바이오인

[주제목] 영국 디지털 헬스케어 성장 주목샌드위치 효소면역분석법을 이용한 보툴리눔독소증 실험실 검사법 개발

최은선1, 김소현1, 전준호2, 이화중1, 정윤석1* 

1질병관리청 감염병진단분석국 고위험병원체분석과, 2질병관리청 충청권질병대응센터 진단분석과

◈본문

초 록

  보툴리눔독소증은 이완성 신경마비 질환으로, 포자를 생성하는 그람양성의 혐기성 세균인 보툴리눔 균(Clostridium botulinum)에서 생성하는 강력한 신경독소에 의해 유발된다. 마우스 바이오어세이(mouse bioassay)는 보툴리눔 독소를 진단하는 국제 표준검사법으로 사용하고 있지만, 실험동물 사용으로 인한 윤리적인 문제와 결과가 확인될 때까지 긴 시간이 소요되어 신속하고 정확한 검사법의 개발이 필요하다. 본 연구에서는 보툴리눔 독소에 대한 생물테러 또는 보툴리눔독소증 자연발생 시 신속한 진단을 위해 보툴리눔 독소 A 또는 B 샌드위치 ELISA 키트를 개발하였다. 키트의 성능을 평가하기 위해 정상 사람 혈청에 독소를 첨가하여 민감도, 정밀도 및 특이도 검사를 수행하였다. 그 결과 독소 A와 B의 최소 검출한계는 각각 0.153 ng/ml와 0.027 ng/ml로 확인되었고, 키트 내, 키트 간, 실험자 간 반복성 및 재현성을 확인한 결과, 변동계수는 10% 미만으로 확인되었다. 특이도 실험에서는 다른 독소(보툴리눔 독소 E형, 파상풍독소, 황색포도알균 장독소 B형)에는 반응하지 않고 보툴리눔 독소 A와 B를 특이적으로 검출함을 확인하였다. 따라서 본 연구결과는 보툴리눔 독소 A 또는 B 샌드위치 ELISA 키트가 높은 민감도와 특이도를 가지며, 표준검사법과 유사한 수준으로 보툴리눔 독소의 검출과 모니터링에 유용한 도구로 활용될 수 있을 것으로 기대할 수 있다. 또한 보툴리눔독소증 의심 환자 검체에서 보툴리눔 독소를 신속하게 검출하여 치료방향에 대한 과학적 근거를 제시하는 효과적인 검사법으로 쓰일 수 있을 것으로 생각된다.

주요 검색어: 보툴리눔독소증; 보툴리눔 독소; 샌드위치 효소면역분석법; 마우스 바이오어세이

서 론

  보툴리눔 균(Clostridium botulinum )은 절대 혐기성의 그람양성 간균으로 토양과 물에서 발견되며, 혈청학적으로 A–G까지 7가지 독소를 생성한다. 이 중 독소 A, B, E와 F형에 의해 인간 보툴리눔독소증(botulism)이 유발되고, 이완성 신경마비 및 호흡곤란 등 심각한 증상을 초래한다. 보툴리눔 독소는 지구상에 알려진 가장 강력한 독성물질로 보고되고 있으며, 미국질병통제예방센터(U.S. Centers for Disease Control and Prevention)에서는 생물테러에 가장 위험한 카테고리 A 물질로 분류하고 있다. 국내에서는 2002년부터 보툴리눔 독소증을 제4군 법정감염병으로 지정하였고 2010년, 감염병의 예방과 관리에 관한 법률이 개정됨에 따라 보툴리눔 균이생물테러에 악용될 수 있는 ‘고위험병원체’로 지정되어 병원체 관리와 보툴리눔독소증 환자 발생에 대한 감시 및 실험실 진단이 한층 강화되었다. 보툴리눔독소증 환자는 전 세계적으로 드물지만 매년 지속적으로 발생하고 있다. 미국의 경우, 한 해 동안 100명에서 200명 이상의 환자가 발생하고 있고 발생 환자의 45% 이상에서 A와 B형 독소가 검출되었다. 우리나라의 경우 2003년부터 2023년까지 총 11명의 보툴리눔독소증 환자가 발생하였으며 환자의 30% 이상이 A와 B형 보툴리눔 독소에 감염된 것으로 확인되었다. 보툴리눔독소증 실험실 진단법으로 사용되는 마우스 바이오어세이(mouse bioassay)는 동물을 이용하여 4가지 독소형(A, B, E,F)을 민감하게 검출할 수 있는 표준검사법(gold standard)으로, 20 pg/ml 농도의 보툴리눔 독소를 검출할 수 있을 정도로 매우 민감한 검사법이다. 그러나 검사를 위해 최소 4일의 시간이 소요되기 때문에 보툴리눔독소증 의심 환자 발생시 독소 노출 초기에 신속하게 진단함으로써 추가적인 피해를 최소화하기 위한 진단검사법이 필요하다. ELISA (enzymelinked immunosorbent assay)는 감염병 병원체의 단백질뿐만아니라 독소형 확인 및 독소 정량을 위하여 가장 널리 사용되는 in vitro 검사법 중 하나로 항원-항체 결합을 기반으로 하는 검사법이다. 그 중 샌드위치 ELISA법은 독소 검출을 위하여 보툴리눔 독소의 특이적인 capture와 detection 항체를 사용하며 독소를 민감하게 검출할 수 있다. 본 연구에서는 보툴리눔독소 A 또는 B를 신속하고 민감하게 검출할 수 있는 샌드위치 ELISA 키트를 개발하였고 이를 실제 검체 등으로 검증하여 향후 표준검사법을 보완하기 위한 검사법으로 활용하고자 한다.

방 법

1. 개요

  질병관리청 고위험병원체분석과에서는 보툴리눔 독소 A 또는 B의 샌드위치 ELISA 키트를 자체 제작하여 보툴리눔독소증 실험실 검사에 사용하고자 하였다. 이 키트는 보툴리눔 독소 A와 B를 각각 검출할 수 있는 특이 항체인 단클론 항체와 다클론 항체를 제작하여 사용하였고, 독소 검출 민감도를 높이기 위해 비오틴-스트렙타비딘의 상호작용을 활용하는 방법으로 다클론 항체에 비오틴을 표지하였다. 샌드위치 ELISA 키트를 검증하기 위해 수행한 민감도, 정밀도 및 특이도 검사는 1:100으로 희석된 human serum (Sigma Aldrich) 제품에 보툴리눔 독소(Metabiologics)를 첨가하여 검체로 사용하였다.

2. 보툴리눔 독소 A 또는 B의 다클론 및 단클론 항체 제작

1) 다클론 항체 제작

  보툴리눔 독소 A 또는 B의 다클론 항체 제작을 위해 New Zealand white 토끼를 이용하여 2주 간격으로 alkylation 또는 formalin으로 불활화된 독소 A와 B (항원) 100 μg을 각각 토끼 피하에 3회 면역하였다. 1차 면역은 complete freund’s adjuvant와 항원, 2차 면역은 incomplete freund’s adjuvant와 항원을, 그리고 3차 면역은 면역 보조제 없이 항원만 면역하였다. 3회 면역 후 토끼 혈청에서 항체를 분리하였고, ELISA를 이용하여 보툴리눔 독소 A 또는 B 항원에 대한 항체가를 확인하였다. 항체가가 확인된 보툴리눔 독소 A 또는 B의 다클론 항체는 비오틴을 표지하여 각 키트의 detection 항체로 사용하였다.

2) 단클론 항체 제작

(1) 보툴리눔 부분독소 A 또는 B 항원 제작

  보툴리눔 독소 A 또는 B 중쇄의 C-terminal receptor binding domain (HCCA 또는 HCCB)을 암호화하는 염기서열을 각각 화학 합성하여 제작한 후 pET19b벡터에 삽입하여 클로닝하였다. pET19b-HCCA 또는 pET19b-HCCB DNA는 E. coli BL21(DE3) 균주에 각각 형질 전환 후, 균에서 HCCA 단백질을 분리 및 정제하였다.

(2) 보툴리눔 독소 A 또는 B 단클론 항체 제작

  단클론 항체 제작을 위해 분리 및 정제한 항원 HCCA 또는 HCCB는 마우스 발바닥에 각각 100 μg씩 1주 간격으로 3–4회 동일 양을 면역하였다. 면역 완료 후 마우스 혈청 내 ELISA titer 값이 높은 마우스를 선별하여 림프절에서 림프구를 분리하고 sp2/0 myeloma 세포와 융합시켰다. 선택배지를 이용하여 융합된 세포를 선별하고 ELISA를 통해 흡광도 값이 높은 보툴리눔 독소 A 단클론 항체 22B3과 보툴리눔 독소 B 단클론 항체 19B7 생산 세포를 선별하였다. 선별된 세포에서생산된 보툴리눔 독소 A 또는 B의 단클론 항체는 각 키트의 capture 항체로 사용하였다.

...................(계속)

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