바이오인

 

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1. 기술의 개요

□ 생체가 갖는 방어반응의 하나인 면역작용은 외부로부터 이물질을 인식하는 항체분자가 중요한 역할을 하고 있다. 이 항체분자의 뛰어난 분자인식 기능을 이용함으로써 측정분석을 하는 것이 가능하다. 예를 들어바이오센서 기술을 이용한 여러 가지 면역센서가 개발되고 있다. 이와같은 면역센서의 개발 예와 최근의 바이오칩 기술을 이용하여 항체공학의 새로운 연구전개 방향을 설명한다.

□ 바이오센서는 생체분자가 갖는 분자인식기능에 착안해서 여기에 신호변환장치를 결합시켜 제작되며, 최근 전극, 반도체, 광디바이스, 압전소자 등의 신호변환 장치가 이용되고 있으며 면역센서에 있어서도 바이오센서와 마찬가지로 신호변환장치가 이용될 수 있다. 현재까지 개발된 면역센서의 사례에 대하여 소개한다.

○ 수정진동자는 고유의 정도 높은 발진주파수를 갖고 있으며 이 발진주파수가 수정의 표면상 질량에 따라 변화한다. 질량변화와 발진주파수의 변화 사이에는 발진주파수에 대해 매우 작은 주파수변화의 범위에서는 질량 변화에 비례하게 된다. 일반적으로 AT 커트의 수정진
동자의 기준주파수를 이용하는 경우 물질 1ng의 변화에 따라 주파수는 1Hz 변화한다. 이 원리에 근거한 면역센서가 개발되었는데, 항원 항체반응에 기초한 질량변화를 수정진동자를 사용하여 측정함으로써 면역 측정이 가능하게 된다.

○ 수정진동자는 간단히 만들 수 있고 소자의 크기도 수 mm 정도로 적은 측정도 용이하게 할 수 있으며 건조상태에서 주파수를 측정하는 경우가 흔하지만 조작은 번잡하고 연속측정에는 적당치 않다. 용액이 공존하는 상태에서도 유의(有意)한 주파수변화가 관측되면 연속시스
템의 구성도 용이하게 될 수 있다. 시약의 혼합, 시료의 주입, 세정액의 이송 등을 일관해서 이루어질 수 있는 흐름시스템을 만들었다.

○ 면역글로블린(Immunoglobulin G, IgG)과 특이적으로 결합하는 수용체로 알려져 있는 단백질 A를 고정화시킨 수정진동자를 이용하여 IgG의 농도를 측정할 수 있다. 또 단백질 A와 IgG의 친화력은 IgG의 아형에 따라 다르므로 pH가 다른 용출액에서 단백질 A-IgG 결합
체를 처리하며 차례로 측정함으로써 IgG의 아형 분석에 적용할 수 있다.

○ 병원성 미생물의 측정도 면역반응을 이용하여 할 수 있다. 캔디다증의 원인인 Candida albicans를 측정 대상으로 하였을 때 수정진동자를 r-AP-TES로 처리한 후 세척하고 발진주파수를 측정한 다음, Glutaraldehyde로 처리하며 캔디다균 항체를 고정화시켜 0.5N NaCl
로 세정한 후 C. albicans 용액에 30분간 침적하여 항원항체반응을 시도한 후 0.5N NaCl로 세정하면 발진주파수를 측정할 수 있다.

○ 효모의 일종인 Saccharamyces cerevisiae을 이용하여 같은 실험을 한결과, 미생물 농도 변화에 대한 주파수 변화는 인정되지 않았으며 항체 고정화 진동자는 C. albicans에서와 같이 선택적으로 반응한다는 것으로 알려졌다. 진동자 상에서 결합된 C. albicans를 핵염색제,
DAP1을 사용해서 형광현미경으로 관찰한 결과 진동자 상에서 결합된 미생물생균수와 주파수변화가 대응하고 있는 것이 확인되었다. 항캔디다균 항체를 고정화된 유액비드에 반응시킨 결과 주파수변화가 2배 정도로 증폭됨이 인정되며 이 방법은 대장균의 측정에도 응용될
수 있음을 나타내었다.

○ 미소전극(微小電極)을 이용한 시스템에 의해 면역반응을 신속하게 촉진할 수 있는 측정 기술을 개발하였다. 두개의 전극간에 항체를 고정시킨 미세비드의 현탁액을 분산시키고, 여기에 소정의 전압을 가함으로써 비드들의 응집반응을 촉진시켜 면역측정을 신속히 이루어지게
하는 것이다. 전장(電場)을 가함으로써 비드간에 유전(誘電) 인력이 작용하며 비드들이 서로 접촉하게 되며, 항체와 반응되는 항원이 존재하면 항원이 개재함으로써 비드들 상호간에 결합이 일어나게 된다.  비드를 응집시켜 전장에 의해 비드표면의 항체와 항원이 반응하며 비드들의 응집이 일어나게 하는 것이 가능하다. 감도의 향상과 측정 시간의 단축이 실현되는 미소전극은 미세가공 기술을 이용하여 어레이(array)형 면역칩으로 제작이 가능하다.

○ 모세전기영동법을 이용하여 항원과 항체의 반응물을 분리하며 또한 효소 표식항체를 이용하면 효소반응을 모니터함으로써 항원항체물의 양을 측량할 수 있다. 표식효소로서 alkaliphosphatase를 사용하여 형광기질을 사용한 분석으로 고감도의 항원항체반응의 양을 측정하는 것이 가능하며 따라서 미량으로 면역 분석이 가능하게 되었다.

○ 요즘 내분비교란물질의 인체 및 야생생물에 미치는 영향에 대한 염려가 높아지고 있으나 이에 관한 상세한 부분은 아직까지 미지의 부분이 많아 하루속히 해명이 요구되고 있다. 환경중에 존재하는 것으로 알려진 10만종이상의 화학물질을 평가하기 위하여 간이생물분석법의 개발이 기대되고 있다.

○ 난생(卵生)동물은 비트로게닌으로 불리우는 에스트로겐 자극에 의한 간장에서 이루어지는 난황단백질을 갖게 된다. 비트로게닌은 본래 수컷의 혈중에는 매우적은 미량밖에 존재하지 않으나, 에스트로겐이나 이와 같은 작용을 하는 물질에 노출시키면 비트로게닌의 혈중농도가
현저하게 상승되는 것이 알려져 있다. 따라서 본 단백질을 에스트로겐과 같은 작용을 하는 인공화학물질의 측정에 이용하려는 시도가 있었으며, 이에 송사리를 이용하여 에스트로겐 작용이 있는 인공화학 물질 측정을 위한 생물분석법이 개발되었다.

○ 송사리·비트로게닌에 대한 모노클로널 항체를 만들어 혈중 송사리·비트로게닌 농도 측정을 위한 ELISA 분석이 확립되었다. 이와같은 생물분석법의 유용성을 수컷 송사리의 에스트로겐 노출실험으로 검증한 결과 에스트로겐 작용이 있는 내분비교란물질을 고감도로 검출하게 되었다. 송사리는 사육이 용이하기 때문에 실험실내에서 재현성이 좋고, 내분비교란물질의 평가에 있어서도 좋은 생물분석법이 될 것으로 본다. 간단한 측정용으로 면역크로마토칩을 사용하여 환경호르몬 측정시스템을 개발하였는데 이 면역크로마토칩은 밴드(band)
의 수나 농담(濃?)에 의해 비트로게닌의 존재를 확인할 수 있다.

○ 다이옥신(dioxin)류 등의 환경오염물질에 의한 인체에 미치는 영향에 관심을 갖게 된다. 환경 또는 식품 중에서 화학물질의 오염피해를 방지하고 이에 대한 대책을 위해 간편한 정량기술의 개발이 요구된다.  생물에 대한 축적이 매우 심한 것으로 지적되고 있는 Coplanar
polychlorobiphenyl(Co-PCB)을 측정대상물질로 하여 생체인식소자에 항체를 사용하여 미세유로 형광면역칩을 개발하게 되었다.

 

○ 이 칩은 검량선 작성용 유로(流路)와 정량용 유로로 모두 11개 유로로 구성되어 있으며, 유로 구조는 길이 100 ㎛, 유로폭이 1,000 ㎛로 유로중에 직경 90 ㎛의 폴리스티렌 비드 표면에 3.3′, 4.4′-Tetra chlorobiphenyl(TeCB) 특이항체를 고정화시킨 비드가 배치 가능한 구조로 되어있다. 미세유로 형광면역칩이 유로중에 항체고정화 비드의 배치수를 바꾸어 배치수에 의한 검량 특성에 미치는 영향에 대해 평가하였다. 본 칩은 96well plate를 이용한 정량보다 고감도인데 그 이유는 비드를 정렬시킴으로써 미소 공간에서의 짧은 확산이동거리와 큰 비계면적이라고 하는 특징을 활용하기 때문이다.

○ 외부로부터의 이물을 인식하는 항체분자는 생체내의 B세포에 의해 합성된다. B세포는 대부분의 사람의 경우 10? 이상의 종류의 항체가 생산된다고 하는데, 1개의 B세포가 만드는 항체는 한 종류로서 이것을 모노클로널(단클론)항체라 한다. 일반적으로 항체생산 방법으로 항원을 동물에 주사, 자극하여 체내에서 만들어지는 항체를 입수하는 방법이 이용되고 있으나 복수의 B세포가 만들어지는 항체는 혼합물로서 얻어지기 때문에 폴리클로널(다클론)항체가 얻어지게 된다. 암세포나 특정의 바이러스를 측정 또는 진단하는 경우에는 인식이 좋은 모노클로널항체 쪽이 유리한 것으로 생각되고 있다.

○ 항원 자극 응답이 있었던 B세포에 있어 소정의 방법으로 회수하는 것도 가능하며, 회수된 B세포는 세포PCR에 의해 항원이식부위의 항체유전자 배열을 증폭하는 것도 가능하다. 이 유전자를 분석함으로써 항원 인식부위의 구조에 관한 데이터를 얻게 된다. 특정의 모노클로
널항체를 만드는 B세포의 증식으로 항체분자를 얻을 수 있고, 클로닝한 항체유전자를 단백합성계에 적용함으로써 소정의 모노클로널항체를 만들 수 있다.

□ 환경호르몬 중에는 여러 가지 화학물질이 알려지고 있는데 약 10만종이상 존재하고 있어 인체를 비롯하여 야생생물에 내분비교란물질로 작용하며 이에 대한 우려가 전세계적으로 문제시 되고 있다.

 

□ 따라서 환경호르몬에 대한 발생기전과 생체에 미치는 영향 등에 대한 조사 연구도 활발히 추진 검토되고 있으나, 많은 수의 화학 물질이 직간접적으로 생체에 작용하며 특히 미량으로도 영향을 미치기 때문에 검출 및 평가에 어려움이 따르게 된다.

□ 생체가 내분비교란물질로부터 방어하기 위한 방어기능 중에는 면역반응작용이 있어 외부로부터 침입된 이물질을 인식하여 이에 대한 항체를 생산하는 기능이 있으므로 이를 응용하여 항원항체반응에 의한 검출과 평가로 생체기능을 보호 및 예방하기 위한 검출연구가 활발히 진행되고 있으나 면역반응에 의한 검출은 한계가 있어 보다 진전된 검출이 요구되고 있다.

□ 요즘 환경호르몬에 대한 사회적인식이 비등하게 고조되고 있으며, 이는 내분비교란물질이 인체를 비롯하여 모든 생물에 미치는 영향에 대한 염려가 높아지고 있어 효율적으로 검출할 수 있는 방법이 필요하다.

□ 생체가 갖고 있는 방어기능 면역반응작용으로 외부로부터 침입된 이물질을 인식하여 항체를 생산하는 기능을 응용하여 항원 항체 반응에 의한 검출과 평가로서 위해로부터 사전 예방할 수 있는 기능도 필요하게 된다.

□ 이와 같은 면역기능을 이용하여 검출 및 평가 할 수 있는 방법으로 바이오센서 및 면역센서칩 등이 연구 개발되고 있으며, 그중에는 수정진동자를 이용한 면역센서, 펄스면역분석칩, 모세전기영동에 의한 효소면역분석, 면역크로마토칩을 이용한 환경호르몬 계측 및 미세유로 형광면역칩센서 등이 연구 개발되고 있다.

□ 환경호르몬 중 생체에 영향을 미치는 내분비교란물질 중에는 면역학적인 방법으로 검출할 수 있는 부분도 있지만, 그렇지 않은 부분도 적지않기 때문에 여러 가지 검출방법이 요구되고 있다.