바이오인

식물 세포에서의 단백질 이동의 연구 및 이를 이용한 응용 가능성의 탐색

포항공대, 식물단백질 이동 연구단, 생명과학과

황인환

생명현상에 대한 궁금증은 인간 존재에 대한 가장 기본적인 물음의 하나이다. 20세기 중반을 거쳐 후반을 지나오면서 생명현상에 대한 이해의 폭이 상상하기 힘들 정도로 급속히 발전되었다. 20세기 후반 들어서 생명과학의 발달을 주도해오고 있는 분야가 바로 분자생물학이다. 이 분야는 유전자를 자유자재로 이용할 수 있는 recombinant technique을 바탕으로 무궁무진한 발전을 거듭하고 있다. 이미 E. coli나 yeast와 같은 생명체의 전체 genome의 DNA sequence가 다 밝혀졌으며 인간의 전체 genome의 염기서열이 2000년 말에 거의 다 밝혀질 정도로 발전을 거듭하고 있다 (Blattner et al., 1997; Goffeu et al., 1996). 이러한 발전으로 인하여 한 생명체내에 존재하는 거의 모든 유전자의 구조가 밝혀지고 있다. 그럼에도 불구하고 인간이 지금까지 가장 많이 연구한 생명체로 약 4,000-5,000개의 유전자로 구성된 단세포인 대장균마저도 아직 다 이해하지 못하는 것은 우리가 단순히 유전자 서열의 분석을 통한 단백질의 일차적인 구조를 밝히는 것으로서 이들 단백질의 기능을 다 밝혀주지 못하기 때문이다.

세포의 생명현상은 대부분 단백질의 activity를 통해서 나타나는데 이 단백질의 activity는 세포 내에서 다양한 방법으로 조절작용을 받고 있다. 고등생물체를 이루는 진핵세포가 원핵세포와 다른 가장 커다란 차이점은 하나의 세포가 세포막으로 둘러싸인 다양한 세포 소기관으로 나누어져 있으며 이들 사이에 유기적인 activity의 조절을 통하여 전체 세포의 활성을 조절한다는 것이다 (표 1). 따라서 이들 각 기관들이 기능을 수행하는데 필요한 organelle 단백질의 localization이 정상적인 세포의 activity를 위하여 필수적이다 (Rothman and Wieland, 1996). 이러한 세포의 compartmentation에 의한 조절기능의 중요성은 전체 단백질의 약 50%가 translation된 후에 membrane으로 둘러싸인 여러 세포 소기관으로 이동된다는 사실에서 쉽게 알 수 있다 (Schatz and Dobberstein, 1996; Schekman and Orci, 1996). 이들 세포 소기관으로 이동된 단백질들은 세포 소기관의 구성단백질로 이용되거나, 단백질의 activity를 조절하기 위한 목적으로 이동되게 된다. 또한 세포가 외부의 환경변화에 적응하기 위한 조절기작의 한 방법으로서 단백질들을 한 장소에서 다른 장소로 옮기게 된다 (Alb et al., 1996; Seaman et al., 1996).

따라서 protein trafficking과 그 기작을 이해하는 것은 생명현상의 가장 기본단위인 세포에서의 단백질 activity의 조절기작을 이해하는데 대단히 중요하다. 또한 이에 대한 정보는 고등생명체가 single cell인 수정란으로부터 기능이 다른 수많은 세포로 이루어진 multicellular mature organism으로 development하는 과정을 이해하는데 필수적이다.

표 1. 세포내·외의 단백질 targeting site

Membrane protein의 targeting mechasnism에 대한 연구는 Blobel 박사 연구팀 등의 연구에 의하여 최초로 그 기작이 밝혀지기 시작하였다 (Blobel and Dobberstein, 1975; Walter and Blobel, 1981). 이들의 연구결과에 따르면 membrane protein 또는 vesicle trafficking을 통하여 다른 세포 소기관으로 이동될 단백질들은 co-translational translocation이라는 방법을 통하여 ER로 보내지게 된다. ER에서 glycosylation에 의하여 modify된 후에 vesicle을 통하여 Golgi체로 이동하게 되며 다시 Golgi체에서 glycosylation modification 과정을 거치면서 vesicle에 실려서 목적지로 이동된다. 이러한 대략적인 단백질의 이동 경로는 1980년대 초에 어느 정도 확립이 되었다 (그림 1).

그림1. Trafficking pathways

단백질 trafficking 연구에 있어서 대단히 중요한 연구결과의 하나가 1980년에 Schekman 박사팀이 yeast에서 단백질의 secretion에 defect가 생긴 23개의 yeast sec mutant isolation이다 (Novick et al., 1980; Stevens et al., 1982). 이들 mutant를 연구함으로서 intracellular trafficking에 defect가 일어날 때 yeast에 미치는 영향을 연구할 수 있었다. 또한 궁극적으로 이들 mutation된 유전자들을 cloning함으로서 intracellular trafficking에 관여하는 유전자를 cloning하여 분자생물학 level에서 이 과정에 대한 연구를 수행할 수 있는 기틀이 마련되었다. 이들 yeast의 유전자를 바탕으로, 또는 yeast mutant를 이용하여 동물세포나 식물세포에서 trafficking 에 관여하는 많은 유전자들이 cloning되었으며 계속 이러한 연구가 진행되고 있다 (Perin et al., 1991; Stack et al., 1995; Bassham et al., 1995). 특히 Scheller박사 연구팀에서 yeast의 sec mutant를 이용하여 동물세포의 많은 sec homolog들을 cloning하였으며, 식물세포에서는 Raikhal 박사연구팀에 의하여 sec homolog들이 많이 cloning되었다.

단백질들이 이동될 때의 가장 큰 문제는 이동되는 단백질들이 어떻게 정확하게 target site로 이동하게 되는가 하는 것이다. 즉 이동될 단백질과 target site의 specificity 결정이다. 이에 대한 해결책으로 세포내 단백질 이동 연구 분야의 세계적인 선두그룹을 이끌고 있는 Rothman 박사에 의하여 SNARE hypothesis가 제안되었다. 또한 Rab 계통의 small GTP-binding protein들이 vesicle의 형성과 fusion의 timing을 결정하는 단백질이라는 것이 밝혀졌다. 이러한 연구결과는 세포내의 다양한 세포내기관들 사이에서의 vesicle trafficking이 어떻게 조절될 것인가에 대한 하나의 결정적인 해답을 제시해 주는 것이었다. 이외의 많은 그룹에서 vesicle 형성과 fusion의 specificity를 결정하는 단백질들에 대하여 계속하여 연구하고 있다 (Sollner et al., 1993; Rothman and Warren,1994).

단백질의 이동기작을 밝히는데 있어서 새로운 측면의 전기를 마련한 연구그룹으로는 미국의 Vallee 박사 그룹을 들 수가 있다. Vallee group은 1990년에 처음으로 dynamin을 cloning함으로서 vesicle 형성과정을 이해하는데 돌파구를 마련하였다. 그 이후로 Vallee 그룹과 다른 많은 그룹에 의하여 dynamin과 dynamin-related 단백질들이 endocytosis와 exocytosis 과정에서 vesicle 형성에 관여한다는 것이 밝혀졌다. 또한 이들 단백질이 신호전달에 관여하는 다양한 regulatory 단백질들과 interaction 하는 것이 밝혀지면서 intracellular trafficking이 signal transduction 과정에 의하여 조절될 것이라는 가설의 근거를 제공하였다. 이후로 많은 연구그룹에 의하여 이 단백질 및 이와 유사한 단백질들을 coding하는 유전자들이 cloning 되었으며, 이들의 생화학적 특성과 vesicle trafficking에서의 역할에 대하여 활발한 연구가 진행되고 있다 (Obar et al., 1990).

다른 organism에서와 마찬가지로 식물에서도 단백질의 이동에 대하여 많은 연구가 수행되었다. 식물에서의 단백질 이동과정은 많은 부분에서 동물 세포나 yeast와 대단히 유사할 것으로 사료된다. 하지만 세포질에서 엽록체로의 단백질 이동은 식물세포에서의 특이적인 현상이며 약 3000에서 4000 종의 단백질이 엽록체로 이동할 것으로 생각되고 있으며, 또한 storage vacuole와 같은 동물이나 yeast 세포에 존재하지 않는 소기관들로의 단백질의 이동 역시 식물세포 특이적이라 할 수 있다. 식물 세포에서의 단백질 이동연구에 있어서 가장 많은 연구가 수행된 대상은 단연 세포질로부터 chloroplast로 단백질이 import되는 기작에 관한 것이었으며 주로 in vitro import 실험기법을 이용하여 많은 연구가 행하여졌다. 이들 연구결과를 통하여 soluble precursor가 transit peptide를 인식하는 receptor에 의하여 import된다는 것이 증명되었으며, 1994년 Schnell 박사 연구팀이 chloroplast membrane에 존재하는 receptor complex의 유전자들을 cloning함으로서 import기작을 밝히는데 결정적인 전기가 마련되었다. 이 연구팀과 다른 여러 연구팀에서 계속하여 이들 단백질들의 역할에 관하여 연구를 수행하고 있다 (Van den Broeck et al., 1985; Smeekens et al., 1986). 또 다른 하나의 중요한 연구 대상은 식물의 씨에서의 저장 단백질의 저장에 관여하는 trafficking 기작의 연구였다.

본 연구팀에서는 애기장대 (Arabidopsis) (그림 2)를 model system으로 하여 intracellular trafficking의 기작을 밝히고, 이를 통하여 intracellular trafficking이 chloroplast와 같은 여러 가지 세포 소기관의 형성과 그들의 역할에 대하여 연구하고 있다. 이러한 측면의 연구를 위하여 네 개의 기본목표를 설정하고 연구를 수행하고자 한다. 이들은 첫째로 식물세포에서의 intracellular trafficking의 기작 규명, 둘째로 intracellular trafficking의 cellular organelle development에서의 역할 규명, 셋째로 intracellular trafficking의 식물의 발달과정에서의 역할을 규명, 넷째로 이를 바탕으로 식물세포를 유용한 단백질 대량 생산을 위한 bioreactor (green factory)로서의 이용 가능성 탐색 등이다.

그림 2. Arabidopsis (애기장대)

위에 제시된 연구를 수행하기 위한 가장 기본적인 연구기법의 하나로 세포 소기관에 targeting되는 단백질의 이동경로를 보여주는 reporter system의 구축이다. 이러한 reporter system으로는 in vivo에서 아무런 조작 없이 형광을 발생하는 reporter protein으로 최근에 다양한 system에서 이용되는 green fluorescent protein (GFP) 또는 red fluorescent protein (RFP)를 사용하고 있다. 이 형광 단백질에 각 organelle로 targeting되는데 필요한 signal sequence를 fusion하여 reporter 단백질로 만들었다 (그림 3).

그림 3. 다양한 reporter proteins

위의 reporter system을 이용하여 본 연구실에서는 다양한 trafficking step에서의 vesicle trafficking 과정에 어떠한 단백질들이 관여하며 이들 단백질들이 어떻게 trafficking 과정을 수행하는지 정확한 기작을 밝히고자 연구하고 있다. 예를 들면 ER에서 Golgi체로 이동하는 과정에 있어서 Arf 및 Arf GAP의 역할을 규명하는 중이며 (Lee et al., 2002), Golgi체에서 central vacuole로 이동하는 과정에 dynamin-like 6(ADL6)와 이와 interaction하는 단백질인 Seh1h 및 actin의 역할을 규명하는 중이다.

ADL6는 Golgi체에서 단백질을 이동하는데 관여하는 vesicle 형성에 중요한 역할을 하며 (Kim et al., 2001) 이 과정이 Seh1h에 의하여 조절될 것으로 생각된다. 이 과정에 actin이 또한 중요한 역할을 할 것으로 생각된다. Actin polymerization inhibitor인 latrunculin B를 처리하면 vacouole로 이동하는 cargo들이 Golgi체에서 머문다는 것을 확인하였으며 이 때 vesicle 형성에 중요한 clathrin이 TGN에 축적된다는 것을 확인하였다. Golgi체에서 prevacuolar compartment를 거쳐서 central vacuole로 단 백질이 이동하는 과정에 관여하는 small GTP-binding protein인 Rha1의 역할 (Sohn et al. 2003)과 이 Rha1이 interaction하는 PRA1의 역할을 연구하고 있다. 또한 식물 특이적인 organelle인 protein storage vacuole에 단백질이 ER 에서 직접적으로 Golgi체를 거치지 않고 이동하는 과정을 규명하는 중이며 특히 TIP와 같은 단백질이 이러 한 경로를 택한다는 것을 밝혔으며 또한 종래에 seed cell에서만 존재한다고 알려진 protein storage vacuole이 vegitative tissue인 잎 세포에서도 마찬가지로 존재한다는 것을 밝혔다. 흥미롭게도 이 protein storage vacuole에는 단백질이 서로 다른 두 경로(Golgi-dpendent and Golgi-independnent pathways)를 통하여 단백질이 전달된다는 것을 증명하였으며, Sar와 같은 단백질은 이 두 경로에 모두 관여한다는 증거를 확보하고 이를 계속해서 연구 중이다.

Vesicle trafficking에는 단백질들 뿐만 아니라 lipid들도 대단히 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 하지만 아직 이들 역할에 대한 이해는 많이 부족하다. 본 연구단에서는 이들의 역할을 규명하고 있으며 PtdIns3P가 trans-Golgi network (TGN)에서 생성되어 vesicle trafficking 과정을 통하여 central vacuole에서 degradation된다는 것을 밝혔다 (Kim et al., 2001). 이 과정에 PtdIns3P가 ADL6를 TGN으로 recruit하는데 중요한 역할을 할 것이라는 것을 증명하였다 (Lee et al., 2002). 반면에 유사한 단백질인 ADL2가 PtdIns4,5P₂에 binding 하는 domain을 가졌다는 것을 실험적으로 보였다 (Kim et al., 2002). 계속하여 이들 lipid들이 세포내에 서 어떻게 trafficking과정에 관여하는지를 연구하고 있다 (그림 4).

그림 4. TGN으로부터 central vacuole로의 trafficking 과정에 관여하는 다양한 단백질들

동물세포나 yeast 세포에서 관찰할 수 없는 가장 대표적인 단백질 targeting과정이 cytosol에서 chloroplast로 targeting 되는 과정이다. 특히 흥미로운 것은 세포질에서 어떻게 chloroplast envelope membrane으로 단백질들이 이동하는가 하는 것이다. 단백질들이 ER membrnae을 포함하는 endomembrane system으로부터 chloroplast envelope membrane을 어떻게 구별하는가 하는 것이다. 흥미롭게도 transmembrane domain바로 다음 부위에 lycine rich flanking region이라 명명된 부위가 SRP의 binding을 저해함으로 인하여 이들 transmembrane domain을 갖는 chloroplast envelope membrane protein들이 ER로 targeting되지 않고 cytosol에서 translation되며, 또한 cytosol에서 chloroplast envelope membrane으로 targeting에 어떤 protein factor가 관여할 것으로 생각된다 (Lee et al., 2001). 아마도 이 protein factor가 anykryin repeat을 가진 AKR2일 것이라는 증거를 가지고 있으며 이의 가능성을 계속 연구하고 있다. 또한 단백질이 엽록체 속으로 import 될 때에 toc159라는 단백질이 중요한 역할을 한다고 생각되며 이 toc159라는 receptor molecule이 어떻게 receptor로서 역할을 수행하는지에 관하여 집중적으로 연구를 수행하고 있다.

이러한 연구를 통하여 본 연구실에서는 세포가 어떻게 구성되어져 있으며 이들 각 부분들이 어떠한 방법으로 조절되고 상호 communication하고 있는지, 또한 어떻게 이들 각 부분들이 생성되고 있는지를 규명하고자 한다. 궁극적으로는 이러한 연구를 통하여 수많은 단백질로 구성된 세포가 어떻게 하나의 세포로서 활성을 나타낼 수 있는가 하는 측면, 즉 세포의 운영체계를 규명할 수 있을 것으로 생각된다. 또한 세포의 운영체계를 이해하면 이를 응용하여 목적에 맞는 새로운 세포를 design할 수도 있을 것으로 생각한다. 이렇게 인공적으로 만들어진 artificial 세포를 이용하여 의약품을 포함한 다양한 화학물질이나 의료용이나 산업적으로 사용될 단백질들을 대량으로 생산할 수 있을 것이다. 아마도 멀지 않은 장래에 이러한 일들이 실현 가능할 것이다.

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