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2024 바이오 미래유망기술(하)

DNA 바코드와 바코드 미생물

성봉현 / 한국생명공학연구원 책임연구원

◈ 목차

• 1.DNA 기반 생명체 분석

• 2.DNA 바코딩

• 3.바코드 미생물(barcoded microorganisms)

• 4.기대효과

• 5.참고문헌

◈본문

1. DNA 기반 생명체 분석

최근 방영되는 범죄스릴러 영화나 드라마에서는 과학수사라고 적힌 옷을 입은 검시관들이 사건현장을 수사하는 모습이 당연시 되고 있다.

과학수사는 범죄 현장에 남겨진 증거물과 단서를 과학적 지식, 장비 및 시설을 이용해 분석하여 사건을 해결하는 수사방법을 말한다. 과학수사에는 지문감정, 혈흔형태 분석, 화재감식, 영상분석, 문서감정, 프로파일링, DNA 분석 등이 포함된다.

[그림 1] 사건현장 과학수사 모습

DNA 분석과 관련하여, 국내에서는 2010년 DNA신원확인정보의 이용 및 보호에 관한 법률(이하 DNA법)이 시행되었다. 이를 통하여 범죄를 저지른 자의 DNA 정보와 범죄 현장 증거물에서 분석된 DNA 신원확인 정보 DB 제도를 운영하여, 신속하게 범인을 특정하여 검거하거나 다양한 장기 미제사건(연쇄살인사건 진범 규명)을 해결할 수 있었다. 현재 과학수사에서 DNA 감식 기술은 개인식별, 동일 부계 및 모계 분석, 연령 추정, 외모 추정, 체액 추정 뿐 아니라, 다양한 생물의 분류 및 특성파악을 통하여 형사사건의 증거를 제공하는 법생물감식(forensic biology) 분야에도 적용되고 있다. 이 경우 DNA 바코드 분석 기술은 동물, 식물, 미생물의 계통 분류 시 외형적 분류 기준이 모호할 때 사용할 수 있어 적용 대상 분야가 확장되고 있다.

2. DNA 바코딩(barcoding)

여러 생명체를 구분하기 위하여 형태를 관찰하고 도감과 대조해 가며 동정을 할 수도 있지만, 형태적 차이가 미미하거나 분석대상이 손상된 경우, 분석이 어려울 수도 있고, 감별사에 따라 평가가 다를 수도 있다.

이럴 경우에는 보다 명확한 구분 근거가 존재해야 한다3). 이런 난관을 극복하기 위한 대안으로서 2003년 캐나다의 진화생물학자인 폴 허버트(Paul Hebert)는 생물을 모양과 특성이 아닌 DNA 바코드로 구별하자고 제안하였다4). DNA 바코드는 생물이 가지는 유전자 중 다른 종과 차이가 있는 고유의 DNA 정보를 이용해 생물종을 빠르고 정확하게 식별할 수 있는 기술로 물건을 식별하는 바코드 개념과 연관시킨 것이라고 할 수 있다(그림2).

다양한 생명체를 구분할 수 있는 바코드 부분은 특성 정보가 있는 DNA 영역을 선택하여야 한다. 좋은 DNA 바코드는 종내(intra-species) 차이점은 낮지만 종간(inter-species) 차이점은 높아야 하며, 효율적인 DNA 증폭(PCR)을 위하여 일정한 서열구간을 가지고 있어야 한다. 그리고 바코드 서열의 길이는 샘플링, DNA 추출, 증폭, 서열 분석이 가능한 길이가 좋다. 하나의 서열이 모든 생명체에 다 적용되면 제일 이상적이겠지만, 그런 DNA 부분이 존재하지 않기에 생명체 및 실험에 따라서 여러 바코드가 사용된다.

동물의 경우 가장 널리 사용되는 바코드 마커는 미토콘드리아 사이토크롬 C 산화효소 (COI) 유전자이며, Cytb, 12S 또는 16S와 같은 미토콘드리아 유전자도 사용된다. 핵(nuclear) DNA보다 미토콘드리아 DNA가 선호되는 이유는 수가 많고, 인트론 수가 적으며 재조합이 잘 일어나지 않기 때문이다. 그러나 식물에서는 서열 차이가 크지 않아 미토콘드리아 유전자가 DNA 바코드에는 적합하지 않다. 대신 엽록체의 maturase K 유전자(matK)를 비롯하여 리불로스-1,5-비스포스페이트 카르복실라제-옥시게나 제 유전자(rbcL), trnH 또는 리보솜 내부 전사 스페이서(ITS DNA) 와 같은 다중 위치 마커가 종 식별에 사용된다(표1).

박테리아의 경우, 16S rRNA 유전자를 활용하거나 COI, II형 샤페로닌(cpn60)  또는 RNA 중합효소 β(rpoB)를 사용한다. 곰팡이의 경우에는 하나로 완전한 구분이 어려워 COI와 더불어 ITS rDNA 등이 동시에 사용된다. 원생 생물에서는 28S rDNA의 D1-D2 또는 D2-D3 영역, 18S rRNA 유전자의 V4 하위 영역, ITS rDNA 및 COI와 같은 다양한 바코드가 사용된다.

[그림 2] DNA 바코딩 방법

DNA 바코드 내에서도 정보가 다양하기 때문에 DNA를 기반으로 종을 특정하기 위해서는 여러 가지 방법을 사용한다. 역치값을 기반으로 서열의 차이가 2~4%를 넘어서면 다른 종으로 분류하는 것이 가장 일반적이며, 특정한 위치의 변이(유전자 내 특정위치 염기서열)에 따라서 종을 동정할 수도 있다. 또한 기존의 라이브러리에 존재하는 종들과 미지의 시료에서 획득된 염기서열을 재료로 계통수를 그려서 기존의 라이브러리에 해당되는 종들과 함께 묶이는 그룹을 같은 종으로 동정할 수도 있다.

[표 1] DNA 바코드 연구에 주로 사용되는 분자 마커들

DNA 바코딩은 미국 Cold Spring Harbor Laboratory에서 제시하는 방법에 따라 실습을 할 수도 있는 만큼 그렇게 어려운 기술은 아니다. 지구상 다양한 생명체의 DNA 라이브러리를 적절히 구축해 두기만 한다면, 이를 미지의 개체에서 추출된 유전자 단편과 대조함으로써 종의 이름을 알아낼 수 있다. 이를 위해서는 믿을 수 있는 바코드 라이브러리의 구축이 중요하다. 분석한 염기서열과 기존에 등록된 염기서열 정보와의 비교를 통해서 대상을 동정하기 때문에 잘못된 결과를 제시하지 않기 위해서는 신뢰도가 높은 바코드 라이브러리가 구축되어야 한다. 이러한 라이브러리 정보에 단순하게 서열정보만 포함할 수도 있지만, 생명체의 표집 위치 뿐 아니라 생태학적 특성을 포함하면 더 많은 정보를 확인할 수 있다. 2004년 지구상의 생명자원에 대한 다양성 확보와 체계적인 관리를 위해 ‘DNA 바코드 컨소시엄(Consortium for the Barcode of Life)’이 출범하였다. 국제연구기관들이 국제바코드컨소시엄(iBOL)을 구성하며 지구상의 모든 생명체를 대상으로한 바코드 연구를 진행하고 있다. 이외에도 각국에서는 다양한 바코드 라이브러리를 구축하고 있다. 우리나라에서도 농촌진흥청에서 곤충 DNA 바코드를 구축하고 있고 검찰청에서도 법의학을 위하여 여러 DNA 바코드 데이터베이스를 구축하고 있다.

DNA 바코딩은 생명체의 동정 기술을 근간으로 다양한 분야에 응용되어 왔다. 밀렵과 거래 추적을 통한 멸종위기 생물종 보전, 생물 유래 가공품의 원산지 추적, 생물자원이동 관련 국가 검역(바이오안보), 생명체 간의 계통수(phylogenetic tree) 작성의 기본 정보, eDNA(environmental DNA) 분석 등에 활용되고 있다.

법의학적 측면에서 이러한 DNA 바코드는 야생생물의 불법 포획이나 거래 사건에 대하여 적용하는 Wildlife Forensic, 음식물의 원료로 사용되는 생물의 진위 여부를 판단하는 Food Forensic, 식물의 화분, 씨앗, 열매, 잎 등을 이용하여 사건의 단서를 찾아가는 Forensic Botany, 사체 주변에 생성되는 다양한 곤충의 종류와 성장 단계를 확인하여 사망시기 추정 등 죽음에 관하여 분석하는 법곤충학, 미생물에 의한 바이오테러를 대비하는 Forensic Microbiology 등 다양한 분야에서 연구되고 있다.

3. 바코드 미생물(barcoded microorganisms)

앞서 언급한 DNA 바코드 기술이 생명체의 염기서열을 바탕으로 종 분석 및 활용 중심이라면, 최근에는 좀 더 적극적으로 이들을 활용하는 방법이 제시되고 있다. 인위적인 DNA 바코드를 제작하고 이를 도입한 미생물 혹은 미생물의 포자를 하나의 바코드로 이용하여 생명체 혹은 사물의 이동을 분석하는 것이다. 즉 합성생물학을 응용해 무해한 미생물에 특정 DNA 서열(DNA 바코드)을 삽입하여 출처 정보 및 이동 경로를 추적하는 기술이다.

다양한 농산물과 공산품의 글로벌 공급망 구축으로 이들의 원산지를 확인하는 것이 상당히 복잡해졌다. 단순하게 표시를 하거나 상표를 붙이는 것만으로는 이러한 추적이 어렵기 때문에, 자연계에 존재하는 미생물 및 그 커뮤니티를 활용하는 것이 하나의 대안으로 제시되었다. 2020년 하버드대에서는 식량이나 식품 안전에 해를 끼치지 않는 세균 DNA를 바코드화한 뒤, 이동 상황을 정밀 추적하는데 성공했다(그림3).

[그림 3] 민감하면서도(sensitive) 특이적으로(specific) 검출이 가능한 바코드 미생물 포자(barcoded microbial spores) system

연구진은 식품발효에 널리 사용되는 효모(Saccharomyces cerevisiae)와 고초균(Bacillus subtilis) 같은 GRAS(Generally Recognized As Safe) 미생물 유전체에 특정서열의 DNA 바코드를 도입한 안전한 미생물 제작하였다. 그리고, 다양한 조건에서 미생물이 안전하게 식품 및 제품에 머물도록 하기 위하여, 바코드 미생물 포자(spore)를 식물/식품 혹은 제품 표면에 분무하였다. 포자는 비활성 세포 상태로 가혹한 환경조건(세척, 가열, 전자파)에서도 생존가능하여 안정성 부여, 태그로 활용이 용이하다. 그리고 농장이나 식품공장에서 산출한 식량‧식품의 이동 경로를 추적했다. 그리고 수개월이 지난 다음 인공적으로 주입한 세균 포자가 어느 곳에 위치하고 있는지 파악한 결과 그 소재지를 정확히 찾아낼 수 있었다.

이러한 기술은 최근에 개발된 여러 기술들과 연계하여 보다 효율적으로 활용될 수 있다. 여러 식물의 잎에 개별 바코드 미생물 포자(BMS)를 여러 번 도포한 뒤, 수확한 후 잎을 혼합한 경우에도 최근 개발된 분자진단 기술 SHERLOCK 및 염기서열 분석 방법을 활용하여 존재 여부를 확인할 수 있었다(그림4). 또한 본 바코드 미생물은 식품 및 생명체에 직접 도포되기 때문에 안전성이 무엇보다 중요하다. 안전한 균주의 포자를 사용하였지만, 그래도 사람이 섭취할 경우 발생할지 모르는 위험성을 막기 위해 포자들이 외부에 노출되었을 경우 사멸되는 생물봉쇄(biocontainment) 기술이 적용되었다. 최근 급속하게 발전하고 있는 다양한 합성생물학 기술과 연계하여 적용점은 더욱 확대되고 안전성은 더욱 높아질 것이다.

[그림 4] 최근 분자진단과 바코드 미생물 포자(BMS)의 결합을 통한 농산물 출처의 분석

이 시스템(DNA-barcoded microbial system)은 포자 뿐 아니라 각종 세균 DNA를 데이터화해 향후 저렴한 비용으로 세균의 존재를 정밀 추적할 수 있다. 미 육군 전투능력개발사령부 연구진은 28bp의 바코드를 삽입한 유전체를 제작하고, 포자를 방출한 다음, 플라스틱, 판지 등에 도포하고 물건을 이동하고 시간이 지난 뒤 샘플링하였다. 확보된 포자를 용해하고, PCR, SHERLOCK 검출 분석을 통하여 DNA 바코드 미생물 시스템의 지속성 및 안정성을 평가하였다. 중국 시안의 북서폴리텍대학교에서는 한약재 원산지 추적 시스템을 개선하기 위한 바코드 미생물 포자의 잠재적 적용 가능성을 분석하였고, BMS를 활용한 전통의학 수준 향상을 검토하였다. 그리고 관련 여러 기술의 장·단점을 비교하였다(표2).

국내에서는 바코드 미생물을 위한 개별 요소기술에 대해서는 높은 기술 수준을 보유하고 있지만, 아직까지 바코드 미생물에 대한 연구 발표 사례는 없는 상황이다. 하지만, 여러 합성생물학 기술을 개발하고, 어느 나라보다 강력한 유전자변이생명체(LMO) 규제 이슈를 해결할 수 있는 안전한 기술이 개발되면 바코드 미생물 기술의 선도 국가가 되는 것은 어렵지 않을 것이다. 자연계에 존재하지 않는 특정 서열의 DNA 바코드 선정하고 유전자를 합성하는 기술, 특정 미생물 유전체 내로 바코드 DNA를 효율적으로 도입하는 기술, 특정 조건이 아닌 상황에서는 생존이 불가능한 미생물을 개발하는 생물봉쇄(biocontainment)기술, 생명체 영구비활성화 기술, DNA 이외 소재에 안전하게 태깅하는 기술, 미생물의 존재 여부를 확인하기 위한 소량의 DNA 증폭, 염기서열 분석하는 기술, 극소량의 DNA를 검출하는 차세대 분자진단 기술들이 지속적으로 개발 되어야 한다.

바코드 미생물 기술은 미생물 기반의 태깅 및 라벨링 기술로 경제적이면서도 신속하게 추적 가능하며, 제품 유통, 감염병 추적, 법의학 등에 활용 가능하다. 앞서 언급한 바와 같이, 보다 정밀한 유전자 바코딩, 극소량 DNA 서열 존재 확인 기술과 연계하여 생명체 및 비생명체의 이동 추적에 적용될 수 있다. 생물봉쇄 기술 등이 적용되어 바코드 미생물의 LMO 이슈 해결할 수 있을 것이고, 보다 장기적으로는 합성생물학 기술과 접목하여 다양한 바코드 제작, 견고한 부착, 안전성 및 안정성, 정확성 확보를 통하여 사용 범위 확대가 가능하다. 또한 DNA, 미생물을 넘어선 신규 바코드 기술이 개발·적용될 것이다.

[표 2] 생명체 추적 기술의 여러 특징

4. 기대효과

이러한 바코드 미생물을 활용하면, 글로벌화에 따른 다양해지고 활발해진 국가 간 물류의 흐름 파악 및 제품의 추적이 가능하며, 식품의 이동 이력 추적에 따른 제품 안전성신뢰 향상이 가능하고, 관련 시장 수준을 높일 수 있다. 또한 연평균 성장률 14%인 무선 센서 태그 시장을 비롯하여, 2022년 53억 달러 규모로 연평균 4.6% 성장이 전망되는 글로벌 재고 태그 시장에도 활용가능하다. 또한 다양한 분자 진단 기술에 적용하여 새로운 기술의 발전을 가져올 수 있다. 사회적 측면에서는 특정 지역 방문 인사의 확인이 가능해 사회적 안전성을 강화할 수 있고, 발생 가능성에 대한 우려가 높은 글로벌 팬데믹 위험 방지를 위한 특정 지역 제품의 판별 및 제한이 가능해 질환 확산 방지에 적용될 수 있다.

앞서 바코드 미생물의 좋은점을 많이 강조했지만, 아직 넘어서야 할 많은 부분이 존재한다. 분명 여기서 이야기하는 바코드 미생물이 사회로 노출되면 어떤 위험성이 발생할지 몰라 안전성을 강조하고 안전한 미생물을 활용한다고는 하나, LMO 활용에 따른 위험성 및 거부감을 극복할 필요가 있다. 그리고, 개념 제시 수준에서 벗어나 실제 생활 및 산업에 적용하기 위해서는 세부적인 여러 문제를 극복해야 한다. 기술적인 측면에서 특정 서열의 DNA 바코드를 신속하게 제작하고, 극소량의 DNA를 검출하고, 생물봉쇄와 같은 다양한 기술을 추가 개발하고 개선할 필요가 있다.

...................(계속)

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