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단일 세포 RNA 시퀀싱을 활용한 면역 세포 이질성 연구

< 목  차 >

1. 서론
2. 단일 세포 타겟 기술
3. 단일 세포 프로파일링 기술
4. scRNA-seq의 활용
5. 결론

1. 서론

박테리아에서 인간에 이르기까지 외부의 다양한 위협에 대한 적응을 통해 강력하고 유연한 방어 전략이 진화해왔다. 그 효과를 유지하기 위해, 면역 체계는 질병을 예방하고, 기억하며, 제거하기 위해 함께 작용하는 고도로 전문화된 세포 유형을 만들어냈다.

따라서 단일 세포 수준의 연구는 면역체계가 어떻게 많은 다른 병원체에 대해 광범위한 잠재적 반응을 일으키는지 이해하는 데 필수적이다. 최근에는 면역세포 다양성 연구에 객관적인 접근방법을 제공하는 차세대 염기서열을 이용한 단일 세포의 프로파일링 기술이 개발되고 있다. 본 총설논문에서는 기존의 단일 세포 기술에 대한 개요를 제시하고 그 장점과 한계에 대해 논한다. 또한 우리는 이러한 접근방식이 면역학적 반응과 질병에 대한 이해를 심화시킬 수 있는 방법을 탐구하고, 이 분야의 최신 동향과 잠재적인 미래 혁신에 대해 살펴본다.

2. 단일 세포 타겟 기술

단일 세포를 프로파일링하기 위해 현미경, 세포측정학, 분자생물학, 그리고 가장 최근에는 차세대 시퀀싱 기술들의 발전이 활용되었다. 이러한 접근법의 대부분은 면역세포 이질성을 분석하는것을 목표로 하는 연구를 위해 최적화되어 개발되었다. 각 기술들은 실험당 분석할 수 있는 세포의수(세포 프로파일링의 폭)와 검출할 수 있는 세포당 유전자의 수(세포 프로파일링의 깊이) 측면에서다르다.

타겟 기술은 형광 라벨로 표시된 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 형광체 또는 금속 결합 항체 또는 PCR 프라이머와 같은 알려진 분자 미끼(molecular bait)를 사용한다. 그리고 mRNA 발현 및 단백질 수준 검출 연구를 통해 사전 선택된 유전자로 분자적 집합 차원을 구성한다. 이를 수억에서 수백만 개의 세포에 걸쳐 평가하여 단일 세포 수준으로 유전자와 단백질을 프로파일링하게 된다. 예를 들어 유세포분석기(flow cytometry)의 발전으로 형광 항체를 이용하여 세포당 최대 17개의 단백질을 동시에 손쉽게 프로파일링 하는 것이 가능하게 되었다. 형광성 단백질의 스펙트럼 한계를 극복하기 위해 금속 결합 항체를 사용한 질량분석기(mass cytometry)는 한 번에 연구할수 있는 세포의 수가 크게 증가하면서, 세포당 약 40개의 단백질을 동시에 검출하여 프로파일링을 더욱 확장할 수 있다. 이러한 기술은 포유류 면역체계의 주요 세포 및 소규모 세포들의 형상을 발견하고 특징짓게 만들었다. 그러나 이런 기술의 적용은 사전 지식이나 추측에 의한 작업에 기초하여 선택된 소수의 파라미터로 제한되며, 이러한 파라미터의 프로파일링은 프라이머 설계나 단백질 특정 항체의 유전자 배열의 가용성에 따라 달라진다.

세포측정학의 대안으로 개발된 유전자 특이적 프라이머를 사용하면 단일 세포에 대한 정량적인 qPCR을 수행할 수 있으며, 이를 통해 단일 세포 mRNA 레벨의 형광 정량화가 가능하다. 단일세포 qPCR (sc-qPCR)은 샘플 라이브러리 준비나 심층 시퀀싱(deep sequencing)을 필요로 하지 않으며, 따라서 특히 특정 항체가 없는 경우에도 단일 세포 유전자 발현을 파악하는 빠르고 고도로 정량적인 분석을 제공한다. 상업용 미세유체(microfluidic) 기술은 현재 단일 분석에서 최대 96개의 프라이머 쌍을 함께 멀티플렉싱하는 데에 성공했으며, 실제로 이러한 접근방식은 개발 중인 면역체계의 분자 이질성을 해석하기 위해 매우 유용한 것으로 나타났다. 그러나 세포측정학 기반 접근법과 유사하게, qPCR 분석은 또한 사전 선택된 유전자 풀의 측정을 요구하는데, 이는 연구자의 편견이 개입되기에 새로운 유전자와 관심 단백질의 발견 가능성을 제한한다.

그 결과 차세대 염기서열화에 기초한 새로운 기법을 활용하여 편견이 없는 단일 세포에 대한 분자 프로파일링을 할 수 있는 새로운 방법에 대한 상당한 관심이 모아지게 되었다. 단일 세포RNA 시퀀싱(scRNA-seq) 접근방식의 개발은 객관적인 단일 세포전사체(transcriptome) 프로파일링을 통해 새로운 세포 상태, 단일 뉴클레오티드 다형성(polymorphism), 다양한 면역 글로불린 서열, 모델 이외의 유기체들의 전사체 연구 등을 가능하게 하였다.

3. 단일 세포 프로파일링 기술

대규모 RNA-seq는 마이크로어레이(microarray)를 대체할 수 있는 편견 없는 프로파일링 대안을 제공했지만, 이를 위해서는 수백만 개의 세포에서 얻어야 하는 mRNA 전사체 약 1μg 정도가 필요하다. 일부 초기 면역학 연구에서는 풍부한 백혈구 세포 집단을 사용했지만, 희귀 세포 집단을 연구하고 새로운 세포 상태를 발견하기 위해서는 더 낮은 세포의 양을 요구하는 RNA-seq 프로토콜의 개발이 필요했다. 특히 면역학 분야에서 이러한 새로운 RNA-seq 프로토콜은 마이크로어레이 데이터와 결합하여 100?1,000개의 면역 세포에서 분리된 RNA의 단 1ng만을 사용하여 다양한 희귀 세포 모집단의 프로파일링을 가능하게 하였다. 이로 인해 ‘Illumina Body Map Expression Atlas’, 39개의 뚜렷한 인체 면역세포 유형을 프로파일링한 DMAP (Differentiation Map) 프로젝트, 쥐의 면역세포 집합을 프로파일링한 면역 게놈 프로젝트 등 대규모 협업 데이터베이스가 생성되었다. 이러한 데이터 베이스는 잘 정의된 마커를 가진 세포 하위집합을 구분하기 위해, 여러 가지 세포 유형과 조건에 걸쳐 공통적으로 조절된 유전자의 모듈을 식별 기능을 제공하는 강력한 자원이다.

요구량이 적은 RNA-seq 프로토콜의 개발로 인해 단일 세포 레벨로 더 많은 최적화를 할 수 있는 길이 열렸고, 새로운 scRNA-seq 플랫폼의 폭발로 절정에 이르렀다. 각각 뚜렷한 장단점을 가진 많은 방법들이 사용 가능하기 때문에, 어떤 옵션이 특정 연구 문제를 다루는데 가장 적합한지 파악하는 것은 어려운 일이다. 사용 가능한 많은 옵션을 검토하여, 각 기술이 민감도 및 데이터 품질 측면에서 어떻게 다른지 살펴보고 이상적으로 적합한 생물학적 문제를 찾아야 한다.

과거의 scRNA-seq에 비해 현재의 기술들은 비용 및 규모 면에서 개선되었음에도 불구하고, 분자적 제한은 여전히 남아 있다. 예를 들어 역전사 과정에서 전통적인 폴리 T 프라이밍을 사용하지 않는 비코딩 RNA와 박테리아 RNA 때문에 비폴리아데닐화 RNA는 검출하지 못한다. 또한 개별 증폭 전략을 사용하는 프로토콜은 전체 전사체의 시퀀싱을 가능하게 하는 반면, 높은 처리량 멀티플렉스방법론은 3’ 끝에만 적용되며 스플라이싱 패턴이나 시퀀스 변형을 복구할 수 없다. 더욱이 가장 민감한 방법들조차도 극소량의 전사체를 탐지하는 데 어려움을 겪을 것이며, 이는 세포 하위집합들 사이의 미묘한 차이를 탐색할 때 제한적인 요인이 된다. 마지막으로 세포 사이의 전사체 측정은 세포의 행동을 유도할 수 있는 단백질 또는 후생유전자 이질성을 포착할 수 없으며, 따라서 scRNA-seq 결과는 세포의 분자표현형 중 일부만 설명한다. 이러한 한계들이 분자 기술과 나노기술에 대한 문제를 제기하지만, 그 분야의 급속한 발전이 이러한 우려를 해소하기 시작함에 따라 단일 세포 통합 프로파일링을 위한 총체적인 기술들이 생겨나고 있다.

그림 1. 다양한 세포 분리 및 전사체 증폭 방법을 사용하는 scRNA-seq 기술의 개요

4. scRNA-seq의 활용

scRNA-seq 기술이 개발되기 전에는 세포 표면 마커를 사용하여 새로운 세포 하위집합을 발견해왔다. 이러한 접근법은 강력했지만, 다양한 면역 세포 유형을 발견하기 위해서는 사전 추측이나 지식이 필요했다. 고차원 단일 세포 프로파일링 기술의 개발은 관심 있는 유전자와 단백질에 대한 사전 지식 없이 세포의 배열과 세포의 전사체 특징을 기반으로 세포의 그룹화를 가능하게 하는 대체적인 작업을 가능하게 했다. scRNA-seq를 사용하면 건강 및 질병에 관련된 면역세포 집단을 특성화하고, 면역 반응을 유도하는 확률적인 유전자 발현의 변화를 파악하며, 면역세포의 발생 경로를 재구성하는 연구를 수행할 수 있다.

특징적인 세포 하위집합 분석

지금까지 설명한 기술은 면역체계의 이질성을 파악하기 위한 강력한 접근법을 제공하였으며, 비정상 면역세포의 발견을 가능하게 하였다. 최근 많은 흥미로운 연구가 등장하였으며 scRNA-seq의 잠재력이 어떻게 다양한 시스템 전반의 건강 및 질병 상황과 관련된 세포 상태를 발견하는 데 활용되는지 충분한 예를 보여주었다. 최근 연구에서는 세포 표면 표현형이 질병과 관련된 세포의 상태를 정의하기에 충분하지 않다는 것을 입증하였으며, 질병의 진행과 선천적인 면역학적 과정을 연구하기 위한 새로운 scRNA-seq 방법을 제안했다. 면역 반응과 병원성(pathogenicity)의 주요 조절자를 발견한다면 다발성 경화증(multiple sclerosis)과 같은 면역 질환을 목표로 하는 새로운 치료제의 발견과 개발에 기여할 수 있다. 우리는 머지않아 새로운 혈소판 세포의 발견, 질병을 일으키는 추가적인 뚜렷한 면역 세포의 식별 그리고 면역 세포 종류와 상태의 '아틀라스'의 개발에 scRNA-seq가 사용될것으로 예상한다.

세포 집단의 이질성 분석

균질한 집단 내의 세포들 사이의 유전자 발현의 확률적 패턴은 어떻게 면역체계가 항상성과전투 감염을 유지하기 위해 그러한 광범위한 반응을 만들어 낼 수 있는지에 핵심이 될 수 있다. 확률적 이질성이 반응 폭을 제공한다는 증거는 세포 표면 마커를 사용하는 분석을 통해 이전에 밝혀졌다. 단일 세포 유전체 방법론의 개발로 면역 세포 집단 내에서 예기치 않은 잠재적으로 확률적인 가변성을 발견할 수 있었다. 또한 게놈 전반에 걸쳐 이러한 유형의 연구를 수행할 수 있는 흥미로운 가능성을 제기한다. 최근 연구에서는 다양한 유형의 감염에 대처하고 면역학적 자기 내성을 조절하는 메커니즘으로서 면역 세포의 가변성의 중요성을 강조하고 있다. 면역 체계의 추가 세포군에 단일세포 게놈학을 적용한다면 감염에 대한 체계적 반응과 많은 자가 면역 질병의 발병학(pathogenesis)에 대한 우리의 이해를 넓힐 수 있을 것이다.

세포 운명 결정 지점 분석

발생 과정은 세포의 분화와 특정 혈통 및 최종 세포 유형을 결정짓는 일련의 전사 과정상의 변화에 의해 주도된다. 단일 세포 분석을 사용하여 개별적인 세포 하위 유형을 탐지하는 능력을 이용하여, 최근 연구는 발생 과정이 과도 세포 상태의 연속체로 표현될 수 있다는 것을 보여주었다. 따라서 여러 발생 단계에 걸쳐 공평한 방법으로 세포를 포착한 다음 그 발생 과정을 재구성하는 것은 세포의 의사결정 및 분화를 연구하기 위한 독특한 방법론을 제공한다. Wanderlust라고 알려진 알고리즘은 주요 신호 전달 경로의 재배열 및 표면 단백질 표현의 변화를 따라 궤적을 그려서 세포운명을 결정하는 지점을 발견했다. 한 세포 상태에서 다른 세포 상태로의 분열되는 이러한 지점에대한 아이디어는 sc-qPCR 데이터에 적용되어, HSC (haematopoietic stem cell) 분화 계층의 재구성, 가장 초기의 HSC 분화 사건의 식별, MLL-AF9형 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukaemia) 관련 세포 계층의 검출이 가능해졌다. scRNA-seq는 표면 마커 이상으로 확장되는 분자 표현형에 대한 풍부한 데이터에 대한 접근을 제공하기에, 이러한 방법론을 확장할 수 있는 흥미로운 영역이다.

5. 결론

전문화된 다양한 세포 유형은 면역체계가 건강과 질병에서 광범위한 반응을 얻을 수 있게해준다. scRNA-seq 분석은 면역체계의 다양한 발생 과정의 계통을 재구성하는 것뿐만 아니라 정체불명의 세포 유형, 세포 상태 및 생물학적으로 의미 있는 세포 이질성을 편견 없이 발견할 수 있는 도구로 사용할 수 있다. 우리는 면역 레퍼토리와 분자 상태를 통합적으로 분석할 수 있는 개별 세포수준의 기술로 인한 최첨단 발전이 림프구 행동에 대한 이해를 심화시킬 것으로 예상한다. 특히 이러한 접근방식은 더 큰 데이터로 확장될 수 있다. 세포 배양과 마우스 모델 연구는 면역체계가 어떻게 작용하는지를 이해하는 데 그동안 유용했지만, 현재 실제 인간 조직의 프로파일링을 위한 도구가마련되어 있다. 이를 통해 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 크론병(Crohn's disease), 건선증(psoriasis) 등 메커니즘이 아직 명확히 알려지지 않은 자가 면역 현상과 염증성 물질에서의 면역 반응뿐만 아니라 건강한 인간의 면역 체계의 분석을 가능하게 할 것이다.

이러한 분야가 발전함에 따라, 세포의 다양한 표현형 매개변수와 그것의 표현형을 통합하는 중요한 기술적 진보를 상상해볼 수 있다. 예를 들어 골수에서 세포 국소화(localization)는 이후 세포 운명 선택에 중요한 역할을 하지만, scRNA-seq 분석을 수행할 때 세포 위치 및 미세 환경(microenvironment)에 대한 정보는 손실된다. 이 문제를 해결하기 위해, 새로운 계산법과 실험 방법의 개발은 우리가 배아나 조직 내에서 세포의 공간적 구조를 재구성할 수 있게 해줄 것이다. 한 연구에서는 in situ RNA 표현 패턴에 scRNA-seq 데이터를 통합함으로써 배아에서 세포의 국소화를 유추하였다. 또한 scRNA-seq와 HSC 렌티바이러스(lentivirus) 바코딩 전략을 결합하면 사용하여 동일한 세포의 혈통 및 전사체 정보를 통합할 수 있다.

새로운 기술은 단일 세포 프로파일링을 전사체 이상으로 확장하고 있으며, 게놈, 염색체, 메틸레이션 및 프로테오믹스 분석과 연계하여 개발되고 있다. 특히 흥미로운 것은 이러한 측정을 함께 다중화하는 전략이다. 이 전략은 동일한 세포에서 여러 분자 양식을 공동으로 프로파일링 가능하게 한다. 이러한 통합적인 전략은 우리가 풍부한 세포 표현형을 발견하여 정의하고, 건강과 질병 모두 에서 면역 체계에서 그들의 기능을 더 깊게 탐구할 수 있도록 해줄 것이다.

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