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유전자 재조합 동물 유품에서의 단백질 생산과 관련한 규제 문제들

FDA가 유전자 재조합 단백질들에 대한 「고려하여야 할 사항」에 관한 문서를 해제함에 따라 생의약 유 래 단백질들의 잠재적 시장 총계는 40억불에 이른다. 현재 재조합 염소, 양, 돼지, 암소 그리고 쥐의 유즙으로부터 12가지 이상의 단백질들 이 개발중이다(표 1).

적절한 가격의 고순도 치료용 인간 단백질과 세포배양 공정화 할 수 없는 복잡한 인간단백질에의 요구 는 점증하고 있다. 규제시 고려의 대상은 형질전환 계통의 개발부터 단백질 산물의 최종 정제에까지 걸쳐있다.(기술적 적용에 관해서는 GEN'94. Nov. 1, p.8을 볼 것)

형질전환 단백질들

o 형질전환 동물이란, 한 가지 이상의 외부 유전자를 그 동물의 유전자에 안정적으로 삽입함의 결과로 써 다른 종에서 어떤 단백질이나 특성을 발현하는 동물을 말한다. 유즙에서의 외인성 단백질의 분비는 수정란이나 經에, 카세인이나 乳漿의 산성 단백질이나 락토글로불린같은 乳특이성 단백질의 조절부위가 더해진 단백질 코딩서열을 포함한 융합구조를 삽입함으로써 완성된다.

이러한 방식이 가장 흥미를 끄는 이유는 재생이 가능한 자원으로부터 쉽게 얻을 수 있는 정상처리 인간 단백질의 연속적이고도 높은 수준의 생산이다. 형질전환 단백질용의 진핵 및 원핵 세포배양 최고 생산체계가 하루 최대 50-l00mg의 형질전환 단백질을 대량생산해낸다 할 지라도 이 체계들은 단일군항체나 콜라겐이나 막결합 단백질들을 효과적으로 처리할 수는 없다.

반대로 유즙은 1리터당 수십그람의 단백질을 함유하고 있고, 매년 산유 암컷 한마리당 수킬로 상당을 산 출할 수 있다(표 2). 이것은 생산설비로 인한 자본지출의 감소를 포함하여 경제적 誘因이 된다. 세포배양 시설이 약 2,500만불에서 5,000만불인 반면에, 초기 재조합 동물은 종과 크기와 유전자 교체의 방법에 따라 다르지만 50만불에서 150만불에 발생시킬 수 있고 보통 크기의 낙농설비는 백만불 이하로 건설할 수 있다.

규제에 고려해야 할 사항

생의약의 진보를 기대하여 미국의 FDA는 재조합 단백질에 해당하는 「고려해야 할 사항」에 관한 문서 의 결말을 지었다. European Conmission for Industrial Affairs도 그 「고려해야 할 사항」을 지난 12월, 1995년 7월 1일까지만 유효 하게 했다.

「고려해야 할 사항」은 법은 아니나 요청내지 공식적 지침인데 FDA의 생물평가 및 연구센터(CBER)의 Steven Bauer 박사가 지적하였었다. 그들은 잠재적인 생산자들에게 제품개발공정에 있어 FDA와 협의하는 것이 좋을 문제에 대 해 주의를 환기시키었다. 사실, 재조합 치료단백질들은 미국과 유럽 모두에서 케이스 바이 케이스로 검토되었고 재조합 우유로부터의 치료제도 같은 식으로 조정될 것 같다. 재조합에 관한 미스터리는 없다고 Genzyme Corporation사(메사츄세츠주 캠브리지시 소재)의 규제문제 담당자인 Russel Herndon씨는 말한다. 즉 유일한 특징은 대부분 발생과 유지 그리고 재조합 동물의 젖짜기에 있다. 여러 가지 생산원천 에서의 재조합 단백질의 비교가 있었고 주요 규제문제들은 이미 현존의 「고려해야 할 사항」(표 3)에 언급되었다. 재조합에 관련된 문제들은 4 가지 범위로 구분된다. 즉 1) 재조합 동물의 발생 2) 생산계통의 개발 3) 원료 물질의 생산 4) 단백질 가공과 정제이다.

형질전환동물의 발생

융합 유전자 구조의 생산이, 형질전환 생산동물과 반응기 세포계 모두의 개발에 있어 첫 단계이다. 유전 자 구조의 완전한 서술이 필요하고 원천과 생활성도, 제한지도 그리고 매 중요 요소의 뉴클레오티드 서열이 필요하다. 즉, 프로모터와 결손 부분, 조절요소, 인트론이 표시된 코딩서열, 그리고 construct를 만들기 위해 사용된 약이나 항생제 표지를 말한다. 미세주입제재 최종정제물의 바이 러스 벡터 자투리, 특히 레트로바이러스는 완전히 규명되어야 한다.

형질전환 유전자의 숙주 동물에의 삽입은 형질전환 유전자를 자식에게 유전시키는 소수의 제1세대 확립 種(Fo) 동물을 생산한다. 확립종은 숫컷이면서 형질전환 유전자를 갖고 있거나, 안 갖고 있는 숫컷이거나 할것이므로 단백질 발현과 규명은 제2세대나 그후 세대의 성적으로 성숙한 암컷에서의 유즙분비 개시를 기다려야 한다.

확립종의 동정과정은 확인되어야 하고 동물 등은 형질전환 유전자의 발현, 조절, 염기서열, 접합부위 및 접합도 등의 관점에서 완전히 규명되어야 한다. 형질전환 단백질 자체도 발현조절, 수율 그리고 기능적 활성이 완전히 규명되어야 하고, 이 특성들 은 동물들의 연속된 세대에서 유지되어야 한다. 받아들일 수 있는 기준은 장기적 형질전환 발현과 단백질 수율에서 확립되어야 한다.

乳線은 효과적으로, 어떤 생물학적 영향을 발휘할것 같지 않는 외인성 형질전환 단백질을 추방함으로써 숙주동물에게 나쁜 건강효과 가능성을 최소화하려 한다. 그러나 동물들은 Proto-oncogene의 삽입활성화나 잔존 바이러스 벡터 서열에 의해 발생 할 수 있는 종양에 관해 모니터링 되어야 한다. 확대 번식될 하나 이상의 특정한 형질전환계통의 최종 선택이 이 모든 특성들에 더해 수정과 다산의 기초자료와 일반적 동물건강과 복지에 의해 결정될 것이다.

생산계통 개발

이것은 전통적 약이나 재조합 약물의 제조설비를 건설하는 것과 같다. 낙농제품에 대한 현재의 기준은 약품, 특히 비 경구제재 만큼 엄격하지 않으므로 형질전환 동물들의 사육과 보건 그리고 착유실시에 대한 지침이 필요하다.

Genzyme Transgenic사(메사츄세츠주 프래밍엄시 소재)는 예를 들면 우수의약품 생산설비기준(GMP)와 유 사한 Good Agricultural Practice를 개발중인데 형질전환동물의 생산과 보호의 여러 면에서의 표준 운영규정들을 포함하고 있다. 예방적 건강보호가 특히 중요한데 항생제나 다른 약물이 유즙속에 필요치 않은 잔존물들을 남길지 모르기 때문이다.

안정적으로 삽입된 형질전환 유전자들은 바로 멘델식으로 유전되기 때문에 생산동물들은 전통적 동물 사 육대로 확립되고 보충되고 확대될 수 있을 것이다. 육종과 집단확장에 관해 선별, 재삽입, 개개동물의 폐기를 포함한 어떤 기준이 정해져야 한다. 개개 생산동물들은 항구적으로 동정되고 형질전환 유전자의 발현과 안정성은 감시되어야 한다. 동물들은 이형접합성이나 동형접합성으로 만들어지 며 생산동물의 유전자형들은 주의깊게 확인되고 모니터되어야 한다.

방법들도 역시, 재조합 배양세포에서 그랬듯이 동물 생산계통의 장기적인 이용가능성이 보장되게 개발되 어야 한다. 형질전환 유전자의 장기적 안정성을 위해서는 생산에 들어가는 연속된 발생의 수에 관해서는 실질적으로 한계가 있을 것이다. 정자 은행이나 배동결 같은 확립된 기술 그리고 핵치환이나 분리배와 같은 신기술이 집단운영이나 신설에 적용될 수 있을 것이다.

유즙에서의 조 단백질의 생산에는 지침이 필요할 것이다. 예를 들면 평균 지속 단백질 발현수준에 관한 최소가능기준이 계절과 연령과 개개의 산유주기에 따라 있어야 할 것이다.

이계 교배된 동물에서의 형질전환 유전자의 발현에 관한 유전적 배경의 영향은 미정이다. 유즙생산동물 의 방목과 조절된 飼養의 표준도 확립되어야 한다. 예를들면 자연건초의 부산물과 아플라톡신은 유즙에서 끝날 수 있지만 약품용 조제를 목적으로 한 粗산물에서는 환영받지 못할지 모른다.

암소와 양, 염소 그리고 돼지는 종특이성 바이러스와 프리온 감염의 위험이 있다, 감염위험은 무병으로 입증된 동물로부터 나 지 폭으로부터의 무리생산이나 생산기간의 동물 무리의 주의 깊은 관찰로 감소시킬 수 있다.

바이러스는 인간의 경우보다 동물의 경우 더욱 중요할 수 있다고 Genzyme사의 생물치료 단백질 생산책임 자인 존 맥퍼스 박사는 지적한다. 소나 돼지의 인슬린, 콜라겐, 소 DNAase 그리고 소 TSH가 수백만의 환자에게 몇 십년동안 동물로부터의 바이러스 전염의 확실한 확증없이 사용되어 왔다. 더구나 CBER의 바우어박사는 소의 해면양 뇌염과 스그라피의 원인인 프리온은 유즙으로 는 인간에의 전염 위험이 이론보다 적은데 왜냐하면 유선에서는 발생하지 않고 만일 유도된다하더라도 생존하기 힘들기 때문이다. 형질전 환 조단백질의 생체내 가공에 관한 문제도 재조합 단백질의 세포배양생산시의 발생되는 문제와 비슷하다. 조단백질 구조와 생활성도 그리고 글리코 시레이션과 카복실레이션 그리고 전구체 펩티드의 단백분해 분열의 복잡한 서열이 Factor Ⅸ와 단백질 C에서는 밝혀졌지만, 타 단백질들의 종특이성 글리코 시레이션 패턴이 지적되어 왔다. 형질전환 단백질의 유즙에서의 프로테아제에 의한 단백분해 가능성은 현재까지는 실제적 문제라기보다는 이론적 관심의 문제이다.

가공과 정제

형질전환으로 생산된 치료제도 현재의 재조합 산물과 마찬가지로 동일한 기술적, 규제적 대응에 직면할 것이라고 Genzyme사의 헤른든씨는 말한다. 즉 단백질 정제, 바이러스 및 공정의 검증, 순도, 역가, 안정성 그리고 수율등이다.

유즙화학과 분별법은 충분히 이해되어야 한다. 지질과 일반적 유즙단백질 그리고 상동의 숙주 단백질들 을 제거할, 생물학적으로 활성인 형질전환 단백질의 효율적인 분리설계는 개발되어 왔다. 예를 들면 GenePharming Europe사(네덜란드 Leiden시 소 재)는 암소유즙으로부터 인간 락토페린을 89%의 수율과 99% 이상의 순도로 정제하여 왔고 PPL Therapeutics사(스코틀랜드주 에디 버그시 소재)는 AAT에 대해 40%의 수율과 90% 이상의 순도를 얻었으며 Genzyme Transgenics사는 ATⅢ에 대해 60-70%의 수율과 99%의 순도를 보고하였다. 목표 粗 단백질 함량을 리터당 그람의 범위나 세포배양배지의 수 배에서 수 백배까지 로 증가시킬 수 있을 것이라고 Altra Bio사 (미네소타주 아르덴 힐즈시 소재)의 Len Ruiz 박사는 전망한다. 미량의 항생물질이나 동물약품의 제거, 또는 미생물적인 오염이나 그 부산물의 불활성화 내지는 제거법은 현재 있으며 신기법들이 개발중이다.

절대적 지침은 없다.

純度에 대한 절대적 지침은 없다라고 겐자임사의 McPherson 박사는 말한다. 최저순도기준이 모든 특정 단백질에 대해 정해져야 하고 최종산물의 1회 예정복용량(절대량)과 전달경로 그리고 복용섭생법(예를 들면 급 · 만정)이 반영되어야 한다. 예를 들면 마이크로그람이나 밀리그람의 양으로 전달되는 성장인자나 림포카인은 99%의 순도로 충분하지만 10g이 넘게 복용되는 인간 혈청 알부민의 경우는 불가능하다.

생물의약품은 재조합 단백질 치료제에 수율의 증가와 효율성 그리고 저렴한 경비를 제공하며, 다른 방법 으론 쉽게 불가능한 복잡한 새로운 약제의 개발을 가능케 해야 한다. 이 새로운 생산물과 공정에서 규제들은 FDA CBER의 제1관할권에 해당되고 어 떤 특정산물은 딴 기구의 제2관할권체 속할 것이다.

규제문제들은 잘 이해되고 있고(표 4) 여러 문제들의 많은 것은 재조합 단백질에 대해서도 제기되어 왔 다. 형질전환동물과의 10년이 넘는 경험은 이 새로운 치료제의 안전성과 효율성을 보증하는데 있어 혁신적이고 책임있는 접근의 기초를 제공 할 것이다.