스와 거의 똑같은 면역부전 현상을 보이는 NIG 면역부전 마우스를 제작하여 국내 연구현장에 공급하고 있다.

이처럼 면역세포 인간화를 위한 면역부전 마우스가 다수 보고되어 있지만 지면 관계로 본고에서는 연구현장에서 널리 활용되고 있는 마우스를 중심으로 더 자세하게 설명하고자 한다.

[표 1] 면역부전 마우스의 개발사

가. 누드마우스

 누드마우스는 1962년 Norman R. Grist와 1966년 Flanagan에 의해 발견되었고(Charles River 자료), 또한 1968년 Pantelouris의 보고에 의하면 누드마우스는 태어나면서부터 일생동안 털이 없고 흉선(thymus)이 완전히 결여되어 있음이 확인되었다. 누드마우스는 T 세포가 결핍되어 있고, 무흉선인 동형접합체(homozygotes) 마우스는 면역시스템에 많은 결점이 있는데, 즉, 림프절과 비장의 흉선 의존적 부위로부터의 림프구(lymphocytes)가 고갈되어 있고, 거의 대부분 B 세포로 구성되어 있는 림프구 군도 상당 수준 줄어들어 있으며, 흉선 의존적 항원에 비교적 정상적인 IgM 반응을 보이고 있고, 동종 그리고 이종 피부 및 종양의 이식을 거절할 수 없는 점을 포함하여 흉선 의존적 항원에 매우 나쁜 반응을 보일 뿐만 아니라 감염에 크게 증가된 감수성을 보이고 있다(Gershwin 등, 1975; Pantelouris, 1973; Rygaard, 1973; Rygaard and Povlsen, 1974). 이형접합체(heterozygotes) 마우스(nu/+)는 털이 있으며 유사유전자형(congenic) 대조군 마우스(+/+)처럼 50-80% 크기의 흉선을 지니고 있다.

 유전학적으로 누드마우스는 상염색체 열성(autosomal recessive)으로 처음에는 nu로 기술되었으며, 돌연변이된 유전자가 HNF-3/forkhead 상동 11 유전자에 있는 것으로 확인되었고, 2000년 돌연변이된 유전자가 Fox 유전자 가족(family)의 하나로 확인되어 Foxn1nu로 업데이트 되었다. FOXN1 유전자 결손 마우스는 누드 표현형을 보인다. 누드 암컷은 유선 발달이 저하되어 새끼에게 젖을 줄 수 없으므로 누드 수컷을 이형접합 암컷과 교배하여 육종한다. 동형접합 누드마우스 새끼는 생후 24시간 안에 코수염이 없거나 코수염의 상태(구부러짐)가 안 좋아 정상과 구별될 수 있다. nu/nu 마우스의 생존을 극대화하기 위해서는 정상 한배새끼(littermates)를 골라 빼놓는 것이 좋다(ILAR, 1989).

 누드마우스의 수명은 6-12개월이고, 무균(germ free) 환경에서는 정상 마우스와 비슷하게 살 수 있다. 동형접합 nu/nu 마우스는 광범위한 세균 및 바이러스 병원체에 의한 감염에 매우 민감하여 isolator, micro-isolator, laminar flow cabinet 또는 병원체가 없는 환경에서 사육되어야 한다.

 누드마우스는 인간 고형암(solid tumor)의 연속적인 이식(serial transplantation)에 유용한 것으로 일찍부터 알려졌고, 그 형태적기능적 특성은 연속적인 이식기간 중에 잘 보존되어 있다고 한다(Sordat 등, 1975). BALB/c-nu가 다른 누드마우스에 비해 비교적 종양이식이 잘 되는 것으로 알려져 있다(Dagnæs-Hansen 등, 1992). 그러나 인간 소화기암의 종양 발달율은 CBA/N, NSF/N, NIH 누드마우스와 비교하여 BALB/c-nu가 더 낮은 것으로 알려졌다(Maruo 등, 1982). 이처럼 누드마우스는 T 세포가 결핍되어 있어 악성종양세포의 이식에 널리 사용되어 왔지만, 백혈병 또는 림프종과 같은 혈액암의 이식에는 적합하지 않다. B 세포와 선천적인 면역세포(innate immune cell)를 지니고 있어 주로 인간 정상세포의 이식을 허용하지 않으며, 자라는 속도가 느리거나 원발성 종양세포 또는 이종(heterogeneous) 종양 조각의 이식에도 적당한 모델이 아니다. 그리고 일반적으로 간암세포인 HepG2 세포를 누드마우스에 이식하면 종양 형성이 되지 않는 것으로 알려져 있으며, 폐암세포인 A549 세포를 피하 이식해도 종양 형성이 매우 저조하다(Kwon 등, 2015).

나. SCID 마우스

 중증 복합 면역부전증을 일으키는 돌연변이 마우스(SCID 마우스)는 1983년 Bosma 등에 의해 CB17 마우스 계에서 발견되었다. 중증 복합 면역부전증은 DNA-dependent protein kinase catalytic subunit(PRKDC) 유전자의 돌연변이로 일어난다. PRKDC는 DNA 의존적 protein kinase의 촉매 subunit를 코딩하는 유전자로, DNA 수복(repair) 그리고 T 세포 수용체(T Cell Receptor: TCR) 및 면역글로불린(Immunoglobulin: Ig) 유전자의 체세포 재조합(somatic recombination) 동안 일어나는 이중가닥절단(double strand break)을 봉하는 역할을 한다. 따라서 PRKDC 단백질이 없으면, T 세포 수용체와 면역글로불린 유전자가 재편성(rearrange) 되지 못해, 결과적으로 마우스는 B 및 T 세포가 결핍된다. SCID 마우스는 림프구 전구세포를 지니고 있으나, 이들 세포는 성장하지 못하므로 흉선에서 B 및 T 세포를 생성하지 못한다. PRKDC 단백질은 DNA 수복에 관여하기 때문에 SCID 마우스는 방사선(radiation)에 민감하여 방사선 조사가 필요한 실험인 경우 적합한 모델이 아니다. CB17-SCID 마우스는 인간 말초혈액단핵세포(peripheral blood mononuclear cells: PBMC)와 인간 조혈모세포의 이식이 가능하지만 인간 HSCs의 접종을 방해하는 NK 세포, 마크로파지, 과립구(granulocytes)를 지니고 있어 이식률이 낮다. 이러한 문제점을 개선하기 위해 NOD-SCID 마우스가 개발되었는데, 이 마우스는 CB17-SCID 마우스를 NOD/ShiLtSz 마우스와 교배하여 만든 것이다(Shultz 등, 1995). NOD/ShiLtSz background는 제1형 당뇨 모델(a polygenic model for type 1 diabetes)로, 털색은 흰색이다.

다. NOD-SCID 마우스

 위에서 언급한 바와 같이 NOD-SCID 마우스는 CB17-SCID 마우스를 NOD/ShiLtSz 마우스와 역교배하여 만들었고 NOD.CB17-Prkdcscid/J 라고 명명되었다. 이 NOD-SCID 마우스는 선천적인 면역체계(innate immune system)가 약화되었다. 즉, NK 세포 활성이 줄어들었고, 마크로파지 기능이 제대로 발휘되지 못하였다. 이 결과, CB17-SCID 마우스에 비해 인간 HSCs와 PBMC 이식률이 높아졌다(Hesselton 등, 1995; Lowry 등, 1996; Pflumio 등, 1996). 수명은 흉선 림프종(thymic lymphomas)으로 8-9개월 정도이나 당뇨병은 유발되지 않는다. 털색은 흰색이다.

라. Rag1^-/- 마우스

 Rag1은 면역글로불린과 TCR 유전자들의 V(D)J recombination 반응을 활성화하거나 촉매하는 기능을 지니고 있어, Rag1^-/- 마우스는 B 세포 및 T 세포를 포함하고 있지 않고, 단지 작은 림프기관(lymphoid organs)을 지니고 있다(Mombaerts 등, 1992). SCID 마우스가 나이가 들면 누출현상(leaky)으로 약간의 B 세포와 IgM을 생산하는 반면, Rag1^-/- 마우스는 non-leaky하여 림프구가 존재하지 않는다.

마. Rag2^-/- 마우스

 Recombination activating gene 2 단백질(Rag2)은 RAG2 유전자에 의해 인코드된 림프구 특이적 단백질이다. Rag1과 함께, Rag2는 VDJ recombinase를 이루는데, 즉, 면역글로불린과 T 세포 수용체 유전자들의 가변부가 발달하는 B 및 T 세포에 결집되는 동안, VDJ recombination 과정에 필요하다. Rag2^-/- 마우스는 SCID 마우스에서 관찰된 leakiness와 방사선 감수성(radiosensitivity)이 보이지 않는다(Shinkai 등. 1992). 따라서 RAG2 유전자의 기능 상실은 T 세포, B 세포를 결실한 마우스를 생산하기 충분하다.

바. NSG/NOG/NIG 마우스

 IL-2 Receptor γ chain은 IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 그리고 IL-21 receptors의 기능에 필요한 수용체 단백질로, IL-2 Receptor γ가 결손되면 다른 사이토카인들의 기능이 발휘되지 못한다. NK 세포가 생성되기 위해서는 IL-7과 IL-15에 의한 신호전달이 중요하며, IL-2 Receptor γ가 결손되면, 이 NK 세포는 생성되지 않는다. 따라서 NOD-SCID 마우스에 남아있는 NK 세포뿐만 아니라 T 세포, B 세포까지 완전히 결핍된 면역부전 마우스가 다음과 같이 개발되었다.

① NOG 마우스

 일본 실험동물중앙연구소(CIEA)가 NOD/Shi-scid 마우스와 C57BL/6J-IL-2Rγnull 마우스(exon 7부터 exon 8까지 neomycin 저항 cassette와 교체됨)를 교배하여 만든 마우스 NOD/Shi-scid 마우스와 계속 역교배하여 만든 congenic 마우스(NOD/Shi-scid IL2rgnull)이다(Ito 등, 2002). T, B, 그리고 NK 세포가 만들어지지 않는 마우스이고, leakiness와 자연발생적인 흉선 림프종도 생기지 않는다. 따라서 이 마우스는 인간세포의 이식에 의한 증식과 분화연구에 아주 유용한 최상의 면역부전 마우스이므로 암, 감염, 재생 및 혈액 등의 인간 질환의 치료 연구에 널리 이용되고 있다.

② NSG 마우스

 미국 Jackson Lab이 NOD/LtSz-scid 마우스와 IL2rg null 마우스(exon 3 일부 ~ exon 8까지 neomycin 저항 cassette와 교체됨)를 교배하여 만든 마우스를 NOD/LtSz-scid 마우스와 계속 역교배하여 만든 congenic 마우스(NOD/LtSz-scid IL2rgnull)이다(Schultz 등, 2005). T, B, 그리고 NK 세포가 만들어지지 않는 마우스이다. 일본 CIEA가 만든 NOG 마우스와 똑같은 면역부전 마우스이다.

③ NIG 마우스

 본 연구팀이 CRISPR/CAS9 기법으로 제작한 면역부전 마우스다. 즉, NOD.CB17/PrkdcSCID-JKrb 마우스의 수정란에 IL-2 Receptor γ 유전자 gRNA와 CAS9을 미세 주입함으로써 유전자 교정기법으로 IL-2 Receptor γ 유전자 2 bp가 결손된 마우스다(Bak 등, 2020). 이 NIG 마우스는 IL-2 Receptor γ 유전자가 발현되지 않으며 혈액과 비장세포를 추출하여 T, B, 그리고 NK cell의 성분을 조사한 결과, T, B, 그리고 NK 세포가 검출되지 않았고, 이 마우스 피하에 HepG2 세포를 이식한 결과, 종양이 잘 자라고 있음을 확인하였다. 반면, 대조군 마우스(누드마우스 및 NOD-SCID 마우스)는 종양이 형성되지 않았다. 또한 Raji 세포와 A549 세포를 이식한 결과도 HepG2 세포를 이식한 결과와 유사하게, NSG 마우스에서 종양 형성이 잘 되었으나 대조군 마우스에서는 종양이 잘 자라지 않았다. 이상의 암세포 이식 실험결과, NIG 마우스는 NSG 마우스와 아주 유사한 면역부전 마우스임을 확인하였다.

사. BRG 마우스

Balb/c 마우스에 Rag2 및 IL-2 receptor γ gene이 결손된 마우스이다 (Traggiai 등, 2004). 따라서 BRG 마우스는 T 세포와 B 세포의 결핍뿐 아니라 NK 세포도 상당 수준 결핍되어 있다.

아. NRG 마우스

NOD-Rag1-/- 마우스와 NOD-scid IL2 receptor γ-/- 마우스를 교배하여 만든 마우스(Pearson 등, 2008)로 B 세포 및 T 세포가 결핍되어 있고, 또한 기능성 NK 세포도 결핍되어 있는 마우스다.

...................(계속)

☞ 자세한 내용은 내용바로가기 또는 첨부파일을 이용하시기 바랍니다.