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출처 : 생물학연구정보센터(BRIC)

단일 세포 분석 연구 기술 및 전망

이혜미 / 충남대학교

[목 차]

1. 서론
2. 단일 세포-분자 발현 분석 기술
  2.1 단일 세포 분석에서의 스냅샷 접근
  2.2 살아있는 세포의 실시간 접근
3. 단일 세포 분석연구에 대한 전망
  3.1 세포간 이질성
  3.2 다세포 유기체에서 단일 세포 분석
  3.3 희귀 세포의 단일 세포 분석
4. 면역 세포에서의 단일 세포 분석연구 기술 및 전망
  4.1 면역 시스템에서의 단일 세포 분석 기술
  4.2 단일 세포 분석 기술의 장단점
  4.3 면역 체계의 이질성
  4.4 면역 단일세포 분석의 향후 방향
5. 결론
6. 참고문헌

[요약문]

시스템 생물학은 생명 체계를 총체적으로 탐구하고 그 현상을 시스템 차원에서 이해하기 위한 분야이다. 따라서 기존의 생명 체계를 보다 넓게 이해하고자 시스템 생물학 기술의 개발이 필수적이다. 최근 시스템 생물학을 이용하여 개발된 기술은 면역의 기본 단위인 단일 세포를 기반으로 다양한 방법으로 분석되고 있다. 이러한 기술의 발전은 단일 세포의 유형 및 상태를 확인함으로써 질병의 치료뿐만 아니라 예방으로의 확대될 수 있을 것으로 기대된다. 본 분석에서는 단일 세포 분석 연구기술 및 전망에 대해 살펴보고자 한다.

1. 서론

 생명체에 대한 DNA 염기서열 분석 및 유전자 해독 등 다양한 정보 수집하는 도구의 개발이 이루어지면서 시스템 생물학에 대한 접근이 시작되었다. 이는 다양한 생체 기능을 이해함에 있어 구성 세포의 기능을 결정짓는 동역학 특성을 분석하고 복잡한 상호작용을 밝혀내는데 필수적이다.

생화학적 및 분자적 분석은 단일 시점에서의 세포 집단의 특성을 결정한다. 이러한 측정은 유전자 발현 패턴, 신호 전달 네트워크 및 유전자 조절 기전을 분석하는데 사용되고 있다. 세포간의 가변성은 단일 세포의 기능 및 환경을 적응하는데 사용하는 역동적인 분자 메커니즘을 해결하는 통로를 제공한다. 이를 위해서는 단일 mRNA와 단백질 분자를 정량화하고 추적하는 기술 개발이 필요하다. 예를 들어, 세포의 이질성은 세포 분화가 생존을 보장하는 후생 동물에서 유전자 조절의 복잡한 모델링을 증가시킨다. 단일 세포 분야의 연구는 FACS (Fluorecence-activated cell sorting), 단일 세포 RNA 시퀀싱(sequencing) 및 형광 현미경 검사의 세 가지 방법이 개발되어 활용되고 있다. FACS 기법은 단백질 마커의 조합에 따라 세포 유형을 분류하는데 유용하다. 여전히 FACS 기법은 표적 단백질에 대한 항체가 있어야 함으로 제한적이고 유전자 발현 조절에 대한 정보 제공이 어렵다. 하지만 CRISPR-Cas 기술은 특정 내인성 유전자에 형광 단백질 및 RNA를 인식할 수 있는 어댑터(aptamer)를 부착하여 한계를 극복하였다. 마지막으로 단일 세포 RNA 시퀀싱은 RNA의 총 세포 함량에 대한 스냅 샷(snap shot)을 제공한다. RNA 시퀀싱은 전체 세포 전사체에 대한 정보 제공 및 단일 세포의 비교가 가능하지만 세포 미세 환경에서 분자의 공간 정보는 단일 세포 분리 과정에서 손실된다. 공간 위치에 대한 정보는 본래 환경에서 세포를 직접 시각화하여 수집할 수 있다. 유전자 발현을 분석할 때 형광 현미경 검사의 능력은 단일 입자 시각화 하는 기술에 의해 강화되었다. 유전자 발현 조절에 대한 mRNA의 역할과 상보적으로 표지된 올리고체 다중화는 단일 분자 분해능에 도달하고 고정된 세포 내에서 정량화될 수 있도록 RNA를 만들었다. 이전에 관찰된 다른 기술의 세포 간 변이성 외에도 단일 분자 형광 in situ hybridization (smFISH)은 mRNA 대사에 대한 추가 정보를 제공한다. 단일 분자의 정량, 등록 및 추적을 위한 분석 도구와 함께 현미경 기술의 개발은 유전자 발현을 분석하는 새로운 관점을 제시한다.

2. 단일 세포-분자 발현 분석 기술

 형광 현미경 검사는 여러 가지 장점으로 고정 및 살아있는 세포에서 단일 세포 분석에 널리 사용되는 방법이다. 첫째, 항체 또는 핵산 결합 프로브(probe)와 유전자 암호화 형광 단백질의 특이성으로 인해 세포 내부의 표적 분자를 선택적으로 검출할 수 있다. 둘째, 단일 분석에서 여러 표적을 다중 검출할 수 있는 다양한 형광색이 있다. 셋째, 디지털 이미지에서 정량 분석을 수행하여 형광 신호로부터 공간 및 강도 정보를 결정할 수 있다. 마지막으로, 형광 신호가 실시간으로 높은 감도로 수집될 수 있기 때문에 라이브 세포의 시각화가 가능하다.

단일 분자 분해능은 현미경 기술의 진보와 RNA 또는 단백질의 개별 분자에서 방출되는 신호를 증폭시키는 라벨링(labeling) 방법을 활용하고 있다. 초고분해능 형광현미경(stochastic optical reconstruction micros, STORM) 및 광 활성화된 국소 현미경(photo-activated localization micros, PALM)은 회절-제한 스폿(spot) 내에 위치하는 다중 분자를 분해하기 위해 광 스위치 가능한 형광 프로브의 사용에 기반한다[1-2].

2.1 단일 세포 분석에서의 스냅샷 접근

 이미징에 대한 이론적 근거는 본래 환경에서 세포 구성 요소의 공간적 위치에 대한 정보를 얻는 것이다. 면역염색(immunostaining)과 in situ hybridization은 오랫동안 조직 구조의 유전자 발현을 연구하는데 사용되었다. 단일 mRNA 분자는 고정된 세포에서 smFISH에 의해 검출된다[3, 4]. 각 mRNA를 형광표지된 여러 개의 프로브와 하이브리드(hybrid)화함으로써 단일 mRNA 분자를 검출하여 그 수를 셀 수 있다. 50-mer 또는 20-mer 올리고 데옥시 뉴클레오타이드 (oligodeoxynucleotides, ODNs), 분자형 DNA (bDNA) 프로브 및 FISH-STICs를 사용하여 smFISH가 개발되었다[3-5]. 또한 신속한 진단과 전사된 유전자 융합, 단일 뉴클레오티드 변형(singlenucleotide variants, SNV), 비암호화 RNA 및 초기 mRNAs에 대한 프로토콜이 최적화되었다[6-8]. smFISH로 얻은 영상을 분석하기 위해서는 핵과 세포질의 전사 수를 자동으로 계산하고 3차원에서 활성 전사 부위의 초기 mRNA를 정량 하기 위해 Localize and Air-Localize 또는 FISH-QUANT와 같은 소프트웨어를 활용한다[9-11]. 또한 mRNA 수와 세포 분포의 관계는 핵의 mRNA 보유, mRNA 반감기 및 전사 결과에 대한 중요한 정보를 제공한다[11-14].

 smFISH는 mRNA의 대사에 대한 광범위한 정보를 제공하지만, 한번에 소수의 유전자 만 평가할 수 있다. 이 한계를 극복하기 위해 다중 프로브 유전자 발현 프로파일링을 위해 동시에 11개의 mRNA 시각화 조합 프로브 라벨링이 도입되었다[15]. 이 접근법은 초 해상도 현미경, 순차 탐침 hybridization 및 스트리핑, 해밍(Hamming) 알고리즘과 결합되어 동시 검출을 위해 잠재적으로 천 개의 RNA 종까지 유전자 수를 추가로 늘려준다[16, 17]. 또한, 형광 원위치 RNA 시퀀싱 (FISSEQ)은 세포 내 역전사 cDNA의 올리고 뉴클레오타이드 라이게이션(ligation) 및 검출에 의한 전사체 시퀀싱이 가능하다. 현재 FISSEQ은 RNA 시퀀싱보다 훨씬 적은 수의 판독을 생성하고 RNA 및 단백질 프로세싱에 관여하는 유전자에 쉽게 접근할 수 없지만, 공간적 맥락에서 단일 세포에서 전사체를 측정할 수 있다. 전반적으로 smFISH는 단일 mRNA 분자의 수와 위치에 대한 정확한 정보를 제공한다. 수많은 세포의 정량화는 세포 간 변동성을 알려주고, FISH-QUANT와 같은 알고리즘의 적용은 유전자 발현의 역동성을 추론한다. 그럼에도 불구하고 시간이 지남에 따라 동일한 입자를 추적할 수 있는 능력이 미흡홥으로 단일 분자의 실시간 영상을 개발이 필요하다.

2.2 살아있는 세포의 실시간 접근

 세포 집단에서 단일 분자 역학과 세포 운명을 이해하려면 해상도 필요하다. 살아있는 세포 내에서 단일 mRNA 해독을 달성하기 위해 유전적으로 암호화된 스템 루프 어레이(stem loop array)가 사용되었다. MS2 시스템은 MS2 박테리오파지(bacteriophage; MCP)와 MS2 결합 부위(MBS) RNA 스템 루프의 매우 특이적인 결합을 이용한다. MS2-SL의 다중 사본으로 표지된 유전자는 동일한 세포에서 발현되는 MCP-GFP (green fluorescent protein; 녹색 형광 단백질) 융합단백질을 결합하는 리포터(reporter) mRNA를 생성한다. 결과적으로 각 리포터 mRNA는 GFP로 표시되어 살아있는 세포에서 단일 mRNA 이미징한다. 상동성 재조합을 사용하는 효모에서 MS2-SL로 내인성 mRNA를 표지가 용이하다[18]. 포유류 세포에 대한 연구는 일시적 형질도입(transient transfection)이나 β-actin mRNA MBS knock-in 마우스와 MCP-GFP를 발현하는 형질 전환 마우스를 사용하여 수행되었다[9]. 이 기술은 살아있는 세포에서 mRNA의 전사, 핵 유출 및 유전자 변화의 실시간 역동성을 모니터링 하는데 광범위하게 사용되었다[19]. 또한, 최근의 CRISPR-Cas 기술의 진보는 살아있는 세포 이미징을 위한 게놈 편집 및 RNA 라벨링 기술을 발전시켰다[20, 21].

 mRNA 대사의 각 측면에 대한 평가에는 특정 현미경 또는 분석 도구의 개발이 필요하다. MS2-MCP 시스템의 큰 장점 중 하나는 살아있는 세포에서 RNA의 단일 분자 추적이 가능하다는 것이다. 단일 입자 추적(SPT)의 목표는 개별 mRNA에 특정 궤적을 할당하는 것이다. SPT에 대한 중요한 매개 변수는 입자 간 평균 거리를 두 개의 연속 이미지 프레임 사이의 입자의 평균 변위로 나눈 간격-이동 비율이다. 이 비율이 1보다 크면 연속적인 이미지 프레임에서 가장 가까운 이웃을 검색하여 입자 추적을 수행할 수 있다. 그러나 간격-변위 비율이 낮으면 궤도를 연결이 어려워짐에 따라 입자 추적이 어렵다[22]. 따라서 다양한 궤적 알고리즘이 개발되어 입자 궤적의 가능한 집합을 찾는다[23]. mRNA 분자는 확산 운동과 방향성 수송 사이에서 전환하는 복잡한 동역학을 나타내며, 일시적인 수송 상태를 추정하기 위한 소프트웨어를 사용하여 분석할 수 있다[24-26]. 다중 스펙트럼 살아있는 세포 이미징에 의한 단일 mRNA 및 리보좀(lysosome)의 동시 추적은 폴리 리보좀(poly lysosome)으로 로딩된 mRNA가 비번역 mRNA보다 느리게 움직이는 것으로 나타났다[25]. 이는 단일 mRNA 분자와 초기 폴리펩타이드(polypeptide)가 합성될 때 동시에 추적함으로써 확인되었다[27]. mRNA의 번역 상태는 동역학에 따라 구별할 수 없지만 초기 펩타이드의 시각화로 확인할 수 있다[27, 28]. 또 다른 예는 NPC (nuclear pore complex)를 통한 β-actin mRNA 유출의 동역학을 해결하는 수퍼 등록 방법의 개발이다[29]. 이 방법을 새로 개발된 다중 초점 현미경과 결합함으로써 3D 단일 분자 실시간 이미지를 캡쳐하고 핵 내의 β-actin mRNA의 확산 속도뿐 아니라 위치를 결정하는 분석을 수행할 수 있다[30].

전사 및 번역과 같은 실시간 생물학적 과정 분석 연구는 PP7 및 λ boxB RNA 또는 효모에 특이적인 U1A 태그 시스템과 같은 상동 스템 루프 시스템의 설계에 따라 증가했다[32]. 5'말단의 PP7-SL과 3'말단의 MS2-SL로 같은 mRNA를 표지하여 다중 칼라 RNA 이미징을 수행하여 전사 길이를 측정하고 시간 경과에 따라 GFP (PCP-GFP) 및 MCP-mCherry에 융합된 PP7 코트 단백질에 결합하는 초기 전사 단백질로부터의 형광 신호를 정량화하는 단계를 포함한다. 번역의 제1단계는 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF)에서 단일 mRNA를 결합하여 살아있는 세포 내에서 단일 분자 해상도로 국한되었으며, 3' 비번역 영역(3'UTR), 및 세포에서 2가지 색상에서 1가지 색상으로의 변화가 일어나는 곳을 모니터링하는 것이다[32].

 mRNA는 유전자 발현의 조절을 분석하는 핵심 분자이지만 일반적으로 유전자 기능은 단백질에 의해 수행된다. 단일 단백질의 영상화는 한 형광체에 의해 방출되는 광자의 수에 의해 제한되었다. 신호를 증가시키기 위해 개발된 몇 가지 방법은 다음과 같다. SunTaq라는 반복 펩타이드 배열은 GFP와 같은 형광 단(fluorophore)에 융합된 항체를 모집하도록 설계되었다[33]. SunTaq 시스템으로 모든 단백질에 대해 단일 분자 분해능을 얻고 살아있는 세포에서 단백질의 가능하다. 또한, SunTaq 시스템을 이용한 N-말단 결합은 MS2 또는 PP7 시스템으로 표지된 단일 mRNA로부터 초기 펩타이드의 합성을 시각화한다[27, 28]. 다른 접근법은 종래 사용된 형광 단백질보다 더 밝은 형광을 사용하는 것이었다. 특히 다기능성으로 HaloTaq 기술은 합성 리간드(ligand)에 공유 결합하도록 고안된 박테리아의 변형된 할로 알칸 데할로게나제(alkane dehalogenase; Halo)를 기반으로 하는 모듈식 태그 시스템이다[34]. 이 리간드는 형광 염료에 부착된 반응성 링커일 수 있다. HaloTaq 형광 리간드는 GFP와 같은 기존의 형광 단백질보다 적더라도 1배 이상 밝다[34]. 이 기술은 전사 인자의 SPT를 수행하는데 매우 유용하다. 또한, 2광자 형광 상관 분광법(FCS)의 진보는 세포에서 단일 mRNA 및 단일 단백질 결합의 분석을 가능하게 했다[35]. 이 분석의 접근법은 형광 분광 지점을 통과할 때 서로 다른 색의 두 분자(RNA 및 단백질)의 형광 신호의 변동에 대한 통계 분석을 기반으로 한다. 또한 RNA에 결합된 단백질의 총량은 형광 변동 분광법(FFS)에 의해 상관된 밝기의 양에 기초하여 계산될 수 있다[35].

3. 단일 세포 분석에 대한 전망

3.1 세포간 이질성

 유전자 발현의 단세포 분석 결과 세포간에 상당한 차이가 있음이 밝혀졌다. 이 변이는 낮은 돌연변이율로는 설명할 수 없는 세포 집단의 이질성을 나타낸다. 이질성은 내재적인 것일 수 있다[36]. 외부 이질성 환경 변화, 딸 세포 사이의 분자의 임의적인 분할 또는 세포 크기로 인해 발생한다. 한 집단의 세포가 차별적으로 환경 변화에 노출되어 자극에 다르게 반응할 수 있다. 전사와 번역으로부터 유도된 내재적 이질성은 반응의 다양화를 향상시키거나 보상할 수 있다[37]. 예를 들어, 세포 체적의 증가는 세포주기 동안 전사 버스트(burst) 크기와 빈도의 조절을 동반한다[38]. 정해진 농도에서 작동해야 하는 생성물을 암호화하는 필수 유전자에서 낮은 발현의 전사는 낮은 고유의 이질성을 얻기 위해 비효율적인 mRNA 번역에 의해 보상된다[39].

특정 mRNA의 핵 보유는 세포가 전사와 번역과 독립적으로 적절한 단백질 수준을 표현하는 조절을 나타낸다[40]. 후생 동물 세포(metazoan cell)에서의 전사는 주로 확률적이지만 mRNA의 세포질 함량은 세포의 표현형 상태와 상황을 고려하여 결정될 수 있다. 즉, 고등 진핵세포의 세포질에 전사 이질성을 완충시키는 것이다. 다기능 생물체에서 적절한 기능을 수행하기 위해 필요한 유전자 발현 프로그램에서 다른 메커니즘이 진화 경로를 나타내는지 여부가 여전히 결정되어야 한다.

3.2 다세포 생명체에서 단일 세포 분석

 다세포 생물에서 각 세포는 전사체와 프로테옴(proteome)을 전체 유기체에 맞춰야 한다. 이러한 예는 간은 식사 후 포도당(glucose)을 흡수하고 영양 결핍 동안 포도당을 합성하고 방출한다[41]. SmFISH는 포도당 생성 유전자인 Pck1과 G6pc의 전사와 mRNA 붕괴를 조정함으로써 간세포가 포도당 흡수제에서 전환함을 밝혀냈다. 영영 결핍 상태 동안 포도당 유전자는 전사 버스트의 동시 증가 및 mRNA 분해 속도의 감소에 의해보다 높은 발현 수준을 달성한다. 또한 이 동기화는 식사 후에 포도당 수준의 급격한 증가에 적응하기 위해 신속한 저하를 허용한다. 간세포 중 전사 생성물에는 높은 이질성이 있다. 이 세포와 세포간의 가변성은 β-actin과 같은 구성적으로 고려되는 다른 유전자에도 적용된다. β-actin의 경우 전사가 급격히 이루어지며 mRNA는 보다 안정적이다. 배수체 간세포는 2배체보다 이질성이 낮다. 따라서 세포 배수체와 mRNA 반감기의 조절은 간에서 전사 이질성을 조절하는 것으로 보인다[41]. 세포 간의 이질적인 전사는 조직의 기능성과 발달을 보장하는 형태이어야 한다. 뇌하수체의 경우, prolactin 전사 버스트의 길이와 강도는 노화가 됨에 따라 짧아지고 강렬하나 빈도는 약간 변하지 않는다. 성인에서 서로 가까이 있는 세포는 원위 세포보다 발현이 더 잘 조정되어 이질성을 줄이는데 공간 조직과 세포간 통신의 역할 담당을 암시한다.

유전자 발현 조정의 가장 주목할만한 예는 배아 발생 과정이다. 수정(fertilization) 후 유전자 발현은 각 개별 세포의 정체와 운명을 결정하고 새로운 신체의 형성을 조율하기 위해 시간과 공간이 구분된다. MS2 시스템은 초파리(Drosophila) 배아 전체에서 개별 세포를 이미지화하고, 발달 후 시공간적 및 기계론적 변화를 나타낸다[42]. 수정 후 3시간 후, 초파리 배아는 몸체 부분을 결정하는 패턴 형성 정보가 있는 약 6천여개의 세포로 구성된다[43]. 모체 mRNA bicoid (bcd)는 단백질 기울기(hunchback, hb)를 단백질 기울기에 따라 활성화함으로써 전후 축을 결정한다. hb 발현 세포와 비발현 세포 사이의 경계의 형성은 MS2-MCP 시스템으로 hb 프로모터의 활성을 실시간 모니터링함으로써 특성화되었다[44]. 후부의 세포는 전방의 세포와 동시에 전사를 시작하나 BCD 단백질의 농도는 전사의 강도와 길이를 결정한다. hb 프로모터의 자발적 활성화는 핵 분열로부터 후방에서 억제된다. 또한 모든 활성 세포가 유사 분열 후 동시 전사 개시를 나타내며 일단 세포 내 전사가 이루어지면 단일 피크 활성이 있음이 주목된다[44]. 이 결정론적 표현은 균등 건너 뛰기(eve) 스트라이프 2 유전자에 의해 표시되는 가변적인 버스트 프로파일과는 다르다[45]. 초파리 패턴닝(Drosophila pattering)과 같은 메커니즘을 정체를 나타내기 위해 시간 경과에 따라 개별 세포와 활동을 시각화하는 관련성이 강조된다. 초파리에서는 약 천여 개의 인핸서(enhancer)가 복잡한 상호 작용을 통해 몇 가지 유전자의 활성을 정의한다. 상기 hb 및 eve 스트라이프 2 유전자에서 단일 인핸서 및 프로모터를 조사하는데 사용된 전략은 hb, kni 및 sna 프로모터에 대한 인핸서 쌍의 상호 작용을 특성화하기 위해 확장되었다[46].

고려해야 할 요인의 조합이 여러 개인 경우 유전자 발현의 다양성을 고려하여 실험 결과를 통합해야 한다. 따라서 수백 개의 유전자를 한번에 시각화할 수 있는 새로운 기술의 연구가 필수적이다. 또한 유전자 발현의 첫 단계인 전사뿐만 아니라 mRNA의 국소화, 안정성 및 번역을 조절하는 전사 후 조절의 고려가 중요하다.

3.3 희귀 세포의 단일 세포 분석

 단일 세포 분석은 줄기 세포와 같은 풍부하지 않은 세포를 특성화할 수 있다는 독특한 이점을 가지고 있다[47]. 대표적인 예는 소장의 항상성을 조율하는 LGR5+ 상피 줄기 세포이다. 차별적으로 분류된 줄기 세포를 추적하면 시간과 공간에서 소장의 구조, 역학 등의 분석이 가능하여 개별 세포의 발현 양상을 분석할 수 있는 플랫폼이 제공된다[48]. 이는 조직의 smFISH와 RNA-seq의 두 가지 보완적인 방법으로 수행되었다. SmFISH는 crypt에서 줄기 세포 마커의 공간적 분포, 전사 인자의 조절 동시 발현 및 조사 시 발현의 변화를 밝혀 냈다[49]. 이러한 단일 세포 연구의 가장 중요한 결과는 치료 효과에 관한 것이다. 단일 줄기 세포에서 체외에서 생산된 mini-guts는 손상된 장의 재생을 촉진하고 선암(adenocarcinoma)의 분자 기원을 밝혀준다.

4. 면역 세포에서의 단일 세포 분석 기술 및 전망

4.1 면역 시스템에서의 단일 세포 분석 연구기술

 면역 체계는 다양한 감염(박테리아, 바이러스 등)으로부터 유기체를 방어할 뿐만 아니라 상처를 치유하고 암세포를 제거함으로써 보호한다. 면역 반응의 효율은 각 단계에 관련된 다수의 상이한 세포의 조화 및 균형에 의존한다. 여기에는 병원균 인식, 다른 효과 세포(effector cell)의 모집으로 이어지는 신호 전달 개시부터 감염의 최종 치료가 포함된다. 1695년에 적혈구가 발견되고 1843년에 백혈구가 밝혀지기 시작하면서 기술이 발전함에 따라 혈액 구성에 새로운 차원의 복잡성과 더 많은 하위 범주가 추가되었다[50]. 최근 처리량이 많은 단일 세포 기술의 발전으로 정의된 하위 그룹 내에서도 구조적 및 기능적으로 중요한 이질성이 있음을 알게 되었다. 단일 세포 수준에서의 연구는 상향식으로 면역 세포 집단을 조사하며 이질성을 정량적으로 풀어낼 수 있게 한다[51].

지난 몇 년 동안 수많은 단일 세포 기술이 개발됨으로써 과학자들은 새로운 단일 세포 관점에서 세포질을 분석할 수 있었다. 이러한 기술은 전체 세포, 단백질 함량, DNA 및 RNA와 같이 세포 구성 요소를 4가지 주요 범주로 세분화될 수 있다. RNA, DNA 및 bisulphite의 시퀀싱은 분석 대상 인구에 대한 사전 지식과 무관하며 단일 세포 상태에 대한 포괄적인 그림을 제공하는 'OMICS' 기술이다. 다른 모든 기술은 적은 수의 미리 식별된 마커의 분석에 제한되는 한계를 공유한다. 적은 수의 유전자에 의존하는 것은 결과가 어느 정도 편향될 수 있고 일반적으로 분석된 과정을 제공하지 못한다는 단점이 있다. 또한 순환하는 종양 세포, 태아 순환 세포, 말초 혈액 및 골수에서의 조혈 줄기 세포와 같은 희귀 세포의 전사체/게놈 프로필에 초점을 맞춘 새로운 기술 중 필수적이며 항원 특이적 T 또는 B세포는 개체군에서 매우 낮은 빈도로 발생한다. 이 희소한 세포의 유전자 발현 프로파일은 이전 기술로 연구하기는 어려웠으나 현재 기술로 특정 세포 서브 클래스 내에서 이질성을 탐구할 수 있다.

4.2 단일 세포 분석 기술의 장단점

1990년, Iscove 연구팀에서 단일 세포로부터 mRNA의 정제와 증폭에 성공한지 25년 만에 큰 발전을 이루었다. 지난 20년 동안 기술 및 계산의 발전으로 인해 하나의 단일 세포에서 대부분의 유전자의 발현을 동시에 정량화할 수 있는 scRNA-seq 기술이 개발되었다. 하지만 단일 세포가 완전한 생물학적 복제는 가지고 있지 않다. 지난 6년 동안 5가지 주요 방법이 개발되어 mRNA를 역전사시키고 하나의 단일 세포에서 cDNA를 증폭시켜 보다 나은 적용 범위와 세포당 비용을 낮추었다[52,53]. 이러한 새로운 실험이 생성한 방대한 양의 데이터를 처리하기 위해 병렬 알고리즘이 개발되었다[54]. 이 새로운 기술은 신속하고 표준화된 계산 방법을 필요한 엄청난 양의 데이터를 생성함으로 데이터 해석에 중요하다. 데이터는 자동화된 방법을 사용하여 교정할 수많은 혼동 및 편향 요인에 의해 손상된다[55]. 이러한 한계를 극복하고 고유의 기술적 가변성을 계산하기 위해 다양한 기술 전략이 채택되었다. 예를 들어, 인공 핵산 DNA 및 RNA 표준 또는 시료를 통해 동일하다고 가정되는 스파이크인 외부 RNA 컨트롤 컨소시엄(ERCC) 분자의 추가 등이 있다. 세포당 mRNA 분자의 수, 각각의 분자는 무작위 DNA 서열로 개별적으로 표지되며, 시료 준비 방법에 따르면 유전자 발현 수준을 계산하기 위해 다양한 계산 방법을 사용할 수 있다[56, 57].

데이터 표준화 및 유전자 발현 수준 계산 후 감독되지 않은 클러스터링 접근법은 새로운 개별 하위 집단을 식별하는데 도움될 수 있지만 세포 상태 및 유형 간의 차별은 실험적으로 더 검증되어야 한다[58]. 표현형 변화가 없는 유전자 발현의 생리학적 변동과 상이한 세포 유형의 구분은 유전자 발현 패턴의 분석에 의해서만 이루어질 수는 없다. 단일 세포 분석 시 주요 문제 중 하나는 각 세포가 다른 세포주기 단계에 있을 수 있으며, 따라서 유전자 발현 양뿐만 아니라 크기 및 RNA 함량 측면에서도 변이를 나타낼 수 있다는 것이다. 방대한 데이터에서 완전히 평균화된 이 차이는 단일 세포 데이터에서 관찰되는 대부분의 편차를 설명할 수 있으며 수정이 필요하다[55]. 스트레스 조건 및 분석된 세포 집단 내에서 또 다른 수준의 가변성을 유발할 수 있는 다른 요인에 대해서도 마찬가지이다.

4.3 면역 체계의 이질성

 면역계에서 세포에 의해 나타나는 이질성은 극단적인 유연성과 가소성을 반영하여 면역 체계를 다른 병원체와 효과적으로 싸우게 한다. 1970년대 초반부터 면역 세포는 면역계의 기능을 수행하며 복잡성과 다양성의 수준이 커졌다. 다양성은 RNA 및 단백질 질 수준뿐만 아니라 DNA의 다양성을 포함한다. DNA 수준과 관련하여 인간 게놈은 약 3만 개의 유전자를 포함하고 있지만 T 세포 수용체(TCRs)의 수는 107개 정도이며 B세포 수용체도 유사할 것으로 추정된다[59]. 이 가변성은 B세포와 T세포에만 제한되는 과정인 DNA의 체세포 재조합에 의해 달성된다. 이러한 극단적인 상황은 진화가 레퍼토리의 가변성을 통해 수많은 병원체의 인식을 보장하는 방법을 선택했기 때문에 면역계의 이질성의 중요성을 시사한다. 면역 세포에 의한 특이적 신호 사이토카인(cytokine)의 분비는 유동 세포 계측법에 의해 정량화될 때 높은 비율의 다양성을 나타낸다. 1990년대 중반 연구 결과에서 Th2 세포와 비교하여 도움 T 세포 1 (T helper type 1; Th1)에 다른 자극 하에서 사이토카인의 합성 수준이 어떻게 다른지를 강조했다[60, 61]. 한 번에 두 개의 사이토카인만 보더라도 세포는 엄청난 세포 간 변이성을 나타낸다. 최근 유세포 분석 기술의 발전으로 세포 당 17개의 다른 매개 변수를 동시에 분석할 수 있게 되었다[62].

단클론 항체 기술의 출현 및 Th1과 Th2의 최초 구별과 함께 1980년대 초반에 CD4+ T 세포가 발견되어 T 도움(T helper) 아형이 훨씬 더 복잡해졌다[63]. 두 개의 주요 Th1과 Th2 그룹에서 시작하여 Th17 조절(regulator) T세포, 여포 도움(follicular helper) T 세포 및 최근의 Th9와 Th22 하위 세트와 같은 5개의 CD4+ T 세포에 존재한다[64]. CD4+ T 세포에 대한 지식은 단일 세포 기술을 사용하여 지난 몇 년 동안 크게 확장되었다. 예를 들어, 면역염색법과 결합된 단일 분자 RNA 형광 in situ hybridization은 CD4+ T 도움 세포 분화의 초기 단계에서 세포 외 사이토카인과 세포 내 전사 인자 사이의 상호 작용을 연구하는데 사용되었다[65]. 동일한 프로세스가 수학적 모델링과 통합된 기존의 유동 세포 계측법 염색으로 단일 세포 해상도에서 조사되었다. 이 두 연구의 결과를 통합한 결과, CD4+ T 세포 분화는 예상보다 다양하고, 세포의 운명 결정에 매우 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. 상호 배타적인 두 개의 마스터 조절자인 Gata3과 Tbx21는 세포의 사이토카인 신호에 의해 강한 영향을 받는 약한 세포 내 네트워크와 T 도움 세포의 혼합된 연속체가 공존하는 것으로 대체되었다. 또한 생체 내 중간 Th1/Th2 세포 유형의 존재는 일반적으로 불안정하다고 여겨졌으나 연구결과 매우 안정적이며 단순한 미결정 전구체로 간주될 수 없었다. 최근 Mahata 연구팀에서는 단일 세포 시퀀싱 기술로 확인된 Th2 하위 집단의 존재를 확인하였다. Th2 세포의 이러한 특정 서브 세트는 스테로이드 생합성의 기초가 되는 특정 효소(Cyp11a1)의 발현에 의해 나머지 집단과 구별된다[66]. 단일 세포 전사체학(tranomic) 접근법에 의해 얻은 포괄적인 데이터는 식별하였다. 대상 세포는 표적 분자에 대한 항체를 사용하여 전체 집단으로부터 분리되어 표적 분자의 발현은 세포질 효소의 발현과 상관 관계가 있으며, 발견된 새로운 세포 유형의 광범위한 생체외 기능 검증을 가능하게 한다. 이는 단일 세포 시퀀싱 접근법이 T 도움 세포 하위 클래스의 다양한 구성에 궁극적으로 밝혀낼 수 있는 방법의 첫 번째 예이다. 이는 발현 프로필 측면뿐만 아니라 세포의 기능적 특성 측면에서도 중요하다. T 세포 수용체 연구는 새로운 단일 세포 시퀀싱 접근법으로부터 큰 이점을 얻었다. 단일 세포 수준에서의 TCR에 대한 연구는 T 세포의 다른 아군의 특징인 다른 유전자의 발현에 대한 정보 없이 TCR-α 또는 TCR-β의 분석으로 제한되었다[67]. 최근 발표된 연구에서 α-chain과 β-chain sequence의 분석을 분화된 T 세포에 특유한 유전자 패널의 표현으로 결합시켰다[68]. 이 데이타는 동일한 TCR-α 및 TCR-β 서열을 갖는 T 세포가 어떻게 사이토카인 및 전사 인자의 발현에 상당한 차이를 나타낼 수 있는지를 보여 주었고, 동일한 전구 세포에서 유래한 T 세포가 실제로 다른 성숙한 T 세포로 분화할 수 있는지를 입증한 것이다.

4.4 면역 단일세포 분석의 향후 방향

scRNA-seq의 장점은 세포 하위 집단을 확인하는 것이다. 각 세포의 전사체(tranome)을 고려한 면역 세포 유형의 측정은 세포 상태가 비활성에서 활성으로 순차적으로 변화되는 경우가 많다. 세포 상태 간의 전이에 대한 단일 세포 전사체학 분석은 규제 메커니즘에 대한 새로운 통찰력을 나타낼 수 있다. 면역 세포 활성화 과정 및 가능한 중간 상태의 성질을 이해하면 이러한 과정의 스위치 역할을 하는 핵심 유전자의 동정이 가능하다. 예를 들어, 종양 관련 대식세포는 구조적으로 이질적이며 종양의 운명을 결정하는 데 기능적으로 중요하다[69]. 이 세포들은 항 종양 면역 억제의 원인으로 널리 알려져 있다. 종양이 침윤한 림프구와 골수 세포에 대한 단일 세포 연구는 새로운 통찰력과 암 약물 표적을 확인 방법으로 이어질 수 있다. 클러스터링 방법의 대안은 주성분 분석을 사용하여 세포 유형을 식별하는 것이다. 계층적 클러스터링 또는 주요 구성 요소 분석 방법을 사용하여 세포 상태를 정의하여 세포 전이를 연구할 수 있다. 이 접근법은 접합자에서 배반포(blastocyst)까지의 발달 경로를 따라 세포 변화를 확인하는데 적용되었다[70]. 향후 유사한 접근법이 생체 내 면역 세포 활성화/불활성화 역학 및 그 기능 장애에 적용될 수 있다.

세포를 통한 유전자 발현 수준의 다양성은 표현이 얼마나 엄격하게 조절되는지 정보를 제공한다. 골수로부터 유도된 수지상세포 활성화에 대한 scRNA-seq 기반 연구는 특정 유전자가 유전자 발현 양상을 보였다. 후속 연구에 따르면 빠른 반응을 보이는 수지상 세포의 부분 집합(paracrine signaling)이 전체 개체군에 영향을 미친다는 사실이 밝혀졌다[71]. 유사한 접근법에 따른 면역 세포 모집단의 다른 특정 그룹에 대한 향후 연구는 더 많은 통찰력을 제시할 것이다. 전체 전사 범위를 제공하는 일부 scRNA-seq 방법(Smart-Seq)을 사용하면 선택적인 접합 양식을 결정하고 정량화할 수 있다. 스플라이스 변이종의 차별적인 발현으로 인한 면역 세포 이질성은 여전히 연구 중이다. Shalek에 의하면 여러 유전자의 우세한 동형(isoform)이 다른 세포 집단간에 다름을 보여 주었다. 이 패러다임이 다른 면역 세포에서 더 보편적인지 혹은 효과적인 면역 반응을 형성하는데 기능적 역할 여부는 아직 밝혀지지 않았다. 유전자 발현의 세포 대 세포 다양성은 유전자 조절 상호 작용 및 유전자 조절 네트워크를 추론하는데 사용될 수 있다[72]. scRNA-seq 데이터를 사용하여 유전자-모듈 상관 관계를 계산하거나 세포의 유전자 발현 프로파일을 기반으로 유전자를 클러스터링 하여 유전자-조절 모듈을 추론할 수 있다. 이러한 접근법은 면역 반응에 중요한 역할을 하는 것으로 이미 알려진 유전자와 관련된 새로운 유전자를 밝힐 것으로 기대된다. 또한 스테로이드 생성 Th2 세포에서 특이적으로 농축된 세포 표면 수용체를 확인하기 위해서도 이러한 접근법이 적용되었다. 향후 이 접근법의 추가 적용은 면역학적 연구에 도움될 것으로 기대된다.

5. 결론

 새로운 단일 세포 및 단일 분자 영상 기술 및 분석의 개발은 유전자 발현 조절에 관한 생물학적 질문을 재조정하는 포인트가 되었다. 모든 세포는 세포 주기 현상을 비롯하여 외부 자극에 반응하기 위해 끊임없이 변화를 겪는다. 이러한 세포 프로그램의 정확한 실행은 많은 분자들 간의 동적 상호 작용에 의해 제공되는 유연성을 필요하다. 또한 전통적인 면역학적 기법을 사용하여 대량 면역 세포 집단을 평가할 경우 면역 체계의 구성적 및 기능적 다양성을 크게 과소 평가한 불완전한 시스템 수준의 견해가 제공된다. 세포-세포 간의 거대한 변동성과 새로운 분석 기술을 통한 데이터의 방출은 과학자들에게 방대한 자원임과 동시에 새로운 도전 과제가 된다. 보다 정교한 알고리즘, 빠른 프로그래밍 및 새로운 데이터 시각화 방법의 병렬 개발은 면역계 다양성에 대한 새로운 통찰력을 얻을 수 있게 해주었다. 이 놀라운 발전에도 불구하고 여전히 해결해야 할 여러 문제가 있다. 데이터 표준화는 일관성 있는 분석으로 수 많은 데이터 세트를 병합 및 비교할 수 있게 하여 단일 세포 중심 특성 분석을 가능하게 할 것이다. 단일 세포 수준 연구의 가장 핵심 목표는 단일 세포의 전사체학 및 프로테오믹스(proteomic) 프로파일의 통합일 것이다. 단일 세포 수준에서 단백질과 RNA 함량 사이의 정확한 상관 관계는 특히 면역 생물학 분야의 흥미로운 연구 영역이다. 생물학에서 공학에 이르는 다양한 분야의 시너지 효과를 통해 세포의 신진 대사와 생물의 진화를 이해하는 데 좀 더 보편화된 분석법이 개발될 것으로 기대해본다.

6. 참고문헌

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