바이오인

[주간 건강과 질병 ㆍ 제13권 제23호]

 

샌드위치 효소면역분석법을 이용한 페스트 검사법 개발

 

 

최상윤, 전준호, 강병학, 이기은* (질병관리본부 감염병분석센터 고위험병원체분석과)

*교신저자

 

| 초록 |

페스트균(Yersinia pestis)은 페스트(Plague)를 유발하는 그람음성 간균이다. 페스트균은 공중보건 및 안전에 있어 매우 중요한 위험요인으로 고위험병원체로 분류된다. 페스트균 검출을 위해 항체 기반의 상용화 키트와 유전자 검출 검사가 이용되지만, 감염 초기 단계에서 페스트 환자를 혈청학적 검사법으로 식별하기에는 어려움이 있다. 따라서 민감하고 특이적인 페스트균 검출을 위해 비오틴-스트렙타비딘 기반 샌드위치 효소면역분석법(ELISA)을 개발하였다. 이 분석방법은 페스트균의 Fraction 1(F1) 캡슐 단백질 및 페스트균을 마우스 F1-단클론 항체와 비오틴이 표지된 토끼 F1-다클론 항체로 검출하였다. 생물학적 시료인 사람 혈청에서 F1 샌드위치 ELISA 분석방법의 최소 검출한계는 F1 단백질 17 pg/mL, 페스트균은 129.2 CFU/mL를 나타내었다. 또한, F1 샌드위치 ELISA 분석방법은 다양한 단백질, 독소 및 세균들과 교차 반응을 보이지 않았다. 따라서 F1 샌드위치 ELISA 분석방법은 페스트 환자의 확인진단에 도움이 될 수 있을 것으로 기대된다.

 

 

| 들어가는 말 |

페스트(Plague)는 그람음성 간균인 페스트균(Yersinia pestis)의 감염에 의해 유발되는 전신성 질환으로 피부의 혈소 침전으로 인하여 검게 변하는 증상 때문에 흑사병(Black Death)으로 잘 알려져 있다. 페스트균은 주로 야생 설치류에게 감염되는 질환으로 설치류 사이에 전파되다가 벼룩에 의해 사람에게 전염이 된다. 페스트균은 공중보건에 심각한 위협을 줄 수 있으므로 미국 질병통제예방센터(Centers for Disease Control and Prevention, CDC)에서는 ‘Tier 1 select agents’ 단계로 지정·관리하고 있다[1]. 페스트의 연간 발생률은 전 세계적으로 1,000~2,000 여건의 발생사례가 세계보건기구(World Health Organization, WHO)에 보고되고 있으며, 최근 2017년에는 마다가스카르(Madagascar)에서 페스트 환자가 2,417건 발생되었다 [2]. 페스트 확산을 막기 위해서는 신속, 정확하고 민감도가 높은 진단방법이 필수적이다. 본 글에서는 페스트를 신속하고 민감하게 검출할 수 있는 F1 샌드위치 효소면역분석법(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)에 대하여 소개하고자 한다.

 

 

 

| 몸 말 |

Fraction 1(F1) 단백질은 페스트균의 캡슐 항원으로 면역세포에 의한 식균 작용으로부터 페스트균을 보호한다[3]. F1 단백질은 숙주에 감염 시 발현 및 분비되며, V 단백질과 함께 페스트 백신의 주요 후보로도 알려져 있다[4]. F1 단백질은 페스트균에서만 발견되므로 페스트균을 식별하기 위한 특정 마커로 사용되고 있다[5,6]. 본 연구에서는 F1 샌드위치 ELISA 분석법 개발을 위해 페스트균의 F1 단백질에 대한 2가지 특이적 항체, 단클론 항체(1H4 F1 MAb)와 다클론 항체(F1 PAb)가 사용되었다. 검출 민감도의 증가를 위하여 비오틴-스트렙타비딘의 상호작용을 활용한 방법으로 비오틴이 표지된 다클론 항체를 제작하여 F1 샌드위치 ELISA 분석법을 개발하였다. F1 샌드위치 ELISA는 PBS 완충용액 및 사람 혈청에서 F1 단백질에 대한 최소 검출 한계 값이 각각 29 ± 4.7 pg/ml, 17 ± 2.6 pg/ml을 나타내었다. 페스트균에 대한 검출 한계를 결정하기 위해 추가 실험이 수행되었으며, PBS 완충용액 및 사람 혈청에서의 검출 한계 값은 각각 177.8 ± 30.2 및 129.2 ± 25.3 CFU/ml을 나타내었다(표 1). 이러한 결과는 F1 단백질과 페스트균에 대한 F1 샌드위치 ELISA의 검출 감도가 혈청과 같은 생물학적 시료에서 큰 차이를 보이지 않음을 확인하였다. 또한 현재 시판되고 있는 ELISA 키트(Tetracore)와 비교한 결과, F1 단백질과 페스트균에 대한 검출 한계 값이 상용화 ELISA 키트의 값보다 민감도가 높았다(자세한 결과는 이 글에 표시하지 않음). F1 샌드위치 ELISA 분석법이 PBS 완충용액과 사람 혈청에서 높은 민감도를 보임을 확인하였으므로 다양한 단백질, 독소, 세균들을 사용하여 F1 샌드위치 ELISA 분석법이 페스트균 및 항원을 특이적으로 검출 가능한지를 조사하였다. 다양한 항원(페스트균의 F1, V 단백질; 보툴리눔 A, B, E 형 독소; 파상풍 독소; 리신독소; 황색 포 도알균 장독 소 B형)과 세 균 (페스트균, 예르시니아 슈도투베르쿨로시스, 예르시니아 엔테로콜리티카, 폐렴간균, 대장균, 바실러스 세레우스, 바실러스 마이코이데스 및 녹농균)을 사용하여 F1 샌드위치 ELISA의 특이도를 확인하였다. 표 2에 보는 바와 같이 PBS 완충용액 및 사람 혈청에서 다양한 항원과 병원체들 중에서 F1 단백질과 페스트균을 특이적으로 검출할 수 있음을 확인하였다. 이러한 결과는 F1 샌드위치 ELISA 분석법이 다른 단백질과 병원체들이 교차반응을 하지 않음을 보여준다.

 

 

 

...................(계속)

 

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