기술동향
천연물 생합성 증대와 다양화를 위한 단백질 공학
- 등록일2020-12-30
- 조회수5350
- 분류기술동향
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자료발간일
2020-12-17
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출처
생물학연구정보센터(BRIC)
- 원문링크
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키워드
#단백질 공학#천연물#바이오센서#전사 조절체
- 첨부파일
pdf_0003657.pdf
천연물 생합성 증대와 다양화를 위한 단백질 공학
목 차
1. 서론
2. 단백질 공학을 통한 천연물 생합성 증가
2.1. Rate-Limiting 효소의 촉매 활성 증가
2.2. 효소 복합체 형성을 위한 Colocalization
2.3. 단백질 안정성 증가
2.4. 전사 조절체(Transcriptional regulators)를 이용한 바이오센서(Biosensor) 개발
3. 단백질 공학을 통한 천연물 생합성 다양화
4. 결론
1. 서론
지난 수십 년 간 의약품이나 미용 산업 혹은 식품 산업에서 천연물이 가지는 높은 부가가치로 인하여, 천연물 생합성을 조절하는 연구가 활발히 진행되어 왔고, 미생물이나 cell-free 시스템을 통한 생합성 연구의 발달이 두드러 졌다. 천연 효소, 모듈화된 유전자 발현(modularized gene expression), 다이나믹 조절(dynamic regulation) 등을 접목한 대사공학을 통해 지방산(fatty acids), 이소프레노이드(isoprenoids), 알칼로이드(alkaloids), 플라보노이드(flavonoids) 같은 천연물이나 천연물 파생물질(derivatives)의 생산이 가능해 졌다.
하지만, 천연물 생합성 과정에는 몇 가지 제약이 따르는데, 천연 효소를 생합성 경로(biosynthetic pathways)에 접목시킬 때 효소의 제한된 활성, 좁은 기질 반응(narrow substrate range), 낮은 안정성 혹은 이종 숙주(heterologous hosts)에서의 기능 손실 등을 예로 들 수 있고, 이들은 생합성 효율 증대나 천연물 다양화를 저해하는 요인으로 작용한다. 이러한 문제를 극복하기 위하여 천연 자원으로부터 기존의 효소를 대체할 수 있는 새로운 효소를 찾아내려는 노력이 이루어 졌으나, 이는 오랜 시간이 걸리고 노동 집약적이라는 단점이 따른다. 그렇기에 단백질 공학 기술을 이용하여 기존의 효소를 변형 및 향상 시키는 쪽으로 연구가 집중되었고, 본 리뷰에서는 이러한 연구의 최신 성공 사례를 정리하고 천연물 생합성 증가와 다양화를 위한 단백질 공학의 중요성을 다뤄보고자 한다.
2. 단백질 공학을 통한 천연물 생합성 증가
2.1. Rate-Limiting 효소의 촉매 활성 증가
천연물 생합성 과정에 있어서 주된 제약 요인 중 하나는 효소의 활성이다. 미생물 숙주로 이종 효소(heterologous enzymes)를 도입하는 과정에서 효소의 촉매 활성이 떨어지거나, 기능이 손실될 가능성이 존재하기 때문에, 효소의 활성을 더욱 증가 시켜 천연물의 생합성 과정을 촉진시키는 것이 단백질 공학의 주된 목적 중 하나이다.
단백질 공학에서 특정 기질에 대한 촉매 활성을 증가시키기 위한 대표적 방법으로는 무작위 돌연변이(random mutagenesis)가 있다. 효모에서 활성을 가지는 타이로신 수산화 효소(tyrosine hydroxylase)의 경우에는, 실수 유발 PCR( prone PCR) 기법을 이용한 무작위 돌연변이를 통해 촉매 활성이 4.3배 증가되었다.
이 타이로신 수산화 효소(tyrosine hydroxylase)가 L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) 카복실기 제거 효소(decarboxylase)와 함께 효모 숙주에서 발현(coexpression)될 경우, 새로운(de novo) 도파민(dopamine)이 합성 가능하다.
비슷한 예로, Saccharomyces cerevisiae로 부터 유래한 아이소펜테닐 이인산 이성질화 효소(isopentenyl diphosphate isomerase, IDI)의 촉매 활성이 PCR을 바탕으로 한 무작위 돌연변이를 통해 2.53배 증가되었고, 이를 라이코펜(Lycopene)에 적용하면 1.24g/L의 생산농도가 발생되는데, 이는 야생형(wild type) 효소를 사용할 경우에 비해 2.1배 높은 것으로 나타났다.
무작위 돌연변이를 이용한 방법은 방대한 효소 단백질 변이체 library의 구축이 동반되고, 이렇게 만들어진 대부분의 변이 효소들은 활성이 감소되거나, 사라지게 되는 것이 일반적이기 때문에, 신속하고 효과적인 선별을 위해 고효율 스크리닝(high-throughput screening)이 필수적이게 된다.
그러므로 구조적 분석을 바탕으로, 효소의 결합 위치(binding sites)나 활성부위(active pockets)를 중심으로 위치 특이적 돌연변이(Site-directed mutagenesis)를 도입하여 효소 활성을 증가시키려는 방법이 더 효율적일 수 있다 (그림 1).
최근에는 빠르게 발달된 컴퓨터를 이용한 분자 시뮬레이션(molecular simulation)기술이 단백질 공학에 많은 기여를 하였는데, 단백질의 결정 구조를 풀거나, 동족체(homolog)를 바탕으로 예측된 구조를 시뮬레이션하여 야생형 효소로부터 효과적인 아미노산 치환 대상을 찾는 것이 가능해 졌다.
Glyco-syltransferase UGT51의 경우, 구조적 분석을 바탕으로 한 합리적 설계(rational design)를 통하여, 효모 내에서 1800배 이상의 촉매 효율로 인삼에서 유래한 대표적 항암 물질인 진세노사이드 Rh2 (ginsenoside Rh2)의 생산이 가능했다.
뿐만 아니라, Rh2의 분해 경로를 차단하고 전구체인 UDP-glucose의 공급을 늘림으로써 생산 농도가 추가적으로 900배 이상 증가하여 최종적으로는 300 mg/L에 이르렀다.
택솔(taxol)의 중요 전구체 중 하나인 taxadien-5α-ol을 합성하는 taxadiene synthase의 경우, 컴퓨터 시뮬레이션을 활용한 위치 특이적 돌연변이를 통해 생산성이 2.4배 증가하였다.
비슷한 예로 Valliere와 그의 연구팀이 컴퓨터 모델링(computational modeling)을 통해 새롭게 디자인한 NphB 효소 변이체 olivetol acid 중, M23와 M31은 cannabigerolic acid (CBGA) 생산에 있어 효소의 Kcat 값을 1000배 가량 증가시키는 것으로 나타났다. M23는 흐름 제어(flow control)를 도입한 cell-free 시스템을 통해 olivetol acid (OA)와 glucose로 부터 CBGA를 최종적으로는 1.25 g/L의 농도로 합성이 가능했다.
또한, 기질 OA를 divarinic acid (DA)로 치환할 경우, 다양한 희소 cannabinoids의 전구체로 사용되는 cannabidivarinic acid (CBGVA)의 생산도 가능했다. M31은 M23에 비해 촉매 효율이 15배 이상 높기 때문에, M23 대신 M31을 사용하였을 경우, 1.74 g/L의 농도로 CBGVA가 합성 가능했지만, 생산량 증대(scaling up)가 용이하지 않은 cell-free 시스템의 특성상 추가적인 산업계 활용은 제한적이었다.
앞서 살펴 보았듯이, 생합성 경로에서 활성이 증가된 단백질 변이체의 도입은 천연물 생산을 비약적으로 증가시키고 획기적인 생합성 및 생물 약제학적 응용을 가능하게 한다. 단백질 공학을 이용하여 효소 활성을 증가시키는 연구는 그 동안 잘 발달되어 왔으나, 고효율 스크리닝이나 생물 정보학(computational biology) 같은 최근의 혁신적 기술이나 구조 생물학(structural biology), 생화학(biochemistry) 분야의 새로운 지식들의 활용이 필요한 것도 사실이다.
예를 들어, 결정 구조를 얻기가 까다로운 단백질 복합체(complex proteins)나 막 단백질(membrane proteins)에 대한 정보는 새로운 반응 기작(reaction mechanisms)을 찾는다거나, 단백질 공학 분야에 중요한 통찰력을 제공할 수 있다. 단백질 결정 구조나 컴퓨터를 활용한 분자 시뮬레이션은 효소의 특성 조절 연구를 위한 정밀한 아미노산 서열정보를 제공하는 데 필수적이 되었고, 더 많은 단백질의 구조 해석과 시뮬레이션 최적화는 단백질 공학을 위한 더욱 정확한 예측을 가능하게 할 것이다.
...................(계속)
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