바이오인

핵심내용

배양액 교체만으로 손상 없이 세포시트 수확

온도·산성도 변화 없이 생리학적 조건(37oC, pH7.4)에서 단시간내 시트형상으로 회수

□ 건강한 세포를 분리하여 손상조직에 이식할 충분한 양으로 증폭시킨 후, 시트(sheet) 형상으로 회수할 수 있는 세포배양 플랫폼이 소개됐다.

○ 배양조건 그대로 배양액(buffer)만 교체, 세포수확 과정에서의 손상을 줄여 이식 후 손상조직의 재생효율을 높일 단초가 될 것으로 기대된다.

□ 한국연구재단(이사장 노정혜)은 KAIST 임성갑 교수(생명화학공학과) 및 연세대학교 조승우 교수(생명공학과) 연구팀이 온도변화 없이 단시간 내 세포 시트를 배양기판으로부터 손상없이 분리하는 방법을 개발했다고 밝혔다.

○ 백지응 박사, 박현지 박사, 조영학 박사과정 학생이 제1저자로 참여한 이번 연구의 성과는 국제학술지‘어드밴스드 머티리얼스’지에 3월 11일 게재 되었다.

□ 피부나 연골 등 조직손상이 심한 부위에 생체이식을 하려면 체외에서 해당 세포를 배양하여 증식시키는 과정이 필요하다. 이 때 평면형태의 기판 위에 시트 형태로 단단히 접착되어 자라는 세포시트를 손상 없이 떼어내는 것이 중요하다.

□ 기존에는 배양온도를 세포에 적합한 37oC에서 20oC 이하로 낮춰 20분 이상 노출, 기판을 친수성으로 바꿔 세포시트를 분리하는 방식 등이 시도되었다.

○ 하지만 세포에 스트레스가 되는 급격한 온도저하와 소요시간으로 인해 세포시트의 손상이 우려되었다.

□ 이에 연구팀은 배양기판 표면을 생체적합성 고분자로 코팅, 세포와 배양기판 간의 접착력을 정밀히 조절할 수 있도록 표면을 개질하였다.

○ 이를 통해 세포가 자라는 데 필요한 영양분이 든 배양액을 교체하는 간단한 방법으로 온도나 산성도 변화 없이 100초 내에 배양하던 세포를 시트형상으로 회수하는 데 성공했다.

○ 세포와 세포, 그리고 세포와 세포외기질 간의 부착에 중요한 역할을 하는 세포막 단백질인 인테그린과 배양기판 표면 사이의 접착이 양이온에 의존한다는 점에 착안하여 양이온이 없는 배양액을 처리, 세포시트를 신속하게 분리할 수 있었다.

□ 실제 인간성체줄기세포, 쥐근아세포, 인간피부섬유모세포 등 여러 세포를 파종(seeding)하여 배양한 후, 배양환경 그대로 시트형태로 수확해 냈다.

○ 이렇게 얻은 세포의 세포주기와 DNA 함량은 정상 범위였으며, 특히 줄기세포시트의 경우 재생효과물질의 분비가 2배 이상 증가했다.

□ 나아가 수확한 세포시트를 적층, 당뇨병성 궤양 생쥐모델에 이식하자 상처부위 면적이 급격히 감소하고 표피의 두께가 증가하는 등 상처가 빠르게 치유되었다.

○ 허혈성 생쥐모델에 이중층 세포시트를 이식하자 혈관형성 촉진과 혈류 흐름 증가가 나타났으며 피부궤사와 허혈성 사지 손실이 완화되었다.

□ 교신저자인 KAIST 이은정 연구교수는“개발한 세포시트 수확방법을 토대로 향후 심근세포, 위장세포, 각막세포 등 여러 조직의 세포시트를 활용한 조직재생 연구를 수행할 계획”이라고 밝혔다.

○ 이번 연구는 과학기술정보통신부와 한국연구재단이 추진하는 기초연구 사업 (중견연구) 및 선도연구센터지원사업 등의 지원으로 수행되었다.

상세내용

< 논문명, 저자정보 >

논문명
A Surface-Tailoring Method for Rapid Non-thermosensitive Cell Sheet Engineering via Functional Polymer Coatings

저  자
백지응(제1저자/한국과학기술원), 조영학(제1저자/한국과학기술원), 박현지 박사(제1저자/연세대학교), 최고로(한국과학기술원), 이종승(연세대학교), 이민석 (한국과학기술원), 유승정(한국과학기술원), 조승우 교수(교신저자/연세대학교), 이은정 교수(교신저자/한국과학기술원), 임성갑 교수(교신저자/한국과학기술원)

< 연구의 주요내용 >

1. 연구의 필요성
 ○ 피부나 연골, 신경, 심근 등의 생체조직이 크게 손상되면 해당 조직의 이식을 통해 치료할 수 있다. 하지만 이식 가능한 조직은 지극히 한정적이어서 조직의 복원, 재생을 위해서는 환자의 세포로부터 생체 이식이 가능한 조직으로 재생시키는 기술이 필요하다.
 ○ 통상 2차원적으로 배양된 세포를 트립신과 같은 단백질 분해효소를 사용 하여 단일세포 형태로 얻는데 이 과정에서 세포외기질을 비롯해 세포 표면의 수용체(receptor)가 손상될 수 있어 세포기능 저하로 이어질 수 있다. 세포를 이식한 후 재생효율이 낮아지는 원인 가운데 하나이다.
   ※ 세포외기질(extracellular matrix; ECM) : 동물의 구조적 지지 등을 담당하는 조직으로, 세포형태를 유지할 수 있게 구조적인 기반이 되어주고, 조직 구성의 틀이 되며, 마지막으로 세포 사이 신호를 주고 받는데 도움을 준다.
 ○ 때문에 분해효소를 이용하는 대신 단일세포가 아닌 시트(sheet) 형상 으로 세포를 회수하여 이식하면 세포와 세포외기질 등이 온전한 채로 이식할 수 있다. 
 ○ 이를 위해 기존에는 온도 감응형 고분자 박막 위에 세포를 배양한 후, 온도를 20도씨 이하로 낮춰 배양 기판을 소수성에서 친수성으로 전환, 세포를 기판으로부터 분리해 냈다.
 ○ 하지만 이 방식은 저온과정에서 세포 손상이 유발되며, 수용성 고분자 박막이 활용되어 배양용기의 제작이 대단히 까다로웠다.

2. 연구내용
 ○ 고분자를 배양기판에 코팅하여 표면자유에너지를 조절, 세포와 배양 기판 사이의 부착력을 제어할 수 있는 플랫폼 기술을 개발하였다.
 ○ 세포 부착력에 중요한 인테그린(integrin)과 배양 표면 사이의 접착은 양이온성 물질에 농도에 의존하기 때문에 양이온이 없는 버퍼로 처리하는 방식으로 기존의 방식에 비해 십분의 일 수준의 매우 빠른 시간 (100초 이내)에 온도변화 없이 세포시트를 회수할 수 있었다.
   ※ 인테그린(Integrin) : 세포-세포 외 매트릭스 접착을 돕는 막 관통 수용체. 리간드 결합시, 세포주기 조절, 세포 골격 구성, 및 세포막에 대한 새로운 수용체의 이동과 같은 세포 신호를 매개하는 신호 전달 경로를 활성화시킨다.
   ※ 버퍼(buffer) : 모든 세포 배양 배지에는 이러한 대사산물로 인해 발생되는 pH의 변화를 줄이기 위해서 완충 작용을 하는 물질
 ○ 기존 방식에 비해 세포회수 시간이 상당히 단축되고, 온도 및 pH가 생체 내 조건과 동일하여 세포의 손상을 최소화 할 수 있다.
 ○ 실제 당뇨성 궤양 쥐모델에 이렇게 회수된 이중층 세포시트, NHDF (normal human dermal fibroblasts)-hMSC(human mesenchymal stem cells)를 이식하자 표피세포 성장 및 콜라겐 분비가 증가, 상처가 빠르게 치유됨을 확인하였다.
 ○ 또한 허혈성 쥐모델에 이중층 세포시트, C2C12(mouse myoblasts)-hMSC (human mesenchymal stem cells)를 이식, 혈관형성 촉진과 혈류흐름 증가를 통해 피부궤사와 허혈성 사지 손실을 효과적으로 막는 것을 확인하였다.

3. 연구성과/기대효과
 ○ 세포에 무리가 될 수 있는 온도변화 과정을 생략하고 트립신 효소 또는 EDTA와 같은 세포에 독성이 있는 물질들을 사용하지 않아 세포주기와 DNA 손실 없이 높은 효율로 세포시트를 회수할 수 있는 실마리를 제공하였다.
 ○ 손상조직의 재생을 유도할 정도의 충분한 양으로 세포를 배양하여 시트 형태로 손상 없이 회수, 3차원으로 적층할 수 있는 플랫폼을 제시함으로 써 향후 세포 이식 후 손상된 조직의 재생효율을 높이는 데 기여할 수 있을 것으로 기대된다.
 ○ 특히 세포치료제 측면에서 범용성 및 확장성이 있어 환자의 자가세포를 활용 한다면 자가이식 효과를 높이는 실마리가 될 것으로 기대된다.

■ 연구 이야기

□ 연구를 시작한 계기나 배경은?

본 연구실이 고분자 박막을 활용하여 바이오재료 연구를 진행하고 있기 때문에, 자연스럽게 세포가 표면의 물리화학적 성질에 따라 변화하는 모습에 집중하게 되었습니다. 이러한 기본연구를 조직 공학적인 부분과 연계해서 좀 더 질환치료 등의 실제적인 도움을 줄 수 있는 방법을 개발하려고 했습니다. 세포를 이용한 조직재생 치료는 외부 지지체를 활용하여 세포를 이식하는데, 이러한 방법은 지지체 물질의 안정성 및 면역 부분에서 문제가 될 수 있습니다. 이러한 문제를 해결하기 위해서 세포이식만으로 조직을 재생할 수 있는 방법을 찾으려했고, 고분자 소재 기반으로 충분히 해결할 수 있을 것이라는 목표가 세워져, 세포시트공학이라는 매력적인 연구를 시작하게 되었습니다.

□ 이번 성과, 무엇이 다른가?

세포시트공학은 일본이 온도감응형 배양기판을 상용화하여 시장을 독점하고 있기 때문에 진입장벽이 높은 기술입니다. 그동안 이에 상응할 만한 기술 개발이 시도되어왔으나 복잡한 제작과정이나 세포독성을 일으킬 수 있는 요소들이 여전히 있어 기존의 기술을 극복하기 어려웠습니다. 본 연구성과는 온도나 산성도와 같은 세포에 해가 될 수 있는 방법을 배제하고, 단지 배양액 교체만으로 세포시트를 회수할 수 있다는 점에서 혁신적인 방법론적 접근입니다. 또한 기존 방법에 비해서도 세포를 매우 빠르게 세포시트 형태로 회수할 수 있다는 점에서 임상 성공률을 높일 수 있는 큰 요소가 될 것입니다.
세포시트는 떼어내는 방식에 따라 외형적으로는 같아보여도 세포 본연의 기능에는 많은 영향을 받습니다. 이는 이식 후 손실된 조직의 재생률과 직접적으로 연관되는데, 본 연구에서 개발된 방법은 이식 후 성장인자 등 세포재생을 촉진시키는 분비물질의 분비가 기존 방식에 비해 상당히 향상되어, 실제로 동물모델에서 온전히 조직재생이 이루어지는 것을 확인하였습니다. 따라서 기존 방식과는 달리 기능적으로도 향상된 세포시트를 제작할 수 있다는 점에서 활용가치가 매우 높은 기술입니다.

□ 실용화된다면 어떻게 활용될 수 있나? 실용화를 위한 과제는?

세포 치료제는 줄기세포의 발전과 함께 그 시장성이 점점 커지고 있습니다. 세포 치료제 개발에 세포시트를 활용하여 조직 공학적인 부분을 연계한다면 현재 줄기세포 활용에 있어서의 한계점을 극복하고 한 단계 더 진화한 세포 치료제의 개발로 이어질 것이라고 기대합니다. 세포시트를 활용한 조직공학 및 재생의학은 단지 세포를 이용하여 세포 또는 조직을 재생하는 것뿐만 아니라, 약물 스크리닝, 줄기 세포를 유지하는 기전, 분화 기전, 조직 공학을 연계한 조직 또는 장기 개발 등 다양한 학문과 연관되어 있어 임상과 기초 영역에 큰 영향을 미치는 분야이기 때문에 장기적 전망이 밝다고 할 수 있습니다. 특히 실제 환자 세포를 활용하면 자가이식 세포 치료제를 개발하는 할 수 있는 실제적인 접근법이 될 수 있으므로 앞으로 의과학계의 발전은 물론 의약 산업계의 진보에 큰 기여를 할 수 있으리라 기대합니다.

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