Zinc finger를 이용한 유전자의 전사조절 기술을 산업화하는 회사

1. 서론

툴젠은 생명공학, 분자의학의 원천기술을 개발하고 이를 바탕으로 이익을 창출하는 기술중심 회사이다. 툴젠은 유전자인식 및 조절에 있어 획기적인 원천기술을 보유하고 있고 이를 생명공학의 여러 분야에서 폭넓게 활용하고자 계획하고 있다. 즉, Zinc finger 단백질을 이용해서 제조한 인공 전사인자를 이용하여 인간을 비롯한 동물 및 식물, 미생물의 수많은 유전자를 원하는 대로 조절할 수 있는 새로운 기술의 개발을 목표로 하고 있으며, 현재까지 축적된 많은 연구 결과는 이러한 기술의 가능성을 증명해 주고 있다.

툴젠은 1999년 10월 8일에 김 진수박사에 의해 설립되어. 박사 4명, 석사 7명 (2003년 10월 말)의 연구진과 5명의 연구지원팀 (bioinformatics 전공 1명, technician 1명)으로 이루어진 회사이다. 툴젠은 대덕연구단지내 대덕바이오커뮤니티에 위치하고 있는데, 이곳 커뮤니티에는 다양한 생명공학분야의 10여개 회사가 함께 자리하고 있어서 필요시에 각 회사 연구진의 전문적인 기술과 지식을 쉽게 이용할 수 있는 이점이 있다.

2. 인공 전사인자

A. zinc finger domain의 분리

모든 생물에서 유전자의 발현은 전사인자에 의해 조절된다. 이들 전사인자 가운데는 특정한 유전자의 발현을 촉진시키는 역할을 하는 전사 활성인자도 있고 반대로 특정한 유전자의 발현을 억제시키는 역할을 하는 전사 억제인자도 있다. 대부분의 전사인자들은 보통 특정 DNA 서열에 결합하는 부분과 유전자의 발현을 억제 또는 촉진하는 functional domain부분으로 구성되어 있으며 이 두 부분이 조립식으로 작용하는 특징을 가지고 있다. 즉, A라는 전사인자의 DNA에 결합하는 부분을 B라는 전사인자의 functional domain에 연결해도 이 들 각 부분은 원래 전사인자에서 갖고있던 기능을 그대로 수행하게 된다. 과학자들은 전사인자의 이 특성에 주목하여, 주어진 임의의 염기서열에 결합할 수 있는 DNA결합부분을 만들 수 있다면 여기에 적절한 functional domain을 연결함으로써 특정 유전자의 발현을 임의로 선택적으로 조절할 수 있는 맞춤 전사인자의 개발 가능성을 예측하였다. Zinc finger 단백질은 zinc 이온에 의해서 그 구조가 안정화되는 단백질을 통칭하는 것으로써 동물, 식물, fungi등 진핵생물에서 광범위하게 발견되고 있으며 일부 원핵생물에서도 발견된다. Zinc finger 단백질의 생체내 주요 기능은 특정 염기서열과 결합하여 전사인자로 작용하는 것이다. zinc finger를 포함한 단백질이 zinc finger domain의 작용으로 특정 염기서열에 결합하면 그 단백질의 다른 부분은 functional domain으로 작용하여 대상유전자의 전사를 조절하는 기능을 나타내게 된다. 이러한 zinc finger domain은 맞춤 전사인자를 개발하는데 있어 가장 적절한 DNA 결합 모티브로 인식되고 있다.

zinc finger domain이 맞춤전사인자의 가장 적절한 DNA결합모티브로 생각되는 이유는 첫째 그 구조의 조립성(modularity)에 있다. 현재까지의 여러 zinc finger domain과 DNA의 구조연구를 통해, 30개의 amino acid로 이루어진 각 zinc finger domain은 3 bp의 염기서열을 특이적으로 인식하고, 각각의 finger들은 서로 독립적으로 그 대상 3 bp를 인지하여 결합한다는 것이 알려져 있다. 이처럼 한 개의 zinc finger unit이 3 bp의 염기서열을 인지하기 때문에 G, A, T, C의 3 bp 조합을 인식할 수 있는 64개의 서로 다른 zinc finger unit들을 확보하면, 그림 1b의 예시와 같이, 주어진 어떤 염기서열에 대해서도 그것에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질을 조립하는 것이 가능하다. zinc finger가 맞춤전사인자의 가장 적절한 소재가 될 수 있는 두 번째 이유는 자연계에 존재하는 zinc finger 단백질이 인지하는 염기서열이 매우 다양하다는 것이다. zinc finger단백질들 가운데에는 CF2-II나 Hunchback처럼 AT-rich sequence에 결합하는 것들도 있고 SP1이나 Zif268처럼 GC-rich sequence에 결합하는 것들도 있다. 이러한 사실은 zinc finger 단백질의 유전자 염기 서열 인식 특이성을 인위적으로 조절함으로써 다양한 염기서열에 결합할 수 있는 맞춤형 DNA 결합모티브를 제작할 수 있다는 전망을 가능하게 한다.

이러한 점에 착안하여 다양한 염기서열을 인식할 수 있는 zinc finger를 확보하기 위한 노력이 진행되었다. site-directed mutagenesis, phage display, 대장균이나 효모를 이용한 one-hybrid system 등이 그 예이다. (Desjarlais & Berg, 1992; Rebar & Pabo, 1994, Joung et al. 2000, Bartsevich & Juliano, 2000, Bae et al. 2003) 본사의 연구진은 효모의 one-hybrid system을 변형한 새로운 ion system을 개발하여 56개의 zinc finger domain을 인간게놈에서 분리하였다. 이들을 가능한 64개의 염기서열에 대해 결합가능성을 조사한 결과, 이들은 총 25개의 3 bp의 염기서열에 특이적으로 결합할 수 있는 것으로 확인되었다. 본사의 경험으로는 이 정도 수의 zinc finger domain만 가지고서도 한 인간 유전자의 promoter의 특정 9 bp 이론상으로 결합하는 DNA 결합단백질을 수백 개까지 제조할 수 있었다.


B. zinc finger domain을 이용한 인공전사인자의 제조

위와 같이 분리된 zinc finger domain 들을 3개이상 조합하여 결합시키면 9개이상의 DNA 염기서열에 특이적으로 결합하는 Zinc finger 단백질을 제조할 수 있다. 이 zinc finger 단백질은 단백질 자체에 연결시키는 functional domain종류에 따라 전사활성인자 또는 전사억제인자로 이용할 수 있다. 즉 포유동물에서는 zinc finger 단백질을 p65, VP16의 전사 활성화도메인에 연결하여 전사활성화인자를 제작할 수 있다. 또한KRAB과 같은 억제 도메인에 연결시키면 효과적인 전사억제인자를 만들 수 있다. 효모에서는 활성화도메인으로 VP16이나 Gal4를, 억제 도메인으로 Ume6 domain을 이용한다. 이와는 별도로, zinc finger 단백질은 활성화도메인이나 억제도메인 없이, 결합하는 promoter상의 위치에 따라 그 자체로 전사 억제인자가 되기도 한다. 이상과 같은 방법으로 맞춤 제작된 인공전사인자를 이용하여 유전자의 발현을 조절할 수 있다는 것은 다수의 유전자에 대해 이미 입증되었다 (Kim & Pabo, 1997; Beerli, et al. 2000; Kang & Kim, 2000; Liu, et al. 2001; Guan, et al. 2002; Ordiz, et al. 2002; Reber et al. 2002).

C. 인공전사인자 기술의 장점

툴젠의 인공전사인자 기술은 경쟁기술인 유전자 과량발현 (cDNA overexpression 등)이나, 유전자 제거방법 (antisense RNA, RNAi등)과 비교할 때 몇 가지 뚜렷한 장점이 있다. 첫째로 인공전사인자 기술은 한 종류의 ZFP library로 여러 생물체에 적용할 수 있다. genome sequence는 A, C, G, T 4개의 염기로 이루어져서 genome size만 같다면 어떤 특정 9 bp의 염기서열이 해당 개체의 genome에 나타날 가능성은 동일하기 때문이다. 둘째로 대부분의 경쟁기술이 activation이나 repression 어느 한 방향으로만 작용하는 데 반해 툴젠의 기술은 양 방향으로의 조절이 가능하다. 셋째로 유전자 조절을 다양한 강도로 유도할 수 잇다. 본 연구진의 연구결과에 의하면 어떤 전사인자를 활용하느냐에 따라 특정한 유전자의 발현을 50%에서 99%까지 억제하거나, basal level에 비해 2배에서 100배까지 유전자의 발현을 증가시킬 수 있었다. 그러므로 전사인자를 이용한 기술은 기존의 유전자 과량발현이나 제거방법에 비해 훨씬 다양한 표현형을 확보할 수 있을 뿐만 아니라, 형질개량에 이용할 수 있는 표적 유전자의 범위도 더욱 넓혀 줄 것이다. 넷째로 개별 target gene의 유전자 조절을 통해서 뿐만 아니라 library를 이용한 screening방법으로도 원하는 형질을 구하는 것이 가능하다. library screening은 포유동물 세포에선 그 기술의 한계로 인해 ribozyme을 이용한 library screening정도가 개발되어 있을 뿐이다. 다섯째로 target approach의 경우, 한 전사인자에 의해 co-regulation되는 기능상 유사한 복수의 유전자나, 다양한 splicing variant를 동시에 조절하는 것이 가능하다. 여섯째로 분리, 정제된 유전자를 활성화시키는 것이 아니고 전사인자를 만들어 세포 내에 존재하는 내부 유전자를 활성화시키기 때문에 기존의 유전자 특허 때문에 야기될 수 있는 특허 사용 허가나 특허 사용료 등의 여러 문제를 피해갈 수 있다.

3. 맞춤전사인자의 응용

Zinc finger 기술에 기반을 두고 있는 회사로는 미국의 Sangamo Biosciences와 한국의 Toolgen 2개의 회사가 있다. 이 두 회사의 맞춤형 전사인자를 이용한 유전자 조절기술은 이미 생명공학산업의 주요한 수단으로 주목받고 있다. 현재 zinc finger를 이용하여 제작된 전사인자들은 신약 개발 및 유전자 치료와 관련하여 활발한 연구가 진행중이며, 또한 그 응용범위가 동물, 식물, 미생물로 점차 넓혀져 가고 있다. 툴젠은 현재까지 축적된 기술을 바탕으로 크게 세분야로 연구를 나누어 진행하고 있다.

첫째는 target-driven approach이다. 이 방법은 맞춤전사인자를 이용하여 target 유전자의 발현을 조절하고자 할 때 그 유전자의 promoter서열에 결합하는 적절한 DNA 결합단백질을 제조하여 사용하는 방법이다. 이미 human, mouse, C. elegans, Drosophila를 비롯해서 연구용이나 산업용으로 중요한 수십 종의 미생물에 대해서 그 전체 게놈 서열이 알려져 있기 때문에 이 방법은 유전자가 결정되면 쉽게 적용할 수 있다. 만약 아직 그 정보가 알려지지 않았다면 promoter cloning을 통한 그 서열정보의 확보가 필수적이다. 툴젠에서는 이 방법으로 이미 40여개의 target gene에 대해 activation이나 repression중, 원하는 발향으로의 발현 조절을 성공적으로 수행한 바 있다. 이 방법은 대상 target gene의 발현 조절에 의한 phenotype관찰을 토대로 target gene과 특정 phenotype의 연관관계를 추정할 수 있어 target validation에도 이용할 수 있다. 현재 툴젠은 target-driven approach로 혈관생성인자의 발현을 20-50 배까지 증가시키는 zinc finger를 제조하여 이를 이용한 심혈관계질환의 치료제개발을 수행하고 있다.

둘째는 phenotype-driven approach이다. 이 방법은 target phenotype이 결정되었으나, 대상 생물체의 게놈정보나 개량하고자 하는 형질과 관련된 유전자가 알려지지 않은 경우엔 사용하는 방법이다. 이 방법은 zinc finger library를 제조하여 대상 생물체에 형질 전환한 후, 원하는 형질 (phenotype)을 가진 생물체를 선별해 내는 방법이다. phenotype-driven approach는 screen하는 방법만 확실하다면, 많은 수의 개체를 비교적 손쉽게 형질 전환하여 screen할 수 있는 미생물에서는 매우 유용한 방법이다. 툴젠에서는, 이 방법을 이용하여, 효모에서 일정 농도의 항진균제 처리시 생존률을 백 배 이상 증가시키는 zinc finger를 수종 분리하고 이들 zinc finger의 target 유전자로 추정되는 유전자를 분리하여 이 유전자의 과대발현이 효모의 항진균제에 대한 저항성을 증가시킨다는 것을 증명하였다. 이러한 결과는 zinc finger를 이용하여 원하는 어떤 형질을 유도할 수 있으며, 그 형질에 관련된 유전자까지 분리할 수 있음을 보여주는 좋은 예이다. 현재 툴젠에서는 효모뿐 아니라, 원핵생물인 대장균에서도 일정한 유기용매나 열 처리 조건에서 생존률을 각각 최고 200배, 700배까지 증가시키는 zinc finger들을 분리하는 데 성공했다. 툴젠은 이러한 실험결과를 바탕으로 다른 산업적으로 중요한 미생물의 형질개량을 위하여 관련 업체와의 공동연구를 적극적으로 추진하고 있다. 이러한 phenotype-driven approach는 포유동물 세포에도 적용될 수 있다. 특정 단백질의 생산량을 증가시키거나, cell growth를 억제, 또는 촉진하는 zinc finger들을 분리하는 데 성공하였다. 또한, 특정 세포의 neuron으로의, 또는 myoblast의 osteoblast로의 분화를 유도하는 zinc finger들도 분리하였다. 이러한 결과들은 zinc finger로 이루어진 인공전사인자가 실질적으로 어떻게 응용될 수 있나를 보여주는 예로써, 올 10월 Nature biotechnology에 그 결과가 논문으로 발표되면서(Park et al. 2003) 학계, 산업계의 주목을 받고 있다. Phenotype-driven approach는 맞춤형으로 제작된 전사인자를 산업적으로 중요한 미생물에 도입하여 유용 형질을 개량하는 방법에 직접적으로 응용할 수 있다. 이는 툴젠의 국가지정연구실 과제의 목표의 하나로서 미생물 생명공학 분야에서 고부가가치의 2차 대사산물 생산수율을 높일 수 있는 중요한 수단으로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

셋째는 ZFP-driven approach이다. 한 ZFP를 293같은 특정 cell line에 형질 전환시켜 그 cell의 유전자 발현도를 microarray에 의해 조사해보면 적게는 몇 개에서 많게는 수백개까지의 유전자의 발현도가 ZFP의 도입에 의해 변화하는 것을 관찰할 수 있었다. 툴젠은 이 점을 이용하여, 백여개의 ZFP를 stable transfection한 cell line을 제조하여 microarray를 수행하였다. 이 결과를 툴젠에서 개발한 computer program을 이용하여 분석한 결과, 이미 기능적으로 연관이 있다고 알려진 유전자군이 함께 변화하는 것을 관찰할 수 있었다. 예를 들면 apoptosis에 관련된 유전자군이 함께 activation 또는 repression되는 것이 관찰되었다. 그런데 자세히 보면 이 때 A라는 아직 그 기능이 알려지지 않은 유전자도 같은 양상으로 변화하는 걸 관찰 할 수 있었다. 이러한 분석을 통해 A 유전자가 apoptosis에 관련있을 것이라는 추정을 할 수 있다. 수백개의 ZFP를 이러한 방법으로 인간 유전자 전부에 관해 조사해보면 유전자의 기능에 대한 중요한 단서를 얻을 수 있을 것이다. 또한 ZFP에 의한 유전자발현의 차이를 시간대로 분석하면 유전자의기능을 pathway 형식으로 분석할 수 있으리라고 생각한다. 이러한 결과는 이 분야의 최고 권위지인 Genome Research에 곧 게재될 예정이다. (Lee et al. 2003)

이러한 툴젠의 성과는 이미 세계적인 인정을 받고있다. 툴젠의 연구결과는 세계의 유수한 제약, 생물공학회사가 기술을 소개하는 Drug Discovery and Technology 2001학회 (DDT 2001)의 최우수 poster로 선정되었고, 2002년 DDT에는 세계 20개의 -up company의 하나로 up Showcase에 초청되어 연구결과를 발표하기도 했다. 이뿐 아니라, 2002년 6월 북경에서 열린 Science Innovation Summit에서 아시아에서 주목할만한 10개의 회사의 하나로 선정되기도 하였다. 또한 생명공학 분야의 최고학술지인 Nature Biotechnology에 2003년 3월과 10월에 잇따라 두 편의 논문을 발표하는, 벤처회사로는 드문 업적을 이룸으로써 그 기술력과 가치를 세계적으로 인정받았다. (Bae et al, 2003 & Park et al. 2003)

툴젠의 이러한 기술은 21세기 생명공학의 시대를 맞아 의료, 제약 분야는 물론 식품업, 농업, 임업, 수산업, 환경산업에 이르기까지 생명공학의 광범위한 분야에서 적용이 가능할 것으로 기대된다. 이처럼 여러 분야에서 이 기술을 활용하기 위해서는 제약회사, 생명공학회사들과의 전략적 제휴가 필요하며, 제휴 회사들에게 본사의 원천기술을 제공하고 이들과의 공동연구 및 제품개발을 통하여 수익을 창출할 계획이다. 장기적으로는 이 원천기술을 바탕으로 치료제를 개발하는 신약개발회사로 성장 발전한다는 계획을 가지고 있다.

4. 맺음말

툴젠은 이제 설립된 지 만 사년이 지난 회사로서 지금까지는 원천기술의 확보 및 이를 이용하는 적용기술의 개발에 집중하였다. 툴젠의 인공전사인자를 활용한 유전자 조절기술은 포스트게놈 시대에 새롭게 찾은 많은 유전자들의 기능분석에서부터 치료제의 개발까지 다양한 분야에 적용될 것이다. 향후에는 지금까지 이룩한 연구성과들을 바탕으로 국내외 기업과 활발한 기술제휴를 추진할 계획이며, 더 나아가 세계적인 생명공학회사로 성장 발전해 나갈 계획이다. 창의력을 바탕으로 사회를 변화시킨다는 툴젠의 Vision이 현실화되어 툴젠의 기술이 한국의 생명공학의 미래를 열어 가는데 중요한 역할을 하게 되길 기대한다.

5. 참고문헌

Bartsevich, V. V. and Juliano, R. L. (2000) Regulation of the MDR1 gene by tranional
repressors ed using peptide combinatorial libraries. Mol. Pharmacol. 58:1-10

Bae, K.-H., Kwon, Y. D. Shin, H.-C. et al. (2003) Human zinc fingers as building blocks in the
construction of artificial tranion factors. Nature Biotechnol. 21:275-280

Beerli, R. R. Dreier, B. and Barbas, C. F. 3rd (2000) Positive and negative regulation of
endogenous genes by designed tranion factors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:1495-1500

Desjarlais, J. R. and Berg, J. M. (1992) Redesigning the DNA-binding specificity of a zinc finger
protein: A data base-guided approach. Proteins Struct. Funct. Genet. 12: 101-104

Guan, X., Stege, J., Kim, M. et al. (2002) Heritable endogenous gene regulation in plants with
designed polydactyl zinc finger tranion factors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:13926-13301

Joung, J. K., Ramm, E. I. and Pabo, C. O. (2000) A bacterial two-hybrid ion system for
studying protein-DNA and protein-protein interactions. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:7382-7387

Kang, J. S. and Kim, J.-S. (2000) Zinc finger proteins as designer tranion factors.
J. Biol. Chem. 275:8742-8748

Kim, J.-S. and Pabo, C. O. (1997) Tranional repression by zinc finger peptides: exploring the
potential for applications in gene therapy. J. Biol. Chem. 272:29795-29800

Lee, D.-k. Park, J. W., Kim, Y.-J. et al. (2003) A large-scale, unbiased perturbation of the human
genome using artificial tranion factors. Genome Research In Press

Liu, P. Q., Reber, E. J., Zhang, L. et al. (2001) Regulation of an endogenous locus using a panel
of designed zinc finger proteins targeted to accessible chromatin regions. ACTIVATION OF VASCULAR
ENDOTHELIAL GROWTH FACTOR A. J Biol Chem. 276:11323-11334

Ordiz, M. I., Barbas, C. F. Beachy, R. N. (2002) Regulation of transgene expression in plants with
polydactyl zinc finger tranion factors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:13290-13295

Pavletich, N. P. and Pabo, C. O. (1991) Zinc-finger-DNA recognition: crystal structure of a Zif268-
DNA complex at 2.1 Å. Science 252:809-817

Park, K.-S., Lee, D.-k. Lee, H., et al (2003) Phenotypic alteration of eukaryotic cells using
randomized libraries of artificial tranion factors. Nature Biotechnology 21: 1208-1214

Reber, E. J. Huang, Y. Hickey, R. et al. (2002) Induction of angiogenesis in ㅁ mouse model using
engineered tranion factors. Nature medicine 8:1427 - 1432

Rebar, E. J. and Pabo, C. O. (1994) Zinc finger phage: affinity ion of fingers with new DNA-
binding specificities. Science 263:671-673