바이오인

출처 : 식품의약품안전처

식육가공품 중 E형 간염바이러스 유전자 검출 시험법

[목차]

1. 전처리

2. 유전자 추출법

3. 유전자 검출법

1. 전처리

1) 시약 및 시액

 가) Phosphate-Buffer saline (pH 7.4)

 나) 유전자 추출 키트(Viral RNA Mini Kits)

재현성 및 검출효율 등을 고려하여 QIAGEN-Viral RNA Mini Kits 또는 동등 이상의 제품사용 가능

 다) 유전자 증폭 용액

  (1) RT-PCR 증폭 용액

   ① OPC (Oligo Nucleotide Purification Cartridge)로 정제된 프라이머를 사용한다.

   ② RT-PCR에 사용되는 One-step RT-PCR mix는 본 시험법에서 제시한 제품(1-Step RT-PCR ReddyMix 的t) 또는 동등 이상의 제품을 사용할 수 있다.

   ③ 2차 PCR(Semi-nested PCR) 에 사용되는 Taq DNA polymerase,10X buffer(MgCl2 포함), 10 mM dNTPs(each dNTP 2.5 mM)의 필요한 시약을 갖추어 PCR을 실시한다(이와 동등한 결과를 얻을 수 있는 DNA polymerase, buffer, dNTPs도 사용할 수 있다).

   ④ 증류수는 역삼투압 정제 등에 의해 17 MQ/cm까지 정제한 초순수로 DNA, DNase 등의 오염이 없는 것을 사용한다.

 (2) Realtime PCR 증폭 용액

  ① 프라이머와 프로브는 합성하여 사용한다.

  ② PCR에 사용되는 Realtime PCR mix는 본 시험법에서 제시한 제품(Agpath ID one-step RT-PCR reagent) 또는 동등 이상의 KTT 제품을 사용할 수 있다.

  ③ 증류수는 역삼투압 정제 등에 의해 17 MQ/cm까지 정제한 초순수로 DNA, DNase 등의 오염이 없는 것을 사용한다.

2) 장치 및 기구

가) 스토마커 (Stomacher)

나) 원심분리기 (Centrifuge)

다) 자외선조사기(UV Transilluminator)

라) 혼합기 (Vortex mixer)

마) 전기 영 동장치 (Gel Electrophoresis)

바) 유전자증폭장치 (PCR machine)

사) 실시간유전자증폭장치 (ReaWmeRT-PCR machine)

3) 바이러스 회수과정

가) 멸균 된 가위 또는 수술용 칼과 핀셋 등을 사용하여 검체를 100 g 취한 후 Phosphate-Buffer saline (pH 7.4) 100 mL을 첨가하고 스토마커를 이용해 5분간 균질화 한다.

나) 균질화된 전체 검체를 멸균된 비이커에 옮기 후 다시 원심분리용 튜브에 옮기고 10/)00 x g로 30분간 4°C에서 원심분리 한다.

다) 원심분리를 통해 모아진 상등액은 다시 원심분리용 튜브에 옮긴 후 8,000 x g에서 15분간 원심분리 한다

다) 원심분리 후 1.5 mL 튜뷰에 상등액 ImL 옮기고 다시 8,000 x 은에서 5분간 원심분리 한다

바) 최종 상층액은 RNA 추출을 위한 시료로 사용한다.

...................(계속)

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