바이오인

Ⅰ. 일반사항

  1. 목적

  2. 용어정의

  3. 적용범위

Ⅱ. 코로나19 치료제 in vitro 효력시험법

 1. 플라크 감소 시험법 

   1.1. 시험원리

   1.2. 재료 및 기기

   1.3. 배양 및 시험물질 조제

   1.4. 시험방법

   1.5. 평가방법

   1.6. 결과분석 

 2. 세포변성효과 억제 시험법

   2.1. 시험원리 

   2.2. 재료 및 기기 

   2.3. 배양 및 시험물질 조제

   2.4. 시험방법

   2.5. 평가방법

   2.6. 결과분석

 3. 바이러스 유전자 정량 시험법

   3.1. 시험원리 

   3.2. 재료 및 기기

   3.3. 배양 및 시험물질 조제 

   3.4. 시험방법 

   3.5. 평가방법

   3.6. 결과분석

 4. 항염증 활성 시험법  

   4.1. 시험원리

   4.2. 재료 및 기기 

   4.3. 배양 및 시험물질 조제

   4.4. 시험방법

   4.5. 평가방법

   4.6. 결과분석

Ⅲ. 평가 시 고려사항

Ⅳ. 참고문헌 

Ⅰ. 일반사항

 1. 목적

  코로나바이러스감염증19(코로나19)는 바이러스로 인한 급성 호흡기 질환으로, 2019년 12월 코로나19가 확인된 이래 원인 바이러스인 SARS-CoV-2의 다양한 변이가 보고되었으며, 현재까지 12종의 변이바이러스가 발견되어 국민 건강에 큰 위협을 주고 있다. SARS-CoV-2 등 신종 바이러스의 출현으로 변이바이러스의 특성에 따른 새로운 진단법, 백신 및 치료제 효과의 평가법이 지속적으로 개발되어야 하며, 특히 코로나19 범유행 종식을 위해 우선적으로 신속한 치료제 개발이 요구되고 있다. 또한 신규 코로나19 치료제 후보물질의 임상시험계획서를 신속하게 심사하고, 임상시험 진입에 소요되는 시간을 최소화하여 치료제 개발을 앞당길 수 있는 방안이 필요한 상황이다[1].

  코로나19에 대한 치료제 개발자의 시행착오를 최소화하고 의약품 개발에 소요되는 시간을 최소화할 수 있는 효력시험법 확립이 요구됨에 따라, 본 안내서는 치료제 후보물질의 항바이러스 효력 및 바이러스로 인한 염증을 억제하는 효력을 in vitro 에서 측정하는 시험법을 소개하고자 한다. 이를 통하여 코로나19 치료제의 효력평가 및 다양한 치료제 개발의 효력평가에 적용하여 개발자들의 신규 코로나19 치료제 후보물질의 임상시험 진입 속도를 높일 수 있을 것이다.

  코로나19 치료제는 SARS-CoV-2 바이러스의 생활사에 관여하여 바이러스를 억제하는 약물로써, 항바이러스 및 항염증 효력을 평가하기 위하여 in vitro 시험을 실시한다. 항바이러스 효력평가 즉, 약물의 바이러스에 대한 억제 정도를 시험하기 위하여 플라크(Plaque) 및 세포변성효과(Cytopathic effect; CPE)의 감소를 측정하거나 바이러스 유전자의 복제수(Copy number)를 측정하여 비교함으로써 항바이러스 효과를 확인한다. 또한 항염증 효력평가는 in vitro 시험으로만 확인하기에는 한계가 있을 수 있으나, 항염증 관련 사이토카인 단백질 양을 측정하는 것이 일반적이다. 여기서는 항염증 효력평가의 한 가지 방법으로 RNA에서 수준 사이토카인 유전자 복제수 변화를 정량화함으로써 사이토카인 발현 수준을 측정하는 방법을 제시하고자 한다.

 2. 용어정의

 

▪ 코로나19

 코로나바이러스-2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2; SARS-CoV-2)에 의한 중증급성호흡기 감염증

▪ 항바이러스제

 바이러스의 생활사에 관여하여 바이러스를 억제하는 약물

▪ 플라크(Plaque) 

 바이러스가 세포 용해를 일으켜 주변 세포가 감염되고 세포 단층이 탈락된 영역

▪ 플라크 형성 단위(Plaque forming unit; PFU)

 단층 배양된 세포에서 한 개의 플라크를 형성하는 바이러스의 감염 단위

▪ 세포변성효과(Cytopathic effect; CPE)

 바이러스에 감염된 세포에 나타나는 형태적인 변화

▪ 50% 억제 농도(50% Inhibitory concentration; IC50)

 바이러스의 감염을 50% 억제시키는 시험물질(약물)의 농도

▪ 50% 조직배양감염용량(50% tissue culture infectious dose; TCID50)

 세포 배양에서 세포의 50%를 감염시켜 세포변성을 나타낼 수 있는 바이러스 양 

▪ 실시간 정량 역전사 PCR (Real-time qRT-PCR) 

 역전사 중합효소연쇄반응법으로 PCR 과정 중에 증폭되는 산물을 실시간으로 모니터링하여 시료에 존재하는 초기 DNA량을 계산할 수 있는 방법

▪ 양성대조군(Positive control; PC)

 시험 결과에서 코로나19 치료제에 의한 효력을 예측할 수 있는 대조군으로 처리한 군

(예, 램데시비르 처리군)

▪ 음성대조군(Negative control; NC)

 시험 결과에서 코로나19 치료제에 의한 효력이 관찰되지 않을 것으로 예측되는 대조군으로써 바이러스를 접종한 후 치료제를 처리하지 않은 군

▪ 무처리대조군(Non-treatment control; NTC)

 바이러스 및 약물 처리를 하지 않은 비처리 시험군

▪ 역치 사이클(Cycle threshold ; Ct)

 증폭신호의 증가 양상이 뚜렷하게 구분되는 시점(역치)과 DNA 증폭 곡선 사이의 교차점 

 3. 적용범위

 

 코로나19 치료제는 SARS-CoV-2의 인체 내 감염이나 증식을 억제하는 약물로써, 치료제 개발시 약물 후보군의 신속한 스크리닝을 위하여 SARS-CoV-2의 억제 정도를 확인하는 in vitro 시험을 실시한다. 바이러스에 감염된 세포에 나타나는 형태적인 변화인 세포변성효과(cytopathic effect, CPE) 및 플라크(plaque) 형성을 관찰하여, in vitro 시험에서 산출한 50% 유효 농도(50% effective concentration; EC50), 50% 억제 농도(50% inhibitory concentration; IC50), 50% 세포독성 농도(50% cytotoxic concentration; CC50), 50% 조직배양감염용량(50% tissue culture infective dose : TCID50), 또는 바이러스 복제수 감소를 바탕으로 개발 가능성을 검토한다.

 항바이러스 효과를 시험하기 위하여 바이러스의 감염력 즉, 감염 역가(titer)의 정확한 측정이 필수이다. 정확한 바이러스의 감염 역가를 이용하여 시험함으로써 치료제 후보물질의 바이러스 억제 효력을 정량적으로 평가할 수 있다. 바이러스 정량화에는 플라크 형성, 세포변성, 바이러스 복제수 등의 방법을 이용한다. 또한 항염증 활성을 측정하기 위해서 염증 유전자(사이토카인 등) 복제수 측정 등의 방법을 이용할 수 있다.

 다만, 효력시험은 의약품 개발 가능성을 탐색하는 시험으로, 치료 표적이나 작용기전에 대한 연구만으로 인체 내에서의 작용을 설명하기에는 한계가 있으므로 임상시험 진입 전에 in vitro시험과 in vivo (생체내) 시험이 모두 수행되는 것이 바람직하며, 본 안내서는 코로나19 치료제 후보군의 스크리닝을 위한 in vitro 효력시험법을 기술하고자 한다.

 또한 바이러스 유형에 따라 세포변성 발생이 다르고, 염증 발생 차이가 있으므로 치료 후보물질의 특성 및 바이러스 종류에 따라 적절한 시험조건 등 시험법을 선택하여 시험한다.

 

 

Ⅱ. 코로나19 치료제 in vitro 효력시험법

 

코로나19 치료제의 in vitro 효력시험 시 사용되는 SARS-CoV-2 바이러스는 고위험등급의 바이러스이므로 생물안전 3등급(BL3) 실험실에서 취급 및 실험을 수행해야 한다. 효력시험법으로 플라크 감소 시험법, 세포변성효과 억제 시험법, 바이러스 유전자 정량 시험법, 항염증 활성 시험법을 활용할 수 있으며 현재 주로 활용되는 방법은 플라크 감소 시험법이다. 다만, 개발자가 치료 후보물질의 특성 및 바이러스 종류 등에 따라 아래 방법 중 선택하여 적절하게 사용할 수 있다.

 

1. 플라크 감소 시험법

 1.1. 시험원리 

 플라크 감소 시험법은 세포 배양에서 분리된 플라크의 계수를 통해 시험물질의 감염성 바이러스에 대한 억제를 직접 정량화하는 방법이다[2]. 플라크의 수를 50% 줄이기 위해 치료제 후보물질이 얼마나 필요한지 또는 치료제 물질이 얼마나 효과적인지를 측정할 수 있다[3]. 

 플라크 시험법은 바이러스 정량화를 위한 방법 및 기술의 발전이 계속되는 동안에도 감염 용해성 바이러스의 농도를 결정하는 “Gold standard”로 이용되고 있다[4]. 바이러스는 감염된 세포에서 복제-용해-감염 주기를 계속하여 주변 세포를 파괴하며 점점 더 뚜렷한 가시적인 영역을 형성한다. 

이때에 파괴된 세포의 영역을 플라크라고 하며, 바이러스 증식 및 숙주 세포에 따라 일반적으로 2-14일 이내에 눈으로 확인할 수 있는 플라크가 형성된다. 여기서는 바이러스로 감염된 세포 단층을 중층(overlay) 배지로 덮어 바이러스가 증식하는 동안 액체 배지의 기계적 또는 대류 흐름을 통해 바이러스 감염이 무차별적으로 퍼지는 것을 방지하여 바이러스성 플라크의 생성을 관찰하고자 고정 중층 기술을 이용하여 플라크 감소를 시험하는 방법을 제시한다. 고정 중층 기술을 위해 한천, 메틸셀룰로오스 또는 카르복시메틸셀룰로오스(CMC)와 같은 고체 또는 반고체 배지가 사용된다. 초기 감염 및 고정 중층 적용 후 바이러스 감염 및 복제가 주변 단층으로 제한됨에 따라 개별 플라크 또는 세포 사멸 영역이 발달하기 때문에 SARS-CoV-2로 인한 플라크는 고정 중층 적용 후 3-5일에 크리스탈바이올렛으로 염색하여 눈으로 확인할 수 있다.