바이오인

출처 : biozine

DNA를 사용한 전기화학적 바이오센서

심윤보 / 부산대학교 자연대 화학과

(ymshim@pusan.ac.kr)

1. DNA 바이오 센서 
 

인간 게놈 계획하에 진행된 혈액, 혈장, 세포, 체액 등과 같은 생체시료에 존재하는 특정 염기서열의 검출은 특히 질병 진단 및 보건 의료 분야에 혁신적인 발전을 갖고올 것으로 기대되어 진다. 일 예로 질병 관련 특정 염기서열을 검출하여 유전병이나 박 테리아와 바이러스에 의해 유발되는 질병의 진단을 위한 센서의 개발에 이용하는 경우를 들 수 있다. DNA sensor는 이러한 특정 서열 을 검출하는것 이외에도 DNA의 구조적 특징을 이용하여 방향족 아민류와 같은 독성물질 검출이나 다른 유기물들의 검출과 연구 (hydrazines, carboplatin, nitroimidazoles, proteins)에도 이용되고 있다. 본 고에서는 혼성화 검출법 (hybridization detection)을 사용한 바이오 센서에 대해 전기화학적 방법을 사용한 방법을 중심으로 간략히 기술하고자 한다.

DNA sequence의 검출을 위한 많은 연구들의 결과로 오늘날에는 소형화 장치에서 사용될 수 있을 만큼 다양한 기술 들이 개발 되었다. 최근들어 sequence-ive DNA 바이오 센서에 대한 많은 논문들이 발표되었으며 이들 바이오센서는 DNA prob와 target DNA의 혼성이 일어났을 때 이것을 측정 가능한 신호로 바꾸어 주는 transducer로 구성되어있다. DNA probe와 target DNA 의 hybridization정도를 측정하는 방법으로는 분광학적방법과 전기화학적인 방법이 가장 많이 사용되고 있다. 분광학적인 방법은 labeled target DNA를 이용하여 혼성화 후 이것을 검출하는 방법이다. 분광학적인 방법은 감도가 높고 정량적이기 는 하지만, 고가의 장비와 많은 시간소비, 시료의 전처리, 및 장비를 휴대할 수 없다는 단점들 때문에 상당수의 연구자들이 소형화 가 용이한 전기화학적인 방법에 대해 많은 관심을 갖고 있다. 뿐만 아니라, 최근 센서의 소형화와 휴대용 센서 제작을 위해 전기화 학적인 방법에 초점을 두고있다. 그러나 이러한 기술들은 측정에 있어서 많은 시간이 소모되고, 실험에 있어서 많은 과정들이 필요 하다는 결정적인 약점이 있다. 반면, 전기화학적 활성 biosensor들은 빠른 감응시간을 보인다. 이를 사용한 전기화학적인 센서는 이중가 닥 DNA의 염기쌍과 금속킬레이트(metal chelate)의 interaction을 이용한 것으로 차무산화 전위의 변위 또는 축전전류의 변화를 측정하여 혼성화를 검출한다. 최근 본 연구실에서는 전기전도성 고분자막에 probe DNA를 고정시킨 후 혼성화 전후의 복합저항 (impedance)의 차이로부터 혼성화 검출을 하는 방법을 개발한 바 있다. 이 방법은 기존의 전기화학적 검출법에서 사용되는 지 시약 첨가 또는 형광 검출법에 사용되는 lableing과정 없이 직접 혼성화 정도를 검출할 수 있었으며 이를 사용한 의료용 진단 센 서에 대한 연구를 진행 중에 있다.

2. 혼성화 검출을 이용하는 바이오 센서

DNA 혼성화는 서로 상보되는 DNA 염기쌍(A-T, C-G)들 사이의 강한 상호작용에 기초를 두고 있다. 그러므로 immobilized single-stranded (ss) DNA 분자(“probe”)를 용액 속의 상보되는(“target”) strand와 혼성화시키는 것이다. 이러한 혼성화 정도를 신호로 나타내기 위해 분광학적 방법과 전기화학적인 방법들이 사용되어져 왔다. Table1에 지금까지 보고된 DNA 바이오 센서에서 혼성화를 검출하는 몇 가지 방법들을 정리하였으며, 이 중 몇 가지에 대해 간략히 기술하면 다음과 같다.

[Table1. survey of reported DNA biosensors]

2-1. Physical method (QCM): Okahata et al. (J.Am. Chem. Soc. 1992, 114, 8299-8300)은 gold evaporated quartz crystal microbalance (QCM)를 oligonucleotide로 변성시켜 혼성화 반응을 관찰하였다. QCM은 불균일 혼합물에서 질량의 변화로부터 진동수가 감소하 기 때문에 특정 DNA 염기 서열를 검출할 수 있다. 그러나 이것은 10-9 g 이하의 질량변화는 관찰하기 어렵다.

2-2. Spectroscopic method (Fluorescence/Raman): 고정되어 있는 프로브 DNA에 형광물질 (염료)로 표지된 타겟 DNA (또는 올리고뉴클레오티드)를 혼 성화시켜 광학적인 방법으로 형광물질의 세기를 측정하는 방법이 보고되어 있다[Physicochemical and Engineering Aspects, 2000, 175, 147-152; Analytica Acta, 1997, 350, 51-58; Anal. Chem. 1994, 66, 3379-3383].Vo-Dinh et al. (Anal. Chem. 1994, 66, 3379-3383) 은 Raman spectrometry을 사용할 경우 특정 DNA에 대한 높은 선택성과 감도를 갖는다 고 보고하였다. 이 실험에서는 target DNA 조각을 부착시킨 Nitrocellulose에 SER-Gene probe (SERS active label ; cresy fast violet dye)를 혼성화시켜 분광학적인 방법으로 SER-Gene probe에 대해 측정하 는 것이다.

2-3. Electrochemical Method (Voltammetry/chronopotentiometry/impedance): 전기화학적인 방법에서는 주로voltammetry 또는 potentiometry를 이용하여 dsDNA에 대해서 선택적 으로 작용하는 전기화학적으로 활성인 지시약(indicator)이 사용되었으며, 일부 자체 산화환원 파를 갖는 전도성 고분자를 이용하여 자체 파의 전류밀도 감소나 전위 변화를 측정하는 방법도 보고된 바 있다. 이 방법에서 사용되는 대표적 인 지시약으로 tris(1,10-phenanthroline)cobalt complex [Co(phen)33+]와 tris(2,2-bipyridine)cobalt complex [Co(bpy)33+] 이 사용되고 있으며, 그외 Hoechst 33258, ferrocene complex등이 있으며, hybridization 후 이들 지시약들의 산화 환원 파의 전류크기의 변화를 측정하거나, 파의 전위 변화를 관찰한다. 최근 에는 probe 전극의 복합저항(impedance)의 측정을 통해 혼성화를 검출한 방법이 보고된 바 있다. 이에 대해서는 다음 절에서 보다 자세히 기 술될 것이다.

3. 전기화학적 혼성화 검출 실험법 (원리 및 과정)

DNA sequence detection biosensor는 대부분 혼성화 검출을 기본원리로 하고있으며, 실험과정은 probe immobilization, hybridization, indicator binding, detection(signal transducer)의 4 단계로 나누어 진다. 그 중에서 probe immobilization과 detection과정은 DNA sequence detection biosensor에서 가장 중요한 단계로 이 부분에 대한 연구가 최근 가장 많은 관심을 모으고 있 다.

1) Probe immobilization

Probe immobilization은 target DNA에 대한 ss DNA probe를 substrate(nitrocellulose, carbon, or gold electrode, etc)에 고정시키는 것을 말한다. 이 단계는 센서의 재현성과 수명을 좌우하기 때문에 매우 중요하다. 현재까지 알려진 probe고정 방법은 1) adsorption (일정전위를 가함): (Wang et al.(Anal. Chem. 1996, 68, 2629/ Electroanalysis 1997, 9, No.5, 395 ), Marrazza et al. (Biosensors & Bioelectronics 1999, 14, 43-51)) 2) covalent bond (작용기로 octadecylamine, stearic acid, conductive polymer modified substrate를 사용하는 방법): Millan and Mikkelsen (Anal. Chem. 1993, 65, 2317 / Anal. Chem. 1994, 66, 2943), Garnier (J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 7388), Shim (Anal. Chem. 2001, 73, 5629-5632), 3) avidin-biotin system: Marrazza et al. (Biosensors & Bioelectronics 1999, 14, 43-51), Dicesare et al. (Bio Techniques 1993, 15, 152), Olson et al. (Mol. Cell. Probes 1991, 5, 351), 4) Thiol chemisorption Hashimoto et al. (Anal. Chem. 1994, 66, 3830-3833), Okahata et al. (J.Am. Chem. Soc. 1992, 114, 8299-8300), Johansson et al. (Electroanalysis 1999, 11, No.3, 156) 등의 방법들이 있다. 다음 그림1 은 전기전도성 고분자의 표면에 probe DNA를 공유결합 을 통해 고정시키는 일 예를 보여주고 있다.

Figure 1. Immobilization of the probe oligonucleotide and hybridization for a target sequence.

2) Hybridization

Hybridization은 single-stranded DNA probe가 자신과 상보되는 다른 target DNA와 반응하여 이중나선 구조의dsDNA 를 형성하는 것을 말한다. DNA sequence detection biosensor는 모두 실험과정에서 hybridization이 일어난다.

3) Indicator binding

전기화학적인 방법을 사용하여 혼성화의 정도를 알아보기 위해서는 전기화학적으로 활성인 indicator를 사용하는데, 이 물질은 이중가닥의 DNA에 대해서 선택적으로 반응해야 한다. 현재 알려진 indicator로는 tris(1,10-phenanthroline)cobalt complex [Co(phen)33+]와 tris(2,2-bipyridine)cobalt complex [Co(bpy)33+] 이 사용되고 있으며, 그외 Hoechst 33258, ferrocene complex등이 이용되고 있다. 이러한 indicator는 DNA이중가닥으로 형성된 minor groove나 DNA 염기쌍의 층 사이에 선택적으로 결합하게 된다. 전도 성 고분자를 이용한 경우는 앞에서 설명한 polypyrrole에 oligonucleotide probe를 결합시킨 Garnier 의 경우와 California Institute of Technology의 화학자 Thomas J. Meade와 Clinical Micro Sensor (CMS)회사에 의해 개발된 CMS system인 지시약을 포함한 DNA probe를 phenylacetylene monomer “wire”에 결합시킨 경우가 있다. CMS system에서는 전도성분자를 alkane thiol molecular와 함께 self- assemble시켜 insulating 시킨 후 지시약을 포함하는 DNA probe를 전도성 고분자에 결합시켜 지시약 결합 과정 을 줄여 측정을 간편하게 하였다. 이 경우 alkane thiol이 전극표면에 대해 보호막으로 작용하여 혈액시료 중의 다른 불순물 들에 대한 문제점도 개선시켰다.

4) Detection (signal transducer)

1) Bard et al. (J. Am. Chem. Soc. 1987, 109, 7528) 는 DNA 와 metalointercalator (tris(1,10-phenanthroline)cobalt complex [Co(phen)33+] 및 tris(2,2-bipyridine)cobalt complex [Co(bpy)33+] )와의 상호작용에 대한 voltammetry사용 가능성을 처음으로 보고하였다.

2) Millan and Mikkelsen (Anal. Chem. 1993, 65, 2317-2323 / Anal. Chem. 1994, 66, 2943-2948)은 oligonucleotide-변성 유리질 탄소전극을 이용한 염기서열의 선택적 검출법를 보고하 였다. 이것은 표지를 사용한 probe (labeled probe) 대신 전기활성종인 혼성화 지시약으로 Co(byp)33+를 사용하 였다.

3) Hashimoto et al. (Anal. Chem. 1994, 66, 3830-3833)는 DNA probe(oncogene v-myc region)의 5-phosphate end를 mercaptohexyl group으로 치환하여 금전극에 화학흡착시킨후 Hoechst 33258을 이용하여 voltammetry로 혼성화를 측정하였다. Hoechst 33258는 DNA minor groove에 결합하는 전기화학적으로 활성인 염료이다.

4) Wang et al. (Anal. Chem. 1996, 68, 2629-2634 / Electroanalysis 1997, 9, No.5, 395 )은 탄소반죽전극 (CPE)과 screen-printed electrode (SPE)를 이용하여 전극표면을 산화 시켜 일정전위에서 특정 DNA probe를 흡착시킨 후, target DNA와 혼성화 하였다. 이때 혼성화 의 검출은 [Co(phen)33+]의 산화 파를 chronopotentiometry로 측정하였다.

5) Garnier (J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 7388)는 oligonucleotide probe를 전기화학적으로 활성인 polypyrrole에 결합시킨 바이오 센서를 소개하였다. polypyrrole에 붙어있는 oligonucleotide가 용액 속에서 이것과 상대되는 target oligonucleotide 와 혼성화가 일어나게 되면 polyprrole의 전기화학적 감응에 크다란 변화를 주게 되고, 이것으로부터 혼성화 인지과정에 대한 전기적인 감응의 정도를 측정할 수 있게 된다. Target oligonucleotide의 농도가 높아짐에 따라서 polypyrrole자체의 산화 환원 파의 전류 밀도가 감소하며, 산화 파의 전위가 positive potential로 shift하는 것을 관 찰하였다.

6) Shim (Anal. Chem. 2001, 73, 5629-5632)은 carboxylated polyterthiophene에 겸상적혈구 빈혈증 환자의 염기서열을 갖는 probe DNA(19-mer)를 공유 결합으로 고정시킨 후 지시약의 첨가 없이 복합저항의 측정으로 혼성화 검출 정도를 현재까지 구분이 힘들었던 한 개의 염기만 달라도 구분을 해 낼 수 있는 방법을 개발하였다. 종래의 기술과 는 달리 지시약을 사용하지 않고 임피던스를 이용하여 DNA 혼성화를 검출하는 신규의 방법이 제공되므로, 고정된 특정 주파수에서 임피던스를 측정하는 소형 센서 시스템의 제작이 가능하며, 이는 임상진단을 위한 휴대용 DNA 서열 혼성화 확인용 소형 센서에 응 용될 수 있다. 이 연구에 따르면, 잘못 짝지어진 서열에 대한 상보적 서열의 선택성이 매우 우수하다. 참고로 이 연구의 결과를 그 림 2와 표 2에 각각 나타내었다.

Figure 2. The plots of (A) impedance and (B) admittance before and after hybridization in a phosphate buffer solution on a open circuit voltage at the room temperature.

Table 2. Hybridization amounts at 25℃ between the probe-immobilized electrode and various 19-mer target oligonucleotidesa in a solution at 1 kHz

aConcentration : 110 nmol in 10 mL. bIndicates how much of the oligonucleotide in the solution bound to the probe on the modified electrode.

4. 유전병과 관계된 DNA 서열 검출

혼성화 detection 방법을 이용하여 실제 유전병과 관계된 DNA sequence 검출에 관한 실험들은 그렇게 많이 알려져 있 지 않다. 지금 까지 알려진 논문들 중에서 몇 가지를 살펴보면 다음과 같다. 이들 중 1,2,및 3 번의 예는 DNA probe를 modification하지 않은 상태에서 일정전위를 가하여 흡착시킨 후 hybridization의 정도를 cobalt complex indicator 를 이용하여 측정한 예이며 4 번의 경우 indicator를 사용하지 않고 얻은 결과이다.

1. Hepatitis B virus ( Electroanalysis 1999, 11, No. 8, 586~588)

Targer (21-mer sequence A):

5-AAT GTG CTC CCC CAA CTC CTC-3

Immobilized probe (21-mer sequence B):

5-GAG GAG TTG GGG GAG CAC ATT-3

2. Escherichia coli pathogen (Electroanalysis 1997,9, No. 5, 395~398)

Targer (25-mer sequence A):

5-TGC CGC TCA TCC GCC ACA TAT CCT G -3

Immobilized probe (25-mer sequence B):

5-CAG GAT ATG TGG CGG ATG AGC GGC A-3

3. HIV-1(Human immunodeficiency virus type 1) (Analytical Chemistry, 1996, 68, 2629)

Targer (21-mer sequence A):

5-ACT GCT AGA GAT TTT CCA CAT-3

Immobilized probe (21-mer sequence B):

5-ATG TGG AAA ATC TCT AGC AGT

Targer (42-mer sequence A):

5- ACT GCT AGA GAT TTT CCA CAC TGA CTA AAA GGG TCT GAG GGA-3

Immobilized probe (42-mer sequence B):

5- TCC CTC AGA CCC TTT TAG TCA GTG TGG AAA ATC TCT AGC AGT-3

4. sickle cell anemia (Analytical Chemistry, 2001, 73, 5629)

Target (19-mer sequence A):

3-GAGGACACCTCTTCAGACG-5

immobilized probe (19-mer sequence B);

5-CTCCTGTGGAGAA GTCTGC-3

끝으로, Electrochemical DNA biosensor의 검출한계 (ng/mL ~ pg/mL)는 PCR 증폭없이 실험을 할 수 있을 정도로 충분히 높 은 감도를 보인다. 그러므로 전기화학적인 검출법을 이용한 소형 DNA 바이오센서 제작의 가능성은 충분하다 고 할 수 있다. DNA 바이오센서에 있어서 지속적으로 연구되어야 할 점들은 길이가 긴 염기의 혼성화에 있어서의 선택성과 보다 재연 성 있고, 안정적인 센서를 제작하기 위한 DNA probe의 immobilization, hybridization, 및 detection과정에서의 보다 선택적이고 안정한 방법의 개발이다. 특히, 인간의 질병과 관계된 특정 DNA 염기서열에 대한 많은 실험이 이루 어져야 할 것이며, 이러한 연구들을 바탕으로 유전병과 박테리아 및 바이러스에 의해 발병되는 모든 질병을 쉽게 진단할 수 있는 의료용 DNA 센서를 개발 하는데 있어서도 많은 연구가 이루어져야 할 것이다.