바이오인

 

17세기 후반 네덜란드의 레벤후크가 현미경을 통해서 직접 미생물을 눈으로 관찰하고 19세기에 접어들어 프랑스의 파스퇴르에 의해 미생물이 발효와 부패와 같은 화학적 반응에 관여하며 탄저병, 콜레라와 같은 각종 질병을 유발한다는 것이 밝혀지면서 미생물의 정체가 그 모습을 드러내기 시작하였다.

 

특히, 파스퇴르, 슈레터, 코흐 등에 의해서 미생물의 순수배양이 성공하면서 이후 실험실내에서 미생물의 인공적인 배양이 가능하게 되었으며 이를 통해 현재에 이르기까지 바이오분야에서 미생물 분야의 빠른 발달을 가져오게 되었다. 최근까지의 미생물에 관련된 연구는 우선 미생물을 다양한 자연환경으로부터 순수 분리하여, 배양하거나 배양된 균체로부터 각종 물질을 추출하여 연구를 진행해 왔다.

 

미생물은 지구상에 존재하는 전 생물종의 약 60%를 차지하고 있는 것으로 알려져 있으며 이러한 미생물은 지구 생태계를 유지하는데 없어서는 안 될 중요한 역할을 담당하고 있다. 미생물은 또한 고부가가치 생물자원으로서 생명공학 산업의 핵심소재 중의 하나로 널리 이용되고 있기 때문에 현재 이용할 수 있는 미생물뿐만 아니라 자연계에 존재하는 미지의 신규유용 미생물자원은 생명공학 분야의 혁신적 발전의 기틀을 마련하는데 크게 기여할 수 있을 것이다.

 

이러한 미생물의 경제적 중요성으로 인해 선진국에서는 자국의 미생물관련 산업의 육성과 보호를 위하여 이들을 체계적으로 이용하고자 하는 연구가 본격적으로 이루어지고 있다. 최근 Nature 지에서는Microbiology gaining ground after lean years 이란 제목의 글에서 미생물에 의한 신규 질병의 발생, 200여개의 미생물유전체 해석의 완료, 메타게놈 연구 등으로 향후 확보할 수 있는 무한한 가치를 인정받으면서 미생물 분야가 황금시대를 맞고 있으며 미국 하버드 대학 등에서 미생물 분야의 연구 투자를 늘릴 준비를 하고 있다고 전하고 있다.

 

현재 다양한 미생물 종이 발견되거나 이용되고 있으나 많은 학자들은 지금까지 알려진 미생물 종은 지구상에 존재할 것으로 예상되는 미생물 종의 극히 일부분(1% 미만)에 지나지 않으며 나머지 약 99% 의 미생물은 아직까지 미발견 상태로 자연계에 존재하고 있다고 추정하고 있다. 이러한 사실은 자연환경으로부터 추출한 유전자 (특히 16S rDNA) 분석 또는 환경 시료를 대상으로 한 Fluorescence in situ hybridization (FISH) 방법에 의해서 그 사실이 확인되고 있다.

 

(표1)[1, 2]. 특히 세균의 경우 적어도 약 350만 종이 자연계에 존재할 것으로 추정되고 있으나 현재까지 발견된 것은 약 6,000 여종에 불과하다. 현재까지 발견이 되지 않은 미생물의 상당수는 실험실에서 분리, 배양하기가 까다롭거나 어려운 난배양성 또는 배양불가능 미생물일 가능성이 크기 때문에 최근에는 기존의 일반적인 방법이 아닌 새로운 기술을 사용하여 난배양성 또는 배양불가능 미생물을 체계적으로 이용하고자 하는 기술 개발이 본격적으로 이루어지고 있다 [3, 4]. 이러한 미지의 미생물자원을 이용하기 위한 방법들 중의 하나가 배양이 어려운 미생물을 배양하지 않고도 이들의 유전체를 자연계로부터 직접 추출하여 유용한 특성들을 개발하려는 메타게놈 (Metagenome) 분야로 최근 활발한 연구가 이루어지고 있다.

 

 

 

메타게놈(metagenome)이란 용어는 Handelsman 등에 의해서 특정 자연환경에 존재하는 모든 미생물의 유전체 집합으로 정의되고 있다 [5]. 그러나 최근 환경시료로부터 추출한 유전체 또는 유전자를 포함하는 클론을 총칭하여 메타게놈이라고 부르고 있으며 이러한 메타게놈에 관련된 일련의 연구를 메타게노믹스(metagenomics)라고 부르기도 한다. 학자들은 자연계에 존재하는 대부분의 미생물들이 왜 실험실에서 인공적으로 분리되거나 배양되기가 어려운 가에 대한 몇 가지 가설들을 내놓고 있다. 이러한 가설들 중 가장 중요한 이유로 꼽히는 것은 전통적인 평판배양방법으로는 미생물들이 존재하는 원래의 자연환경과 유사한 조건을 제공해 주기가 어렵기 때문에 대부분의 미생물들이 실험실에서 배양이 되지 않는다는 것이다. 따라서 자연계에 존재하는 대다수 미생물들의 다양성과 이들의 생태학적인 역할에 대한 올바른 이해와 함께 이들의 효과적인 활용을 위해서 다른 거시적인 접근방법이 필요하게 되었다. 이런 중에 도입되기 시작한 방법이 메타게놈 연구로 비교적 연구의 역사는 길지 않은 편이지만 최근 가시적인 연구 성과들이 발표되고 있다. 특히 최근 Venter 등[6]은 미국 에너지성(DOE)의 지원을 통해 생태계 시퀀싱(ecosystem sequencing)이라는 새로운 개념의 연구를 시작하여 버뮤다 해역으로부터 채취한 해수시료로부터 제작한 메타게놈 라이브러리에 샷건 시퀀싱(whole-genome shotgun sequencing)을 적용하여 약 10억개의 염기서열을 결정하였다. 염기서열 분석을 통해 채취한 해수시료에는 이전에 알려지지 않은 148개의 phylotype 세균을 포함하여 최소 1800종의 미생물 게놈(genomic species)이 복합되어 있었고 120만개 이상의 새로운 유전자가 발견되었다고 사이언스지에 보고되었다. 메타게놈 연구는 난배양성 또는 배양 불가능 미생물을 활용하기 위한 목적에 잘 부합하는 것으로 배양에 의한 순수분리가 불가능하다면 특정 환경내의 모든 DNA를 추출함으로써 분자생물학적으로 접근하고자 하는 방법이라 할 수 있다.

 

토양, 해수, 갯벌, 하천, 동물 장내 등 다양한 환경에 혼재되어 있는 수백억 개의 미생물로부터 유전체를 직접 추출하여 벡터에 삽입하여 클로닝을 하게 된다. 벡터(vector)로는 일반적으로 많이 사용되어온 플라스미드도 사용되고 있지만 보다 큰 크기의 유전자 또는 유전자 클러스터(gene cluster)를 클로닝할 수 있는 BAC, YAC, Fosmid, Cosmid 등이 사용되고 있으며 이 중 BAC(Bacterial Artificial Chromosome)과 Fosmid가 일반적으로 가장 많이 사용되고 있다. BAC vector는 1992년 김웅진 박사에 의해서 개발된 것으로 10~300 kb의 비교적 큰 크기의 DNA를 분석할 때 매우 유용하기 때문에 인간게놈프로젝트 및 쥐와 벼의 게놈분석에 이용되었다[7]. Fosmid는 대략 37~52kb 크기의 유전자 또는 유전체를 삽입할 수 있으며 높은 형질전환 효율을 나타내는 장점이 있는 것으로 알려져 있다. 재조합된 유전자는 배양이 가능한 미생물에 유지, 발현하는 기술을 통해 라이브러리를 구성하게 된다. 발현 숙주세포로는 현재 E. coli 를 가장 많이 사용하고 있으나 그람음성의 E. coli 만을 사용해서는 임의적인 메타게놈 유전자를 완전히 발현할 수 없으므로 Bacillus 나 Streptomyces 와 같은 다른 숙주세포와 그 숙주 세포내에서 클로닝 및 발현에 이용될 수 있는 적절한 벡터의 개발이 이루어지고 있다 [8]. 구축된 메타게놈 라이브러리는 유용한 특성을 가지고 있는 유용 유전자원인지 조사하기 위해서 적당한 스크리닝(screening) 방법이 적용되어야 한다. 현재까지는 메타게놈 라이브러리를 대상으로 염기서열 분석이나 발현되는 활성에 근거하여 유용 메타게놈을 찾기 위한 스크리닝 연구를 수행하고 있다. 그러나 미생물 다양성을 비추어 볼 때 유용 메타게놈 라이브러리의 확보를 위해서는 많은 수의 메타게놈 라이브러리의 스크리닝이 이루어져야 하므로 발현되는 단백질 등을 초고속으로 스크리닝 할 수 있는 기술 개발이 병행되어야 한다 (그림2)[9].

 

 

메타게놈 연구는 해양 피코플랑크톤 미생물 군집의 분석을 필두로 하여 Schmidt 등에 의해서 활발하게 이루어져 왔다[10]. 미국의 다이버사(Diversa), 큐비스트(Cubist Pharmaceuticals) 등의 벤처회사에서는 메타게놈 연구를 통해 토양으로부터 유용 유전자를 확보하였으며 이를 통해 인디루빈(indirubin), 테라진 A, B(terragiene A and B)과 같은 신규 생리활성 물질을 발견하였다.

 

Brady 등[12]은 토양으로부터 항생물질인 violacein과 deoxyviolacein을 분리하였으며 Gillespie 등[13]은 Turbomycin A와 B를 발견하였다. Diaz-Torres 등[14]은 구강내의 미생물 메타게놈 연구를 통해서 새로운 테트라사이클린(Tetracycline) 저항 유전자를 발견하였다. 메타게놈 라이브러리 구축 및 스크리닝 연구를 통해서 지금까지 탐색된 유용 효소 자원으로는 chitinase [15], 4-hydroxybutyrate dehydrogenase [16], lipase/esterase [17], protease [18], amylase, DNase [19], polyketide synthase [20], S/R-Nitrilase [21], agarase [22] 등이 있다. 이와 같이 메타게놈 연구를 통해서 지금까지 알려지지 않은 다양한 새로운 유전자와 산업적, 의학적으로 유용한 효소자원 및 생리활성물질의 발견이 지속적으로 이루어질 것으로 전망할 수 있다.

 

Beja 등[23, 24]은 해양에 서식하는 미생물의 메타게놈을 연구하는 과정에서 프로테오로돕신 (proteorhodopsin)이라는 유전자를 발견하였다. 이들은 프로테오로돕신 유전자를 포함하는 메타게놈 상에 rRNA 유전자가 우연히 함께 실려 있다는 것을 확인하고 rRNA 유전자의 염기서열을 분석한 결과 그 rRNA 유전자가 감마-프로테오박테리아 (gamma-Proteobacteria)의 종에서 유래한 것이라는 것을 확인하게 되었다. 이러한 메타게놈 연구를 통해 그 동안 호염성 고세균에만 존재하는 것으로 알려진 광합성로돕신이 일반세균(Bacteria)에서도 발견된다는 것을 세계 최초로 입증하게 되었다. 최근 다양한 지역의 해양시료로부터 구축한 메타게놈 라이브러리를 분석한 결과 프로테오로돕신을 갖는 세균이 전 세계적으로 널리 분포되어 있다는 것이 밝혀지면서 프로테오로돕신에 의한 광에너지의 발생은 탄소와 에너지 흐름에 새로운 메커니즘을 의미하는 것이며 더 나아가 지구 생태계에 대한 새로운 해석을 제공하고 있다. 즉 메타게놈 연구를 통해 세계 도처에 존재하는 상당수의 미생물이 광합성에 관여하는 프로테오로돕신을 가지고 있다는 것이 밝혀짐으로써 그동안 지구 생태계를 유지하는데 제일 중요한 것으로 알려진 광합성이 주로 식물에 의해서 이루어진다는 기존 개념이 바뀌게 된 것이다.

 

Schmeisser 등[25]과 Tyson 등[26]은 바이오필름(biofilm)을 이용한 메타게놈 연구에서 바이오필름내의 미생물 군집(community)에 대한 개체 구조(population structure)를 예측하고 군집에서의 물질 대사 네트워크(metabolic network)의 특징을 분석하였다. 이와 같이 메타게놈 연구는 지금까지 배양되지 않는 다양한 미생물의 유전자를 포함한 특정 자연환경 전체의 유전자 또는 유전체를 분석할 수 있는 환경내의 유전적 청사진을 제공하고 있으므로 특정 생태계에 대한 이해를 도울 수 있는 Microbial Eco-genomics 연구의 핵심 분야라고 할 수 있다. 국내에서도 최근 메타게놈 연구가 활발히 이루어지고 있으며 다양한 스크리닝을 통해 주로 생리활성 물질, 효소자원 등의 탐색 연구와 특정 생태계의 군집분석 연구가 이루어지고 있다. 이러한 일련의 연구 및 성과들은 비록 자연계로부터 개개의 미생물을 직접 분리하지는 못했지만 복잡한 자연계의 미생물 군집을 메타게놈 연구를 통해 분자적으로 접근하여 분석하였기에 가능하였다고 할 수 있다

 

현재 인류가 이용하고 있거나 발견한 유용 생물제품의 상당수는 미생물로부터 유래된 것들이다. 최초로 개발된 항생제인 페니실린을 비롯한 항생제의 약 80%가 실험실에서 배양이 되어온 1%의 배양 가능 미생물에 의해서 만들어진 것이다. 바꾸어 말한다면 아직까지 발견되지 않고 자연계에 남아있는 99%의 난배양성 미생물에 대한 이해와 접근은 지금까지와는 비교할 수 없을 정도로 산업적으로 중요하고 유용할 것이라는 결론을 내릴 수 있다. 학문적으로는 자연계에 존재하고 있는 대다수의 미생물들이 실험실에서 배양되지 않았던 이유를 규명할 수 있게 되고 그들이 갖고 있는 생태학적인 기작 및 역할에 대한 이해를 증진시킬 수 있을 것이며 이러한 연구의 중심에 메타게놈 연구가 자리 잡고 있다고 할 수 있다. 따라서 메타게놈의 연구는 현재 유용 산물 스크리닝의 낮은 효율 등의 단점에도 불구하고 점점 더 그 응용 분야와 범위가 확대되어갈 것으로 생각된다.

 

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1. Amann, R.I., Ludwig, W., Schleifer, K.H.: Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation. Microbial Rev 1995, 59:143-169.

2. Whitman, W.B., Coleman, D.C., Wiebe, W.J.: Prokaryotes: The unseen majority. Proc Natl Acad Sci USA 1998, 95:6578-6583.

3. Kaeberlein, T., Lewis, K., Epstein, S.S.: Isolating Uncultivable microorganism in pure culture in a simulated natural environment. Science 2002, 296:1127-1129.

4. Zengler, K., Toledo, G., Rappe, M., Elkins, J., Mathur, E.J., Shot, J.M., Keller, M.: Cultivating the uncultured. Proc Natl Acad Sci USA 2002, 99:15681-15686.

5. Handelsman, J., Rondon, M.R., Brady, S.F., Clardy, J., Goodman, R.M.: Molecular biological access to the chemistry of unknown soil microbes: a new frontier for natural products. Chem Biol 1998, 5:R245-R249.

6. Venter, J.C., Remington, K., Heidelberg, J.F., Halpern, A.L., Rusch, D., Eisen, J.A., Wu, D., Paulsen, L., Nelson, K.E., Nelson, W., Fouts, D.E., Levy, S., Knap, A.H., Lomas, M.W., Nealson, K., White, O., Peterson, J., Hoffman, J., Parsons, R., Baden-Tillson, H., Pfannkoch, C., Rogers, Y.H., Smith, H.O.: Environmental genome shotgun sequencing of the sargasso sea. Science 2004, 304:66-74.

7. Kim, U.J., Shizuya, H., de Jong, P.J., Birren, B., Simon, M.I.: Stable propagation of cosmid sized human DNA inserts in an F factor based vector. Nucleic Acids Res 1992, 20:1083-1085.

8. Alduina, R., De Grazia, S., Dolce, L., Salerno, P., Sosio, M., Donadio, S., Puglia, A.M.: Artificial chromosome libraries of Streptomyces coelicolor A3(2) and Planobispora rosea. FEMS Microbiol Lett 2003, 218:181-186.

9. Lorenz, P., Liebeton, K., Niehaus, F., Eck, J.: Screening for novel enzymes for biocatalytic processes: accessing the metagenome as a resource of novel functional sequence space. Curr Opin Biotechnol 2002 13:572-577.

10. Schmidt, T.M.,Delong, E.F,, Pace, N.R.: Analysis of a marine picoplankton community by 16S rRNA gene cloning and sequencing. J Bacteriol 1991, 173: 4371-4378.

11. MacNeil, I.A., Tiong, C.L., Minor, C., August, P.R., Grossman, T.H., Loiacono, K.A., Lynch, B.A., Phillips, T., Narula, S., Sundaramoorthi, R., Tyler, A., Aldredge, T., Long, H., Gilman, M., Holt, D., Osburne, M.S.: Expression and isolation of antimicrobial small molecules from soil DNA libraries. J Mol Microbiol Biotechnol 2001, 3:301-308.

12. Brady, S.F., Chao, C.J., Handelsman, J., Clardy, J.: Cloning and Heterologous Expression of a Natural Product Biosynthetic Gene Cluster from eDNA. Orga lett 2001, 3:1981-1984.

13. Gillespie, D.E., Brady, S.F., Bettermann, A.D., Cianciotto, N.P., Liles, M.R., Rondon, M.R., Clardy, J., Goodman, R.M., Handelsman, J.: Isolation of Antibiotics Turbomycin A and B from a Metagenomic Library of Soil Microbial DNA. Appl Environ Microbiol 2002, 68:4301-4306.

14. Diaz-Torres, M. L., McNab, R., Spratt, D.A., Villedieu, A., Hunt, N., Wilson, M., Mullany, P.: Novel Tetracycline Resistance Determinant from the Oral Metagenome. Antimicrob agents Chemother 2003, 47:1430-1432.

15. Cottrell, M.T., Moore, J.A., Kirchman, D.L.: Chitinases from uncultured marine microorganisms. Appl Environ Microbiol 1999, 65:2553-2557.

16. Henne, A., Daniel, R., Schmitz, R.A., Gottschalk, G.: Construction of environmental DNA libraries in Escherichia coli and screening for the presence of genes conferring utilization of 4-hydroxybutyrate. Appl Environ Microbiol 1999 65:3901-3907.

17. Henne, A., Schmitz, R.A., Bomeke, M., Gottschalk, G., Daniel, R.: Screening of environmental DNA libraries for the presence of genes conferring lipolytic activity on Escherichia coli. Appl Environ Microbiol 2000, 66:3113-3116.

18. Gupta, R., Beg, Q.K., Lorenz, P.: Bacterial alkaline proteases: molecular approaches and industrial applications. Appl Microbiol Biotechnol 2002, 59:15-32.

19. Rondon, M.R., August, P.R., Bettermann, A.D., Brady, S.F., Grossman, T.H., Liles, M.R., Loiacono, K.A., Lynch, B.A., MacNeil, I.A., Minor, C., Tiong, C.L., Gilman, M., Osburne, M.S., Clardy, J., Handelsman, J., Goodman, R.M.: Cloning the soil metagenome: a strategy for accessing the genetic and functional diversity of uncultured microorganisms. Appl Environ Microbiol 2000, 66:2541-2547.

20. Seow, K.T., Meurer, G., Gerlitz, M., Wendt-Pienkowski, E., Hutchinson, C.R., Davies, J.: A study of iterative type II polyketide synthases, using bacterial genes cloned from soil DNA: a means to access and use genes from uncultured microorganisms. J Bacteriol 1997, 179:7360-7368.

21. DeSantis, G., Zhu, Z., Greenberg, W.A., Wong, K., Chaplin, J., Hanson, S.R., Farwell, B., Nicholson, L.W., Rand, C.L., Weiner, D.P., Robertson, D.E., Burk, M.J.: An enzyme library approach to biocatalysis: Development of Nitrilases for enantioive production of carboxylic acid derivatives. J Am Chem Soc 2002, 124:9024-9025

22. Voget, S., Leggewie, C., Uesbeck, A., Raasch, C., Jaeger, K.E., Streit, W.R. : Prospecting for Novel Biocatalysts in a Soil Metagenome. Appl Envir Microbiol 2003 69:6235-6242.

23. Beja, O., Aravind, L., Koonin, E.V., Suzuki, M.T., Hadd, A., Nguyen, L.P., Jovanovich, S.B., Gates, C.M., Feldman, R.A., Spudich, J.L., Spudich, E.N., Delong, E.F.: Bacterial rhodopsin: Evidence for a new type of phototrophy in the sea. Science 2000, 289:1902-1906.

24. Beja, O., Spudich, E.N., Spudich, J.L., Leclerc, M., Delong, E.F.: Proteorhodopsin phototrophy in the ocean. Nature 2001, 411: 786-789.

25. Schmeisser, C., Stockigt, C., Raasch, C., Wingernder, J., Timmis, K.N., Wenderoth, D.F., Flemming, H.-C., Liesegang, H., Schmitz, R.A., Jaeger, K.E., Streit, W.R.: Metagenome survey of biofilms in drinking-water networks. Appl Environ Microbiol 2003, 69:7298-7309.

26 Tyson, G.W., Chapman, J., Hugenholtz, P., Allen, E.E., Ram, R.J., Richardson, P.M., Solovyew, V.V., Rubin, E.M., Rokhsar, D.S., Banfield, J.F.: Community structure and metabolism through reconstruction of microbial genomes from the environment. Nature 2004, 428:37-43.