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NGS를 활용한 새로운 분석 방법 및 활용 사례

◈ 목차

1. NGS (Next Generation Sequencing) 기술 및 정밀의료 시대의 도래

2. NGS 을 활용한 새로운 응용 기술

 2.1. Single cell sequencing

  2.1.1. Single cell DNA sequencing

  2.1.2. Single cell RNA sequencing

 2.2. Spatial transcriptome

 2.3. Proteomics

  2.3.1. Proximity Extension Assay (PEA)

3. 새로운 NGS 기술의 적용사례 및 한계점

4. 결론

5. 참고문헌

◈본문

1. NGS (Next Generation Sequencing) 기술 및 정밀의료 시대의 도래

 2003년 10여 년이 넘는 기간 동안 수조 원에 달하는 비용을 들여 인간의 모든 염기서열을 확인하는 전 세계적인 프로젝트인 ‘Human genome project’가 완성되어 세계에 발표되었다. 이렇게 완성된 염기서열 분석이 인간의 질병을 개선할 수 있을 것으로 수많은 과학자들을 비롯하여 대중들 또한 많은 기대를 하게 만들었다. 그러나, 하나의 개체의 유전정보를 가지고 있는 것으로는 질병 및 기전을 비교하기가 어려웠고 당시의 기술 및 비용으로는 각 인간의 개체의 차이를 구별하거나 질병 관련 변이를 찾는다는 것이 쉽지 않았다.

 Human genome project에서 사용된 염기서열 분석방법은 1977년 Fredrick sanger 연구진에서 개발한 직접염기서열분석방법 혹은 생어 시퀀싱(sanger sequencing)과 1988년 Craig Venter 연구진에서 사용한 샷건 시퀀싱(Shotgun method)으로 나눌 수 있다. 생어 시퀀싱 방식은 DNA를 구성하는 dNTP와 ddNTP의 비율을 섞어주어 전기영동으로 조각의 크기를 구분하는 방식이다. 이 방식으로 염기서열을 결정하는 데는 중간에 이루어지는 PCR 증폭 과정으로 인해 소요되는 시간이 비교적 높았으며, 인력 및 소모적인 비용을 고려할 때 비용 효율적인 부분을 고려하기 어려웠다. 반면 샷건 시퀀싱 방식은 DNA를 무작위로 커다란 절편화를 만들고 그에 대하여 겹치는 부분들을 이어나가는 방식이기 때문에 시간면에서 매우 빠른 분석이 가능하도록 만들었다 [1].

 샷건 시퀀싱 방법에서 나온 효율성을 바탕으로 다양한 연구기관과 회사에서 노력을 시작하면서 차세대 염기서열 분석법(NGS)이 개발되었고, 직접염기서열분석방법처럼 염기서열의 하나하나를 확인하는 것이 아닌, 유전체를 무작위적으로 절편을 만들어 일정 fragment를 통째로 읽고 매칭 할 수 있는 방식이 가능해지게 되었다.

 이를 기반으로 2004년부터 NGS 장비가 상용화되면서 범국가차원에서 진행하는 프로젝트의 스케일을 기관별, 연구소별 연구가 가능한 상황이 되었고, 2010년 Illumina사에서 HiSeq을 이용한 개인의 전장유전체 해석에 1,000만 원가량이 필요했다면 2017년에는 Illumina NovaSeq 6000 등의 장비가 출시되면서 개인 DNA 분석비용이 10만 원까지 도달하는 상황이 되었다 [2-3].

 이러한 가격 비용의 절감으로 인하여 현재는 수많은 개인의 유전체 분석이 가능해졌고, 개개인의 유전정보에 따른 특징을 규명하여 수많은 질환에서 유전변이와의 상관관계를 밝혀내고 있다. 특히 유전적인 차이를 확연하게 확인할 수 있는 암과 같은 질환의 경우 이미 변이 정보별로 암의 성질을 분류하고, 이러한 정보를 각 연구자들이 공유할 수 있도록 TCGA라는 플랫폼을 만들어 공개적으로 사용하도록 하였다. 이에 따른 맞춤형 항암제 투여가 이루어지고 있으며 개별적인 차원의 mutation을 시스템적인 변이 지수로 확인하는 방법 등이 개발 및 보완되고 있다. 전체 코딩 게놈에서 발생하는 체세포 변이(SNV 또는 INDEL)의 총개수를 카운팅 하여 메가베이스(megabase) 단위로 계산한 Tumor Mutation Burden (TMB)의 지표나, MLH1, MSH2, MSH6, PMS2 등 mismatch repair (MMR) protein의 발현을 비교하는 IHC 또는 PCR을 통해 암과 정상 조직에서 나타나는 microsatellite의 길이 또는 발현의 정도를 측정하는 Microsatellite Instability (MSI) 지표 등이 계속해 치료제의 반응성과 매칭이 되고 있고 그 외에도 세부적으로 정보가 확장되어 환자들에게 맞춤형 치료를 제공하는 정밀의료 시대가 본격적으로 도래하고 있다 [1-2].

2. NGS을 활용한 새로운 응용 기술

 NGS를 방식을 활용하여 유전체 정보를 얻는 기본적인 방식에는 DNA, RNA 정보를 읽는 방식이 있다. DNA를 읽는 방식에는 전장유전체를 모두 확인할 수 있는 Whole genome sequencing(WGS), Protein coding 영역인 exome 영역만을 보는 Whole exome sequencing (WES), 확인하고자하는 영역의 유전정보를 Panel 식으로 구성하여 보는 Panel sequencing, mRNA의 발현 총체를 확인할 수 있는 Whole transcriptome sequencing(WTS) 등이 있다. 이러한 정보를 Human 혹은 mouse에서 읽는 방법이 신약개발 및 연구목적으로 가장 많이 활용되고 있고 microbiome이나 bacteria 등에서도 다양한 목적을 가지고 사용되고 있다.

 이러한 NGS 방식의 기본적인 내용을 활용한 응용기술들이 개발되고 있으며 이를 통해 기존방식으로 확인할 수 있는 범위를 비약적으로 향상시키거나, 기존방식으로 확인할 수 없었던 분석들을 진행할 수 있게 되었다.

2.1. Single cell sequencing

 2012년 암에서 나오는 특이적인 변이에 따른 화학항암제의 저항성 및 암세포 타입별 차이에 대한 연구를 진행하기 위해 single cell 단위로 DNA sequencing을 한 사례가 Nature지에 대두되어 나오기 시작했다. 이것은 유전체 분석 기술의 향상과 더불어 데이터 처리속도 및 저장공간의 발달로 인하여 그동안 시도될 수 없던 부분이 현실화된 순간이었다.

 본 사례를 필두로 2010년 이후로 single cell 단위의 분석이 늘어나게 되었다. 암과 같은 heterogeneity가 높은 질환에서 유전적 변이 차이를 확인하기 위한 Single cell DNA sequencing 기술이 나오게 되었고, 각 세포 단위의 RNA의 발현 양상을 확인하는 기술도 개발되기 시작하였다.

 현재는 사람 및 동물, 미생물 등을 대상으로 한 NGS, FC, PCR, MS/MS, Micros 등 여러 기술에 사용되는 응용분석까지 사용되고 있으며, Science지에서는 최근 개발된 단일세포 시퀀싱 및 이미징 등 단일세포 분석기술이 새로운 과학적 발견을 가속화할 것으로 전망하고 있으며, 특히 단일세포 분석기술은 생물학, 면역학, 종양학에 매우 진보된 접근방식을 제공할 것으로 예상하고 있다 [4].

...................(계속)

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