바이오인

단백질 분해 탐지 기술을 이용한 게놈분석

박우진 / 광주과학기술원 생명과학과 단백질분해연구실

http://life.kjist.ac.kr/Htm/Lab/molgen/index.htm

본 총설에서는 광주과학기술원 생명과학과 단백질분해연구실에서 진행되고 있는 연구의 일부를 소개하고자 한다. 본 연구실의 연 구 주제는 단백질 분해효소 (protease)인데, protease는 여러 가지 생체 작용에 관여하고 있고, 암이나 치매와 같은 질병의 발병 과정에도 관여하고 있다. 따라서, 대학의 연구실외에도 유수의 제약 회사들이 여러 가지 protease의 특성을 연구하고 있고, 그들의 억제제 (inhibitor)를 개발하려고 노력하고 있다.

Protease의 기능을 이해하기 위해서는 먼저 그 protease의 기질 특이성 (substrate specificity)을 알아야 하 고, 그 다음으로 그 protease의 세포내의 기질 (cellular target)을 알아내는 것이 중요하다. 이를 위하 여 일단 protease를 순수분리 (purification)해야한다. 이 과정이 경우에 따라서는 매우 어렵거나 불가능할 수 있다. 더욱이 membrane protease일 경우에는 더욱 심각한 문제가 될 수 있다. Protease의 substrate specificity를 연구하 기 위해서는 가능한 다수의 peptide를 합성하여 in vitro 에서 purify한 protease에 의해 절단되는 지 확인하는 방법이 있고, phage display 등을 이용하는 방법 이 있다. 어느 방법이든지 많은 비용과 노력이 소요된다. Protease의 cellular target substrate을 알아내 는 것은 더욱 어려운 일이다. 이를 위해서는 여러 가지 기초 연구로 그 protease의 세포 내의 기능을 알아 내고, 그것으로 candidate를 추측한 다음, 여러 가지 방법으로 protease-substrate 관계를 확인할 수 있 다.

본 연구실에서 개발한 GASP (genetic assay for site-specific proteolysis)과 sGASP (secretory GASP)은 위와 같이 기존 기술의 취약성을 해결한 기술이다. 즉, protease와 substrate를 효모 내에서 발현 함으로써 protease를 purify하거나 substrate pepetide를 합성할 필요가 없다. 또한 yeast two hybrid를 수행하는 것과 유사한 방식으로 protease의 cellular substrate의 유전자를 동정할 수 있다. 또한, 이들은 protease의 inhibitor를 동정하기 위한 cell-based assay system으로도 사용될 수 있을 것이다.

▶ GASP (genetic assay for site-specific proteolysis)

GASP의 원리를 Figure 1 에 표시하였다. 먼저 전사인자 (tranion factor)인 GAL4나 LexA-b42를 적당한 막단백질 (membrane protein)의 카르복시 말단에 연결한 융합단백질 (fusion protein)로 효모에서 발현한다. 이때 membrane protein과 tranion factor 사이에 특정 protease의 substrate sequence를 삽입한다 (Panel A). 만약 삽입된 substrate sequence를 절단하는 protease를 효모 내에서 발현하여 proteolysis가 일어나면, tranion factor는 세포막에서 풀려 나와 핵 속으로 이동할 수 있게 되고, 그 결과 로 보고 유전자 (reporter gene)들이 발현되게 된다 (Panel B). Reporter gene (β-galactosidase, Leu, Ade 등)의 발현은 배지 상에서 쉽게 측정이 가능하다.

우리는 먼저 HCV (hepatitis C virus) NS3 protease를 모델로 이용하여 GASP이 실현 가능하다는 것을 보여주었다. 그 다음, substrate sequence 부분을 무작위화 (randomize)함으로써, 특정 protease에 의해서 절단되 는 sequence를 얻을 수 있고, 이 결과로부터 optimal substrate sequence를 유추해 낼 수 있었다. 이 것은 우선 substrate-based inhibitor design을 위해 필요한 정보를 제공할 수 있을 것이고, 궁극적으 로 그 protease의 기능을 이해하기 위한 기반을 마련해 줄 것이다 (Kim et al., 2000; Kang et al., 2001a). 같은 방식으로 HGV (hepatitis G virus) NS3 protease, TuMV NIa protease의 기질 특이성을 연구하였다 (Lee et al., 2001; Kang et al., 2001b).
 

최근의 genome project 등의 연구로 인하여 많은 수의 새로운 protease들이 발견되었다. Protease의 기능을 이해 하기 위해서는 그것의 target이 되는 cellular substrate를 알아내는 것이 매우 중요하다. Degradomics라는 신조어는 protease의 cellular target를 genome 수준에서 동정하고자 하는 것을 나타내는 말로서 functional genomics의 한 분야라고 할 수 있다.

 그러나, 지금까지는 이를 수행하기 위한 효과적인 기술이 없 기도 하다. GASP과 sGASP은 degradomics를 수행하기에 적합한 기술이 될 수 있다고 생각된다. 즉 cDNA를 substrate site에 삽입한 library를 만들어 screen하면 특정 protease에 의해서 절단되는 단백질의 유전자를 바로 동 정할 수 있을 것이다. 본 연구실에서는 우선 이것을 보여 주기 위하여 C. elegans의 CED3 라는 protease를 모델 로 하고 실험을 수행 중이고 , 조만간 그 연구 결과를 발표할 수 있을 것으로 기대하고 있다.

▶ sGASP (secretory GASP) 
 

GASP은 세포질 (cytoplasm)에서 일어나는 proteolysis를 분석하는 데 유용한 기술이다. 그러나, 많은 protease들 이 분비 경로 (secretory pathway) 상이나 세포막 혹은 ECM (extracellular matrix)에 존재한다. 따라서 우리는 이런 protease에 의해서 일어나는 proteolysis를 탐지할 수 있는 유전학적인 기술을 개발하 였고, 이것을 sGASP (secretory GASP)이라고 명명하였다. sGASP의 원리를 Figure 2 에 표시하였다. 효모의 invertase는 periplasmic space에서 sucrose를 glucose와 fructose로 분해하는 효소이고 suc2에 의해 encode된다. 따라서 suc2― 인 효모는 sucrose 배지에서 자랄 수 없다. 골지체 (golgi)에 존재하는 membrane protein에 invertase를 연결한 fusion 단백질을 발현시키면 invertase는 golgi에 갇힌 상태가 되어 이 효모는 sucrose 배 지에서 자라지 못한다. 이때 golgi membrane protein과 invertase 사이에 특정 protease의 substrate sequence를 삽입한다. 만약 golgi에 이 sequence를 절단하는 protease가 발현되면, invertase는 비로소 세포 외로 분비되고 그 결과 이 효모는 sucrose 배지에서 자랄 수 있게 된다. 즉 sucrose 배지에서 효모가 자 라는 것을 관찰함으로써 proteolysis를 탐지할 수 있는 것이다.

우리는 GASP의 경우와 마찬가지로 Kex2라는 protease를 모델로 이용하여 sGASP이 실현가능하다는 것을 알아내었 다. 또한 이렇게 확립된 sGASP을 이용하여 TMPRSS2라는 membrane protease의 substrate specificity를 알아낼 수 있었다 (paper in preparation). Alzheimer's disease의 발병 기작에 관여하는 amyloid precursor protein (APP)의 process에 관여하는 BACE (β-secretase)의 활성을 sGASP으로 탐지할 수 있었다. 이들 membrane protease들의 기질 특이성 연구를 수행하고, 그 다음으로 이들의 cellular target를 밝혀내는 실험을 수행하고 있다.

▶ 결 론

본 연구실에서 는 독자적으로 개발한 GASP과 sGASP을 이용하여 여러 가지 protease의 특성을 연구하고 있다. 이런 노력은 protease의 세포 내에서의 기능을 보다 자세하게 이해하는데 도움을 줄 뿐 아니라, 신약 개발에도 큰 도움을 줄 것 이다. 이 기술을 이용하여 이미 Immunex (미국)와 공동 연구를 수행하고 있고, 앞으로도 국내외의 여러 연구실과 공동 연구를 기대 하고 있다.

▶ Reference

- Sung Yun Kim, Kye Won Park, Yong Jae Lee, Jae Hwan Goo, Sung Hoon Back, Ohkmae K. Park, Sung Key Jang, and Woo Jin Park (2000) In vivo determination of substrate specificity of hepatitis C virus NS3 protease: genetic assay for site-specific proteolysis. Analytical Biochemistry 284:42-48.

- Hara Kang, Sung Yun Kim, and Woo Jin Park (2001a) An improved strategy for a genetic assay for site-specific proteolysis. Molecules and Cells 11:263-6.

- Yong Jae Lee, Hara Kang, Seong-Hwan Rho, Soo Hyun Eom, and Woo Jin Park (2001) Assessment of Substrate specificity of Hepatitis G Virus NS3 protease by a Genetic Method. . Biochemical and Biophysical Research Communications 286:171-5.

- Hara Kang, Yong Jae Lee, Jae Hwan Goo, and Woo Jin Park (2001b) Determination of the substrate specificity of turnip mosaic virus NIa protease using a genetic method. Journal of General Virology 82:3115-3117.