바이오인

2.4. 공간적 단일세포 단백체학

□ 논문 개요

• ○본 논문(Zeng et al., 2023)은 2023년 6월 Science지에 발표되었음

• ╶︎총 13명의 저자로, 미국 MIT 연구소와 Harvard 대학에서 발표

• ╶︎2023년 Science지의 IF=56.9, JCR < 1%

□ 연구 배경

• ○유전자조절이 전사수준과 단백질번역수준 모두에 의해 영향을 받기 때문에 전사체와 단백체의 상이성이 존재하므로 유전자발현과 번역조절에 대한 포괄적 이해를 위해서는 단일세포 및 공간적 단백질 합성 프로파일링이 필요

• ○기존연구는 대량 및 단일세포 리보솜 프로파일링을 통해 전사체 규모에서 단백질 번역을 분석할 수는 있었으나 현재의 이미징 기반 방법으로는 공간적 정보는 얻을 수 없음

• ○이를 해결하기 위해 본 논문에서는 단일세포 또는 세포 소기관 수준에서 3차원 in situ 리보솜-결합 mRNA 맵핑(RIBOmap, 리보맵) 방법을 개발

□ 연구 내용

• ○리보맵 디자인과 가능성 확인

• ╶︎단백질이 번역 중인 mRNA를 선택적으로 감지하기 위한 전략을 위해 3개의 프로브를 사용함으로써 단일세포 수준에서 단백질 합성의 공간적 지도를 작성하도록 디자인 (그림 11A)

• ╶︎자물쇠(padlock) 프로브: 바코드를 포함하고 특정 mRNA를 결합

• ╶︎프라이머(primer) 프로브: 바코드를 포함하고 이를 통해 자물쇠 프로브와 결합하면 DNA 복제

• ╶︎부목(splint) 프로브: 리보솜 RNA와 결합하여 자물쇠 프로브를 원형화

• ╶︎결론적으로, HeLa cell에서 ACTB mRNA의 리보맵 형광신호를 탐지 (그림 11B, C)

• ○리보맵의 타깃 리보솜-결합 mRNA에 특이적 작동을 검증하기 위한 4가지 실험을 진행

• ╶︎ACTB mRNA에 대한 두 개의 네거티브 비암호화 RNAs(ncRNAs)를 사용한 실험결과 리보맵은 ACTB-특이적인 형광신호를 보임, 하지만 기존의 STAR맵은 네거티브에서도 형광신호를 보임(그림 12A-C)

• ╶︎두 번째는 시작 코돈에서 단백질 개시 리보솜의 트랩을 방해하는 화합물 Harringtonine 처리에 의한 리보맵 형광 시그널 감소 확인(115-405 nt downstream of the start codon) (그림 12D-G)

• ╶︎세 번째는 지질막 주입을 이용한 세포질에서의 단백질 번역 억제 시 리보맵 형광 시그널 감소 (그림 12H-J)

• ╶︎네 번째는 단백질 번역 중인 리보솜을 분리하는 RiboLace 결과와 리보맵의 분석을 비교한 결과 일치함을 확인

• ╶︎결론적으로, 리보맵 기술은 리보솜 결합 mRNA를 검출 특이성이 입증되었음

• ○세포배양을 통한 다중화 리보맵

• ╶︎리보맵의 세포성장 단계 및 주기별 차별화된 특정 번역 정보 제공 실험

• ╶︎HeLa 세포를 이용한 세포소기관 981개 유전자의 단백질번역 리보맵 결과, 세포주기 의존적 패턴과 일치 (그림 13A)

• ╶︎세포 소기관 소포체-특이적 단백질 번역 리보맵 결과 (그림 13B)

• ○마우스 뇌조직을 이용한 리보맵의 공간적 아틀라스

• ╶︎리보맵의 마우스 뇌조직의 세포 유형별, 조직영역별 번역 상태와 조절 상황을 분석 (그림 14A-C)

• ╶︎온전한 뇌조직을 이용하여 리보맵의 공간적 아틀라스를 증명

2.5. 담배 식물의 멀티오믹스 정보구축

□ 논문 개요

• ○본 논문 (Ranawaka et al., 2023)은 2023년 10월 Nature Plants지에 발표되었음

• ╶︎총 26명의 저자로, 호주 Queensland 대학에서 발표

• ╶︎2023년 Nature Plants지의 IF=18.0, JCR < 2%

□ 연구 배경

• ○식물은 현재의 광범위한 분자농업 플랫폼으로 사용하기에 적합한 기본 재료로 여겨지며, 이를 활용하여 다양한 바이오의약품, 기능성식품, 바이오소재, 바이오연료 등의 생산이 가능함

• ○다양한 식물 중 형질전환이 수월하고 높은 대사 다양성과 고수율의 재배 능력을 가진 담배(Nicotiana benthamiana)는 현재의 분자농업 플랫폼으로 사용하기에 최적의 ‘Chassis’로 여겨짐

• ╶︎담배는 특히 바이오의약품 단백질 및 백신 생산을 위한 매우 중요한 식물 플랫폼이며, RNA 간섭(RNAi), 식물-병원체 상호작용, 대사경로 공학, 기능 유전체학, 합성생물학 및 유전자 편집의 근본적인 발견에 중요한 역할을 하였음

• ○바이오소재 생산 시스템으로 담배 식물이 갖는 장점에도 불구하고, 연구를 위해 필수적인 요소 중 하나인 기존 표준유전체의 완성도가 낮아 활용이 어려웠음

• ╶︎N. benthamiana는 ~3Gb의 유전체 사이즈를 가지며, 이질사배체(allotetraploid)의 유전체이기 때문에 정확한 유전체를 구축하는 데 어려움이 있음

□ 연구 내용

• ○N. benthamiana는 N. sylvestris와 N. glauca의 교잡으로 유도된 4배체 개체(ancestral Suaveolentes progenitor)가 배수체화 현상(polyploidization) 이후 일어나는 이배체화 현상(diploidization)을 통해 48개의 염색체가 38개로 줄어든 유전체 구조를 가지고 있음 (그림 15A)

• ○N. benthamiana는 다양한 환경에서 분리 동정된 다양한 accession이 존재하며, 본 논문에서는 LAB과 QLD accession을 유전체 분석에 활용하였음 (그림 15B)

• ╶︎LAB accession은 연구에 널리 사용되는 accession이며, QLD는 야생종에 가까운 accession임

• ○N. benthamiana의 유전체 재배열 분석을 위해서, N. sylvestris와 N. tomentosiformis에서 유도된 N. tabacum과 N. benthamiana간의 상동 유전자 블록(syntenic block)을 활용하여 유전체 구조 분석을 수행하였음 (그림 16)

• ╶︎N. tabacum의 경우, N. sylvestris와 N. tomentosiformis의 하위게놈(subgenome)으로 명확하게 분리되는 것을 확인할 수 있으며, subgenome간의 유사성도 확인할 수 있었음 (그림 16A)

• ╶︎N. benthamiana의 경우, 이배체화 현상에 의한 활발한 유전체 재배열(genome rearrangement) 현상으로 인해, N. tabaccum과 달리 하위게놈 간의 분리가 명확히 일어나지 않으며, 상동 유전자 블록도 상동 염색체가 아닌 다른 염색체에서 탐색되어 활발한 유전체 재배열 현상이 일어났음을 보여줌 (그림 16A와 16B)

• ╶︎일반적인 4배체 유전체는 2쌍의 상동 염색체가 존재하지만 N. benthamiana의 경우, 배수체화 현상 이후 일어난 이배체화 현상에 의한 염색체 손실로 인해 상동 염색체가 소실된 염색체 쌍을 확인할 수 있었음 (그림 16C)

• ╶︎LAB과 QLD에서의 상동 유전자 쌍(homeologous gene pair)의 분포를 비교한 결과, 50% 이상의 상동 유전자 쌍에서 대응되는 유전자의 소실이 확인되었으며, 이는 활발한 이배체화 현상에 따른 유전체 재배열 현상을 뒷받침해 줌 (그림 16D) 

• ○N. benthamina의 LAB 및 QLD 유전체와 같은 가지과 근연종과의 유전체 구조를 비교한 결과 가지과에서의 유전체 상동성을 확인할 수 있었음 (그림 17)

• ╶︎가지과 전반적인 유전체 구조 분석 결과, N. benthamiana 유전체 기준으로 1, 2, 3, 4 염색체에서는 높은 유전체 구조의 상동성을 확인할 수 있었음 (그림 17A)

• ╶︎이종상동성 유전자(orthologous gene)의 분포 탐색 결과에서도 1~4번 염색체에서 높은 비율의 이종상동성 유전자의 보존을 보이는 반면, 나머지 염색체에서는 이종상동성 유전자의 보존 비율이 낮아진 것을 확인할 수 있었음. 하위게놈 간의 유전자 비교에서도 A 유전체와 B 유전체에서의 상동성이 상실된 유전자의 비율이 비슷한 것을 확인할 수 있었음 (그림 17B와 17C)

• ╶︎N. benthamiana 유전체의 경우, 4번 염색체에서 활발한 유전체 재배열 현상으로 인한 빠른 유전적 상동성이 소실된 것을 확인할 수 있었음 (그림 17B와 17D)

• ╶︎토마토 유전체와의 비교에서도 1~4번 염색체에서 높은 보존율을 보여, 이와 같은 현상을 확인할 수 있었음 (그림 17E)

• ○LAB과 QLD accession 간에 형질전환, 유전자 편집, RNA 간섭을 비교해 본 결과 대부분 유사한 효율을 보이나, 일시적 발현 시스템을 통한 단백질 발현에서는 LAB accession이 상대적으로 매우 높은 발현율을 보임 (그림 18)

• ○LAB과 QLD accession은 형태학적으로나 대사 다양성에 차이를 보이지만 특히 생장과 발달 속도에서 큰 차이를 보임

• ╶︎QLD accession은 LAB에 비교하여 종자 형성까지 2배 가까운 시간이 소요됨

• ○LAB accession은 QLD에 비교하여 빠른 생장과 고수율의 단백질 발현을 통해 현재 분자농업의 최적 플랫폼으로 선택되었음

3. 결론 및 시사점

□ RNA 바이러스를 이용한 유전자교정

• ○TSWV 바이러스는 매우 다양한 식물 종을 감염시킬 수 있으므로 본 시스템을 이용하여 더 많은 식물 종에 적용시킨다면 외래 유전자가 남아있지 않은 유전자교정 식물체를 효율적으로 만들어 낼 가능성이 있음

• ○또한 TSWV 바이러스를 재조합하는 방식을 활용한다면 Cas나 gRNA 대신 다른 유용한 유전자를 식물 내 발현시킬 수 있고, 이는 유전자의 종류에 따라 다양한 시도가 가능함

• ╶︎예를 들어 식물체 재분화를 유도할 수 있는 유전자를 도입한다면, 유전자 삽입 없이 바이러스 감염된 식물 잎을 조직배양하여 재분화가 어려운 식물 종의 재분화를 유도할 수 있을 것으로 예상됨

• ○다만 TSWV 바이러스의 특허가 향후 기술개발에 문제가 될 수 있으므로, 국내 자생식물 조사를 통해 새로운 형태의 TSWV를 찾고 재조합하는 형식의 추가 연구가 필요해 보임

□ 해충의 부화 유도물질 발견

• ○PCN은 전세계적으로 가지과 작물의 생산량 및 수익에 큰 악영향을 미치는 해충으로, PCN을 방제하기 위해 PCN 알의 부화에 대한 연구가 필요함

• ○해충의 부화 유도물질을 발견함으로써, PCN이 식물이 분비하는 물질 중 SEB와 SEA를 인식하여 부화하여 식물의 존재를 파악한다는 것을 확인함

• ○또한 SEB를 합성하는 유전자를 동정하여, PCN에 대해 저항성이 생긴 작물을 제작할 수 있는 유전자를 제시하였음

• ○이를 통해 PCN의 피해가 심한 작물 종을 대상으로 저항성을 높인 작물을 개발할 수 있으며, 추가로 본 논문의 연구 방법을 도입하여 뿌리 분비물을 인식하여 부화하는 다양한 nematode에 대한 방제 기술을 개발할 수 있음

• ○이는 유전자교정을 통해 해충을 방제하는 것이기 때문에 농업에서 살충제의 양을 줄여 환경오염을 방지하는 효과도 함께 기대할 수 있음

□ Cut-dip-budding 작물 형질전환

• ○CDB를 통한 유전자 형질전환 및 유전자교정

• ╶︎고효율 유전자 전달방법의 개발은 육종에 있어 가장 큰 장애물임

• ╶︎현재 대부분 작물에서의 유전자 전달 방법은 지루하고 비용이 많이 드는 조직 배양 과정에 의존하고 있으며 매우 소수의 식물에만 적용될 수 있음

• ╶︎본 연구에서 확립된 CDB 전달 방법은 조직 배양이 필요하지 않으며 매우 간단하며 잠재적으로 많은 작물에 적용 가능함

• ╶︎식물체 재분화를 촉진할 수 있는 유전자를 도입하게 되면 재분화가 어려운 식물 종의 재분화를 유도할 수 있을 것으로 예상됨

• ○본 연구는 유전자교정작물 개발의 가장 큰 병목요인 중 하나인 조직배양 과정에서 분화조절을 극복할 수 있는 대안을 제시함

• ○CDB 전달 시스템을 사용하여 뿌리를 통한 영양번식이 가능한 모든 식물 종의 유전자 편집이 가능할 것으로 기대되며 특히 사과, 포도, 배, 복숭아 등 유실수와 딸기, 블루베리, 블랙베리, 레드 라즈베리 등 경제적으로 중요한 열매 식물의 유전적 개선을 촉진할 수 있을 것으로 예상됨

□ 공간적 단일세포 단백체학

• ○리보맵의 염기서열-특이성에 의한 한계점

• ╶︎알려지지 않은 mRNA에 대한 프로브 제작이 불가능하므로 현재까지 염기서열이 알려진 mRNA의 번역 상황을 분석한다는 한계점이 존재

• ╶︎하지만 복잡한 조직, 세포 수준에서의 mRNA를 공간적으로 프로파일링하게 되면 서열 특이적 RNA-단백질 상호작용과 번역에 대한 모니터링이 가능

• ╶︎RNA의 역동적 단계적 생애주기를 알 수 있고 외부 환경에 의한 변화를 모니터링할 수 있어 관련 기작 연구에 큰 도움이 될 것임

• ○리보맵을 통한 유전자발현 조절 이해 가속화

• ╶︎3가지 프로브를 이용한 리보맵은 단백질번역 뿐 아니라 mRNA 분해 속도를 연구할 수 있으며 RNA 생애 주기별 분석이 가능함

• ╶︎환경변화에 의한 RNA 변형 등으로 RNA 안정성과 단백질 번역으로의 영향 등은 게놈 수준의 공간적 아틀라스 형성에 중요한 메커니즘을 제시할 수 있음

• ╶︎손상되지 않은 intact 세포 및 조직에서 mRNA 조절과 단백질 합성 연구가 가능함

• ╶︎리보맵은 복잡한 폴리솜 분리 및 유전자조작을 우회하여 단일세포 수준에서 연구가 가능함

• ○리보맵의 활용 가능성

• ╶︎다른 이미징 기반 기술과 융합하여 후성유전체, 전사체, 단백제와의 공간적 다중 맵핑이 가능, 이를 통해 생물학적 시스템의 통합적 이해를 증진시킬 수 있음

• ╶︎RNA 번역을 후성학적 제어, 단백질 발현 및 대사기능과 연결할 수 있음

• ╶︎생명현상의 원리를 세포수준, 조직학적 수준에서 이해하는 데 기여할 수 있음

□ 담배 식물의 멀티 오믹스 정보 구축

• ○담배(Nicotiana benthamiana)는 높은 형질전환 효율, 높은 대사 다양성 및 고수율의 재배 능력을 가지며, 다양한 바이오의약품, 기능성식품, 바이오소재, 바이오연료 등의 생산을 위한 플랫폼으로 사용하기에 최적의 식물임

• ○상대적으로 큰 유전체 사이즈(~3Gb) 및 유전체의 복잡성(allotetraploid) 때문에 완성도가 낮아 활용이 어려웠던 기존의 표준유전체 정보를 향상시켜 다른 가지과 작물인 토마토, 고추, 가지, 감자 등과 유사한 품질의 완성도를 갖도록 하였음

• ○연구에 널리 사용되는 LAB accession은 야생종에 가까운 QLD에 비교하여 빠른 생장과 고수율의 단백질 발현을 통해 현재 분자농업의 최적 플랫폼으로 선택되었음을 확인함

• ○새로 구축된 담배(N. benthamiana)의 다양한 오믹스 정보는 향후 담배 식물을 이용한 대사, 발달 및 진화 연구를 크게 향상시키는 리소스를 제공할 것으로 기대됨