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출처: Universitat Zurich

핵자기공명분광학을 이용한 단백질의 삼차원 구조결정 및 응용 연구 동향

신준 (연세대학교 생화학과 대학원 박사과정)

이원태( 연세대학교 이과대학 생화학과)

1. 기술의 개요

1). NMR을 이용한 단백질의 삼차원 구조 규명 방법

NMR(Nuclear Magnetic Resonance 핵자기공명분광학)은 단백질의 구조를 결정하는데 있어서 X-선 결정학 과 함께 필수적인 기법으로 최근 10년간 성공적인 결과들을 많이 도출해 내었다. NMR은 X-선 결정학과 같이 Å 단위의 고분 해능 삼차원 구조를 결정할 수 있으나, X-선 결정학에서 얻어지는 결정화된 상태에서의 단백질 구조와 달리 생체 조건과 유사한 수용액 상태에서의 단백질의 삼차원 구조를 결정할 수 있기 때문에 실제 생체 내에서 단백질이 가지고 있는 구조와 유사한 구조를 얻을 수 있으며, 따라서 단백질의 기능 규명의 관점에서 볼 때 X선 결정학에 비해 보다 유리한 측면을 가지고 있다.

이와 함께 X선 결정학으로는 관찰이 불가능한 수용액상 단백질의 backbone 및 side-chain의 동역학적 특성, 단백질의 풀림(unfolding) 및 접힘(folding) 과정을 실시간으로 관측할 수 있기 때문에 효소의 반응 기작, 단백질 접힘기작 규명, 단백질-단백질 혹은 단백질-핵산, 단백질-리간드간 상호작용 및 결합구조 규명과 아울러 이를 이용한 신약 screening 및 설계 등 다양한 응용분야를 가지고 있다. 또한 현재 계속 실험 기법 및 분석기법이 개발되고 있어 기존에 가지고 있던 규명 가능한 단백질의 크기한계가 극복되고 있으므로 앞으로 더욱더 응용분야가 더욱 넓어질 것으로 확실시된다.

일반적인 NMR 을 이용한 단백질의 삼차원 구조 결정 과정은 ①대상 시료제작, ②NMR 실험, ③결과분석 및 구조정보 추출, ④ 삼차원 구조계산의 네 단계로 이루어 진다.

①대상 시료 제작

실험에 필요한 단백질 시료의 제작은 주로 분자생물학적 방법을 이용하여 주로 대상 단백질의 유전자를 대장균에 삽입한 후 과발현 시킨 후 분리, 정제 하는 방법에 의해 얻어지며. 아미노산 30개 미만의 작은 펩타이드 같은 경우는 화학 합성하여 사용하기도 한다. NMR 을 이용하여 단백질 분자의 삼차원 구조를 규명하기 위해서는 단백질을 각 아미노산의 수소, 질소 및 탄소 원자의 자기장내에서의 공명주파수 지정(resonance assignment) 작업이 필요하다.

특히 탄소 및 질소원자핵의 공명 주파수 지정을 위해 대상 단백질을 NMR 에서 측정이 가능한 안정된 동위원소인 13C와 15N으로 표지 시킨 시료를 제작하여 NMR 실험에 사용한다. 경우에 따라서는 특정 아미노산에 대해 해당 아미노산 잔기만을 선택적으로 동위원소로 표지 한 시료를 사용하기도하며, 20KDa이상의 커다란 단백질 시료에 대해서는 보다 높은 감도의 NMR spectrum을 얻기 위해 수소원자핵을 중수소(2H)로 치환시킨 시료를 제작하기도 한다.

그림1. 단백질 시료의 3차원 NMR spectrum

②NMR 실험

하나의 단백질의 삼차원 구조를 결정하기 위해 수행되는 NMR 실험은 한 시료에 대해 여러 가지 NMR 실험이 사용되지만 크게 두 가지 형태의 실험으로 구분된다. 첫 번째는 단백질을 구성하는 각각의 수소, 질소 및 탄소 원자핵의 공명주파수 지정을 위한 실험이며, 두 번째는 구조 계산에 필요한 구조적 정보(structural constraints)를 얻기 위한 실험이다. 첫 번째 형태의 실험에는 수소원자의 공명주파수 지정을 위한 TOCSY(Total Correlation Spectros)나 COSY(Correlation Spectros) 형태의 실험들이 있으며, 15N/13C로 표지된 단백질 시료에 대해서는 HNCACB, HNCA 등과 같이 수소 및 탄소, 질소 원자핵을 동시에 관측할 수 있는 형태의 triple resonance 실험 등이 포함된다.

두 번째 삼차원 구조의 계산을 위한 구조적 정보를 얻기 위한 실험에는 수소원자간 거리정보 획득을 위한 NOESY(Nuclear Overhauser effect Spectros: NOESY-HSQC, HMQC-NOESY)등의 실험, 단백질의 backbone및 side-chain의 결합각도를 측정할 수 있는 실험 (DQF-COSY, HNHA), 단백질 backbone, side-chain 및 각 domain간의 삼차원적 배향을 결정할 수 있는 Residual Dipolar Coupling Constant(RDC) 측정 실험 등이 포함된다. 단백질의 크기에 따라서 20KDa이상의 단백질인 경우는 TROSY(transverse relaxation-optimized spectros)나 Deuterium Decoupling 실험기법 등을 적용하기도 한다.

③ 결과분석 및 구조정보 추출

실험을 통하여 얻어진 NMR data는 컴퓨터를 이용한 raw data인 과정은 FID(Free Induction Decay)에 대해 Fourier transformation이라는 수학적 처리를 함에 의해 얻어진다. 얻어진 spectrum을 이용하여 대상 단백질의 각각의 아미노산의 수소, 탄소 및 질소 원자핵에 대해 서열 특이적 공명주파수 지정(sequence specific resonance assignment)를 수행하여 단백질 아미노산 잔기에 대한 각 원자핵의 공명주파수 지정을 완료한 뒤 NOESY,DQF-COSY,HNHA등 구조적 정보를 담고 있는 spectrum을 분석하여 삼차원 구조 계산에 필요한 수소원자간 거리 및 결합각도에 대한 정보를 추출한다.

④ 삼차원 구조계산

얻어진 수소원자간 거리정보 및 결합각 정보 등을 이용하여 컴퓨터를 이용한 분자 동역학적 방법을 이용 하여 대상 단백질의 삼차원 구조를 계산하고 구조의 정확성을 점검한다.

그림2. 핵자기공명분광학을 이용해 결정된 human PTK6 SH2 domain의 20개 구조를 superimpose 한 그림

2) HTSD (High-Throughput Structure Determination)-NMR

위에서 언급한 NMR을 이용한 단백질 구조 결정 과정에서 구조 결정의 속도를 결정하는 요인은 4가지가 모두 될 수 있겠지만 특히 NMR 실험을 통한 data의 취득과 spectrum의 분석 단계가 가장 시간이 소요되는 단계라 할 수 있다. HTSD-NMR(High-Throughput Structure Determination NMR)은 핵자기 공명분광학을 이용하여 단백질 구조를 결정하는데 있어 혁신적인 실험기법과 고성능컴퓨터를 이용한 자동 분석법을 통해 기존의 방법보다 3-4배 빠른 속도로 용액상의 단백질 구조를 결정하는 새로운 개념의 구조결정 신기술이다.

(그림1) HTSD-NMR을 통한 고속 고효율의 단백질 구조 결정기술은 최근 post-genome project의 일환으로 추진되고 있는 구조 유전체학 (Structural genomics) 및 구조 단백질체학 (Structural proteomics) 연구에 있어서 중심적인 역할을 수행할 수 있는 핵심기술이다. 본 기술을 단백질 구조결정과정에 적용함으로 인해 수용액상에서 짧은 시간 내에 여러 개의 단백질의 구조를 결정하는 것이 가능하게 되어 단백질의 구조를 기반으로 한 단백질 공학, 신약 탐색 기술에도 적용되어 중요한 역할을 수행할 수 있다.

HTSD-NMR에서는 기존 방법론에서 문제시 되는 병목현상들을 해결하는데 있어서 최근에 개발된 최신의 NMR 실험기법들을 적용하여 빠른 시간 내 에 구조 결정에 필요한 다수의 NMR data를 확보하는 것과 확보된 NMR data를 처리하고 분석하는데 있어서 고성능 컴퓨터 및 Software를 이용하려 복잡하고 방대한 다차원 NMR 실험 data를 처리하는 것을 핵심으로 한다. 이와 아울러 실제적으로 단백질의 삼차원 구조를 결정하는 단계에 있어서도 NOE(Nuclear Overhauser Effect), Coupling constant 및 RDC data 추출과 계산 역시 자동화 함으로써 정확한 삼차원 구조를 빠른 시간 내에 결정하게 된다.

X선 결정학에 비해 NMR의 약점으로 지목되고 있던 결정 가능한 단백질 분자의 크기 제한문제도 하드웨어 의 끊임 없는 발달에 의한 800NHz-900MHz급 의 고성능 초전도 자석과 최근 개발된TROSY NMR 기법을 이용하여 분자량 100만대의 거대생체분자 입체구조 규명이 가능하게 됨에 따라 점차로 해소되고 있으며, 이와 함께 짧은 시간 내에 구조 결정에 필요한 NMR data를 다수 획득하기 위한 방법으로서도 최근 cryoprobe와 고감도 하드웨어와 함께 GFT-NMR등의 최신 기술이 속속 도입되고 있어 앞으로 NMR을 이용하여 규명된 단백질 분자의 삼차원 구조는 크게 급증할 것으로 예상된다.

그림 3. HTSD-NMR 의 개념도

2. 해외 연구동향

HTSD-NMR 기술과 관련된 해외 연구동향은 빠른 시간 내에 커다란 단백질의 구조 결정에 필요한 NMR실험 기법을 개발하는 group과 획득한 data의 처리, 분석 및 구조 결정을 자동화하는 software를 개발하는 두 가지 부류로 분류할 수 있으며 이와 아울러 이 방법을 High Throughput구조 규명에 응용하고 있는 여러 Structural Genomics Consortium 역시 HTSD-NMR 분야의 주요 연구 group이라 볼 수 있다.

우선 실험 기법을 개발하는 측면에서 NIH의 Ad Bax group, 캐나다 토론토 대학의 Lewis Kay group 및 미국 조지아 대학의 Prestegard group은 RDC를 측정하고 응용하는 기법을 개발하고 있으며, 구조결정 과정에서 NOE를 대체하거나 NOE를 보완하여 보다 정확한 구조를 얻는 방법을 탐색 중이다.

또한2002년도 노벨상 수상자이기도 한 스위스의 Wuethrich group은 이제까지 NMR로는 구조규명이 불가능할 것으로 여겨지던 40kDa이상의 단백질의 구조규명이 가능한 TROSY 실험기법을 개발했으며, 이로 인해 X선 결정학에 비해 단점으로 지적되던 구조 규명이 가능한 크기제한 문제가 크게 개선되었다. (그림2) 또한 가장 최근에 개발된 GFT-NMR실험기법은 High- Throughput 구조결정에 필수적인 다핵종 다차원 NMR data를 얻는 시간을 획기적으로 단축시킴으로써(1-2달에서 2-3일) 구조결정 속도를 크게 줄일 수 있을 것으로 예상된다.

실험을 통해 얻어진 NMR data의 분석과 구조계산의 자동화 기법은 Rutgers 대학의 Montelione group (AutoAssign,AutoStructure), 스위스 ETH의 Wuthrich group (GARANT,NOAH,0CANDID)/CYANA), 프랑스 파스퇴르 연구소의 Nilges group (ARIA/CNS) 등과 함께 그 외 몇 개 group에서 연구가 진행 중 이다. 프로그램이 만들어 내는 결과는 대체로 양호하여 많은 수의 연구결과들이 이 방법을 이용하고 있다. 그러나 초기 입력 데이터의 분석을 전적으로 사람 손에 의지하고 있어서 완벽한 자동화 및 정확도 개선을 위해서는 새로운 방법이 필요한 상태이다.

그림 4. TROSY 기법과 기존 기법과의 비교, 분자량 50kDa인 단백질의 1H-15N-HSQC spectrum비교한 것

A) TROSY type B) 기존 기법

그림 5. HTSD-NMR 기술로 결정된 Helicobacter pylori 1043 단백질의 삼차원 구조

3. 향후 전망

단백질은 생명현상의 근간이며 생명현상을 일으키고 조절한다. 따라서 단백질의 삼차원 구조를 생체조건에서 밝히는 일은 생명공학 산업에 있어서 가장 중요하고 기본이 된다 할 수 있다. 현재 단백질의 삼차구조를 직접적으로 이용하는 분야는 약물설계의 의약학 분야, 인공효소와 인공 항체 등을 개발하는 단백질 공학 등이 있다. 최근 human genome project가 완료된 후 세계 각국은 human genome project로부터 얻어진 유전자염기서열의 최종 산물인 단백질의 삼차원 구조를 규명하기 위한 post genome project인 structural genomics혹은 structural proteomics에 막대한 연구비를 투자하고 있다.

이렇게 생체분자 구조규명에 막대한 예산을 투입하는 이유는 유전자염기서열 정보를 활용하기 위해서는 유전자의 최종 산물인 단백질의 기능을 파악해야 하며 이를 이해서는 단백질의 삼차원 구조를 규명하고, 거기서 얻어진 정보를 바탕으로 신약 개발, 단백질 공학기술에 에 적용하는 것이 가장 효과적이기 때문이다. 따라서 Genomics 시대의 차세대 연구 방법으로는 HTSD-NMR은 필수적인 핵심기술이 될 것이며 그 응용분야 및 중요성은 시간이 지남에 따라 더욱 증대될 것으로 보인다.

참고 문헌

1. Protein NMR Spectros-Principles and Practice. Cavanagh et al (Academic Press, London, 1996)

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6. Ad Bax, Protein Sci. 2003 12 1-16

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