바이오인

 

---

1. 기술의 개요

□ 인간 게놈의 드래프트서열(draft sequence)이 종료되고 유전자산물인 단백질의 발현·기능해석의 중요성이 커지고 있다. 이 단백질과학을 강력하게 추진하는 신기술이 ‘단백질 칩 시스템’이다. 친화성 칩(affinity chip)과 독자적인 질량분석계를 조합한 이 시스템에서는 라벨(label)이나 태그(tag)를 사용하지 않고 소량의 생체시료에서 신속하게 단백질해석을 할 수 있다.  이미 임상진단분야에서 조기 암의 마커(marker)후보 탐색 등 많은 성과를 거두고 있는데, 여기서는 이들의 현상을 소개하고자 한다.

 

□ DNA의 염기서열을 결정하기 위한 장치인 DNA Sequencer와 유전자의 발현해석 장치인 DNA chip에 의해서 게놈 서열과 mRNA의 발현이라고 하는 게놈레벨에서의 유전자해석이 최근에 급속도로 진전되고 있다. 그러나 생명현상의 충분한 해명을 위해서는 유전자산물인 단백질의 발현 및 기능에 관한 연구가 불가결임을 알게 되었다. 생체 내에서 발현하고 있는
단백질을 망라해서 해석하는 연구를 프로테오믹스(Proteomics : 단백체학)라고 하며, 단백질의 발현과 동정, 상호작용해석, 기타 단백질의 기능해석 등의 폭넓은 단백질연구가 포함된다. 프로테오믹스가 중요시되는 것은 다음의 이유 때문이다.

○ 게놈해석에서는 유전자산물의 생체 내에서의 기능을 알 수 없다.

○ 게놈정보로부터 단백질의 발현량을 예측하기는 어렵다.

○ 또한 게놈정보로부터 단백질 상호작용을 예측하기도 어렵다.

 

□ 그런데 실제의 실험에 있어 단백질은 DNA와 달라서 증폭이 안 될 뿐 아니라 그 종류가 엄청나게 많고, 하나하나의 실험에는 전처리를 포함해서 많은 인력과 시간이 필요하다. 이런 번거로운 프로테오믹스 연구를 강력하게 추진할 목적으로 개발한 것이 단백질 칩 시스템이다.

 

---

２. 기술의 내용

 

○ 단백질 칩 시스템은 생체시료 중의 목적단백질을 포착하는 <단백질칩>과 포착한 목적단백질을 칩 위로부터 레이저의 힘으로 탈리·이온화해서 검지관에 도달하기까지의 비행시간을 측정하는 방식의 <질량분석계>로 구성되어 있다.  단백질 칩 시스템에서는 다음과 같은 해석을 수행할 수 있다.

- 단백질발현 프로파일잉(profiling)에 의한 바이오마커(biomarker) 탐색
- 단백질 상호작용, 번역 후 수식해석(飜譯後修飾解析) 등의 기능해석
- 단백질 정제조건 최적화 및 정제 시의 모니터링

 

○ 단백질 칩 시스템은 ‘크로마토그래피와 질량분석계를 융합한 시스템’ 이라고 할 수 있다. 단백질 칩에는 지름 약 2mm의 스폿(spot) 위에 단백질을 포착해서 분리하기 위한 관능기가 수식되어 있다.

○ 관능기의 종류에 따라 칩은 화학칩(chemical chip)과 생물칩(biological chip)의 두 타입으로 분류되며, 화학칩은 화학적 성질을 이용해서 단백질을 포착한다. 양·음 이온교환 칩, 역상 칩, 순상 칩, 금속고정화 칩 등의 종류가 있으며 발현해석과 정제·동정의 검토 등에 사용한다. 한편 생물학적 칩은 에폭시 또는 카보닐디이미다졸(carbonyl-di-imidazole)의 활성기를 가지고 있어서 항체와 수용체 등을 간단히 칩 위에 고정화해서 그들과 특이적으로 결합하는 상대를 찾는 상호작용해석에 사용된다.

○ 단백질 칩의 실험은

- 샘플의 첨가
- 칩에의 단백질의 결합
- 세정
- 매트릭스(matrix)의 첨가
- 질량분석계에 의한 측정의 공정으로 이루어지며, 비행시간 타입의 질량분석계(TOF MS: Time-OF-Flight Mass Spectrometer)로 측정함으로써 칩 위에 결합되어 있는 단백질의 정확한 분자량과 존재량에 관한 정보를 얻을 수 있다.

○ 여기서 중요한 것은 공정[칩에의 단백질의 결합]이다. 양이온교환 칩에 혈청샘플을 결합시킨 경우를 생각해 보자. 칩의 표면에 일어나고 있는 현상은 칼럼 크로마토그래피와 완전히 같다. 희석한 혈청의 pH가 4와 6의 경우에 포착된 단백질의 차이를 비교해 보자. 이 두 경우
전하를 갖는 단백질은 다르다. 알부민의 pI(isoelectric point)는 5.5로서, pH4에서는 양전하를 갖는 칩에 포착되기 때문에 관측되지만, pH6에서는 음전하를 띠기 때문에 세정 시에 계에서 제거되어 검출되지 않는다. 이때 표면에 포착된 각각의 단백질의 양이 많으면 그피크는 상대적으로 강하고 적으면 상대적으로 약하게 검출되므로 질량수 뿐 아니라 그 존재량의 정보도 얻어진다.

○ 통상적인 칼럼 크로마토그래피에서는 이동상(완충액조성)을 서서히 변화 시킴으로써 칼럼에서 차례로 단백질을 용출하여 크로마토그래프 담체에 포착된 상태의 단백질은 용출하지 않고 펄스레이저에 의하여 직접 탈리·이온화해서 검출하므로 다수의 단백질을 동시에 재현성 좋게 검출 할 수 있다. 이처럼 질량분석계에 표면과학의 기법을 도입한 이온화의 기술을 종래의 MALDI(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization)와 구별해서 SELDI (Surface Enhanced Laser Desorption Ionization) 또는 그 시스템을 SELDI-TOF-MS라고 부른다.

 

○ 단백질 칩은 처리량(throughput)과 재현성이 우수하기 때문에 수많은 발현해석에 이용된다. 혈청, 소변, 수액(髓液), 관절액, 젖샘 흡인액, 췌액(膵液) 등의 생체샘플과 세포파쇄액, 세포배양액 상청(上淸) 등 다양한 샘플을 써서 발현해석이 시행되고 있다. 분자량 1만 이하의 펩티드나 극단적인 pI값을 갖는 단백질 등 전기영동으로는 해석이 어려웠던 분자의 해석도 가능하다.

○ 특히 암 연구 분야에서는 현저한 성과가 나오기 시작했다. 일본에서도 국립 암 센터 연구소 Sasaki 등이 Cancer Research에 발표한 ‘췌장암세포가 특이적으로 분비하는 펩티드마커 후보의 탐색’, 암 연구소 연구회의 Yamori 등이 BBRC에 발표한 ‘대장암세포 특이적 단백질의 탐색’ 등 앞으로의 암의 조기진단에 희망을 갖게 하는 성과가 보고된 바 있다.

○ Yamori 등의 연구에서는 사람의 암세포 39주의 세포추출액 중의 단백질발현 프로파일을 조사하여 분자량이 12,000Da인 단백질이 대장암세포에만 특이적으로 고발현하고, 또 이것이 정상적인 대장점막세포에는 거의 존재하지 않는다는 사실을 알게 되었다.

○ 또 최근의 화제로는 에이즈 바이러스의 증식을 저해하는 인자의 발견·동정이 있다. Aaron Diamond AIDS Research Center의 Dr. Ho등은 에이즈 장기미발증자, 정상건강인, 발병자 각각의 CD8＋T세포를 자극해서 얻어진 배양상청의 단백질발현을 단백질 칩에 의해서 비교 하였다. 그 결과 에이즈 바이러스의 증식을 저해하는 인자로서 α-defensin-1,-2,-3을 동정했다. CD8＋T세포는 CD8이라는 종류의 당단 백질을 갖는 림프구세포인데 이 종류의 세포에서 에이즈 바이러스의 증식을 저해하는 인자가 분비되고 있는 사실이 16년 전부터 보고되었다. 앞으로의 에이즈 치료약개발에 길을 개척한 커다란 성과라고 할 수 있으나, 과거 16년간 아무도 찾지 못했던 분자량 34,000여Da의 defensin의 발견은 단백질 칩의 높은 능력을 증명했다. Defensin은 살균작용이 알려진 물질로서 29～34개의 아미노산으로 구성된 염기성 단백질이다.

 

○ 단백질 칩은 신속처리(high throughput)이기 때문에 많은 검체(檢體)를 이용한 단백질발현의 패턴해석에 적합하다. 질병의 진단이나 세균의 분류 등과 같이 표현형태가 다른 그룹을 판별하려 할 경우에는 단일의 마커로는 충분한 감도와 특이도가 얻어지지 않는 경우가 적지 않다. 복수의 마커를 조합한 패턴해석을 실시함으로써 이와 같은 문제를 해결할 수 있다. 이제까지의 실험계에서는 통계해석을 실시하는 데 충분한 수의 해석을 실시하는 것이 곤란했었으나, 단백질 칩의 출현에 의하여 처음으로 이와 같은 해석이 현실적인 것으로 되었다.

○ 이미 단백질 칩을 사용하여 유방암, 전립선암, 난소암 등에 대해서 복수의 마커를 조합한 진단에 관한 연구가 수행되어 모두 좋은 성적을 얻었다. Eastern Virginia Medical School의 Adam 등은 전립선암환자의 혈청을 패턴 해석함으로써 감도 83%, 특이도 97%로 암 환자
를 판별할 수 있었다고 보고하였다.

 

 

○ 단백질 칩 시스템에서는 결합한 물질의 분자량정보 뿐 아니라 존재량의 정보도 얻을 수 있다. 이 특징을 살려서 미지의 리간드 단백질 (ligand protein, 어떤 특정물질에 강하게 흡착되는 단백질)의 검색이나 다른 분자종이 존재하는 단백질의 정량 등을 할 수 있다.  이미 IL-8의 이소형(isoform, 기능은 거의 같으나 아미노산서열이 다른 단백질분자)과 아밀로이드 β단백질(amiloid β protein : Alzheimer병 환자의 뇌에서 보이는 이상구조물의 老人斑의 주성분)의 다른 위치에서 끊어진 각 단편 등을 정량하는 계가 구축되어 있고, 또 결합한 단백질을 소화효소로 부분 소화하고 남은 펩티드의 질량수로부터 결합 부위를 예측하는 것도 시도되고 있다.

 

 

○ 단백질 칩 시스템은 단백질발현, 상호작용 해석 뿐 아니라 인산화 등의 번역 후 수식해석, 단백질의 정제·동정, 단백질에의 인산의 부가를 해석하는 키나제 분석(kinase assay), 에피토프 매핑(epitope mapping), His-tag 단백질의 검출 등 폭넓은 목적에 쓰일 수 있다.  로봇을 이용한 자동화에도 대응할 수 있고 자동측정이 가능하여 여러 가지의 해석 프로그램이 장치되어 있기 때문에 비교적 간단히 조작할 수 있다.

 

○ His-tag 단백질은 히스티딘(histidine)을 tag로서 부가한 단백질인데 보통 6개의 연속된 히스티딘을 단백질에 부가한다. 대장균 등을 써서 대량으로 단백질을 발현시킬 때에 정제가 용이하게 된다.

○ Ni이온을 고정화한 칩은 His-tag에 친화성을 갖기 때문에 His-tag 단백질의 검출에 이용할 수 있다. On-chip에서 세균을 배양해서 His-tag 단백질의 생산량을 측정하는 계가 구축되어 있다.

○ 단백질 칩 시스템은 다른 MALDI-TOF 형의 질량분석계처럼 소화효소를 사용한 펩티드의 질량지문(Peptide Mass Fingerprinting)법에 의한 단백질의 동정에도 이용되고 있다. 또 단백질 칩 인터페이스를 설치한 탠덤 질량분석계(Tandem Mass Spectrometer)를 사용함으로써 마커후보인 펩티드를 서열해석에 의해서 동정하는 것과 상호작용한 단백질을 소화효소로 분해해서 직접 동정하는 것도 가능하다.

 

---

３. 결론

□ 단백질 칩을 사용함으로써 단백질발현과 상호작용해석을 비롯한 광범위한 영역에서 효율적인 연구를 수행할 수 있다는 것을 소개하였다. 또 발현 패턴의 해석 등 이제까지 어려웠던 연구가 단백질 칩에 의해서 가능해졌다는 것도 보였다. 단백질 칩은 연구자의 창의력에 의하여 새로이 많은 연구에 응용이 가능하다고 생각된다. 앞으로 단백질 칩이 단백질해석에 있어서 보다 큰 역할을 수행하는 기술이 되리라고 기대한다.

 

○ 2차원 전기영동으로 분리한 단백질의 해석은 주로 다음 순서로 실시한다.

- 환경변화에 따라 이동하는 단백질을 화상처리법 등을 이용해서 관찰한다.
- 단백질 spot를 잘라 겔 속에 특이적 protease로 소화하고 겔로부터 용출된 peptide 단편의 질량수를 질량분석으로 분석하여 데이터베이스에 접근한다.
- 경우에 따라 상기 펩티드 단편의 아미노산 서열을 MS/MS법 또는 PSD(Post Source Decay)법으로 결정한다.

이러한 순서로 진행하는 방법을 Peptide Mass Fingerprinting이라 부르며 이 방법으로 기자유전자와 단백질과의 대응관계를 추정할 수 있다. 그러나 실제로는 단백질의 기능을 해석하는 경우 다수의 단백질에서 발생한 번역 후 수식잔기를 결정하지 않으면 안 된다.

○ 전장과 자장을 이용한 고분해능 질량분석기로서 다양한 이온 source와 high energy collision을 이용한 탠덤 기법으로 단백질과 같은 생체고분자물질의 구조해석과 high resolution GCMS 등에 이용한다.

 

□ 앞으로의 과제○ 1990년대 후반부터 지금까지 다양한 생물의 게놈 염기서열을 결정하고 있으며 인간게놈의 전체 염기서열 결정도 완성되었다. 그러나 게놈 해석이 진행됨에 맞추어 그 기능을 추정할 수 있는 단백질은 의외로 적다. 따라서 포스트 게놈 연구로서 개개의 단백질 기능을 효율적으로 해석하는 방법의 개발이 시급하다. 범국가적인 정책적 연구지원 체제가 절실히 요청된다.