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노벨상 수상 이후, 유도만능줄기세포(iPS cell)의 임상적 응용

◈ 목차

1. 서론(들어가며)

2. 줄기세포(pluripotent stem cell)란 무엇인가?

2.1. 배아줄기세포(embryonic stem cell)

2.1.1. 줄기세포 배양액

2.1.2. 줄기세포 계대배양(passage)을 위한 reagent

2.1.3. 줄기세포 배양을 위한 matrix

2.1.4. 줄기세포 cryopreservation media

2.2. 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell)

3. 임상 시험을 위한 줄기세포의 품질관리(Quality Control)와 CMC(Chemistry, Manufacturing,

and Controls)

4. 대표적인 iPSC 관련 기업들

5. 진행 중인 임상시험들

6. 결론(글을 마치며)

7. 참고문헌

◈본문

1. 서론(들어가며)

21세기를 맞이한 현대의학은 유전자 치료와 세포 치료의 발전으로 말미암아 재생 의학(regenerative medicine)의 신기원을 이루게 된다. 넓은 의미의 재생의학은 선천적인 유전질환이나 후천적인 de novo 돌연변이에 의한 유전적 변형으로 생성된 유전질환의 치료 또는 불의의 사고나 퇴행성 질환으로 인해 기능성을 상실한 인체의 기관이나 세포를 완전한 기능을 가지고 있는 정상적인 세포 혹은 기관으로 치환하여 질병을 치료하는 것을 목표로 하고 있다. 이전에는 유전자 치료와 세포 치료를 구분 지었지만 점차 이러한 두 가지 치료 방법이 그 장벽을 허물며 하나의 치료법의 개념으로 발전되어오고 있다.

재생 의학, 특별히 세포치료의 발전에 이바지한 커다란 기념비적 사건들을 꼽아보자면 줄기세포(stem cell)의 발견과 역분화(reprogramming)를 이용한 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell)의 개발 그리고 CRISPR-Cas9을 이용한 유전자 편집기술의 발전이다. 

1990년 시작되어 2003년 1차적으로 사업을 마쳤던 Human genome project로 말미암아 인간의 유전체에 대한 보다 정밀한 정보를 얻게 되었고 현재는 인간 전체 게놈(genome)의 정확한 모든 정보를 가질 수 있게 되었다. 또한 이를 바탕으로 한 유전자의 편집 기술도 본격적으로 개발되기 시작하였다. 1세대 편집 기술인 Zinc Finger Nuclease (ZFN)와 2세대 Transcription Activator-Like Effector

Nucleases (TALEN)은 특정 유전자(DNA)에 맞추어 이를 인식할 수 있는 고유한 nuclease를 매번 새로 디자인해서 개발해야 했고 따라서 이를 바탕으로 한 치료제의 개발은 오랜 시간과 많은 비용을 필요로 하였다. 하지만 CRISPR을 이용한 Cas9은 유전자 편집을 위한 단백질은 공통적으로 사용하면서 유전자를 인식하는 guide RNA을 이용해 유전자의 편집이 이루어지기 때문에 이전 세대의 유전자 편집 기술과 비교할 수 없을 정도로 간편하게 질병 치료에 적용할 수 있게 되었다.

줄기세포(stem cell)란 용어의 등장과 이와 관련된 연구는 다윈의 종의 기원에서 유래된 진화론만큼이나 오래된 역사를 지니고 있다. 하지만 1996년 세상을 깜짝 놀라게 했던 복제양 돌리 [1]와 1998년 Dr. James Thompson에 의해 발표된 배아줄기세포(embryonic stem cell)의 배양 방법 [2]의 개발은 줄기세포 연구에 커다란 출발점이자 효시가 되었다. 이처럼 다양한 연구들의 물줄기가 많은 연구자들에 의해 reprogramming이라는 하나의 주류를 형성하게 되었고 2006년 마침내 Dr. Yamanaka에 의해 4가지의 전사인자(transcription factor)인 c-Myc, Klf4, Oct4, Sox2를 발현시켜 완전하게 분화된 체세포(somatic cell)인 mouse와 human의 상피세포(fibroblast cell)를 배아세포(embryonic stem cell)와 같은 성격의 줄기세포로 역분화 시킬 수 있다는 사실을 “Cell” [3, 4]에 처음으로 발표하면서 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPS cell)가 세상에 등장하게 되었다. 이후 많은 연구자들에 의해 유도만능줄기세포를 생산하는 기술뿐만 아니라(Dr. Yamanaka에 의해 발견된 c-Myc, Klf4, Oct4, Sox2 뿐 아니라 Nanog [5], Lin28 [5], Glis1 [6] 등이 후에 발견되지만 Dr. Yamanaka의 4가지 유전자가 현재도 reprogramming에 가장 많이 사용되고 있다) 유도만능줄기세포를 이용한 특정 세포로의 분화기술이 함께 발전하면서 세포 치료법으로의 가용 범위가 급격하게 확대되었다. 그 결과 Cell에 논문을 발표하고 단지 6년이 지난 2012년에 Dr. Yamanaka는 그 공로를 인정받아 노벨 생리의학상을 수상하게 된다. 일반적으로 노벨상 수상자들이 관련 논문을 처음 발표하고 20-30여 년이 지난 후에야 그 업적을 인정받아 상을 수상하게 되는 이전의 관례에 비추어 보면 Dr. Yamanaka의 노벨상 수상은 얼마나 큰 영향력을 생명과학과 의료 분야에 미치게 되었는지 가늠해 볼 수 있다.

2.줄기세포(Pluripotent stem cell)란 무엇인가?

줄기세포(pluripotent stem cell)는 발생 이후 분화를 마친 성체 세포와는 다른 뚜렷한 특성들을 지니고 있다. 대표적인 줄기세포의 특징은 크게 두 가지로 자가재생산(self-renewal) 능력과 다분화능 (pluripotency)을 들을 수 있다. 첫째, 자가재생산(self-renewal)이란 줄기세포가 줄기세포 고유의 특성 인 다분화능을 잃어버리지 않은 채 자신과 같은 특성을 지닌 세포로 끊임없이 무한 재생산이 가능한 것을 의미한다. 둘째, 다분화능(pluripotency)이란 줄기세포가 이러한 특성을 가지고 계속해서 세포분 열을 통해 재생산하다가 특정한 환경이나 조건을 만나게 되면 내배엽(endoderm), 중배엽(mesoderm), 그리고 외배엽(ectoderm)과 같은 여러 다른 계통(lineage)의 세포로 분화가 이루어질 수 있음을 의미 한다. 즉 분화능의 정도에 따라 줄기세포는 pluripotent stem cell (embryonic stem cell과 induced pluripotent stem cell과 같이 모든 세포로의 분화가 가능한 줄기세포), multipotent stem cell (hematopoietic stem cell과 같이 특정 계통으로의 분화가 이미 결정되어 특정 계통의 세포로만 분화가 가능하며 다른 lineage로의 분화는 불가능한 줄기세포), unipotent stem cell (muscle stem cell과 같이 이미 분화가 결정된 상태의 줄기세포로서 같은 lineage의 다른 세포로 분화도 되지 않고 오로지 특정 세포로의 분화만 가능한 줄기세포)로 구분할 수 있다. 여기서는 대표적인 pluripotent stem cell인 embryonic stem cell과 induced pluripotent stem cell에 대해 조금 더 알아보고자 한다.

2.1 배아줄기세포(Embryonic stem cell)

배아줄기세포는 배반포(blastocyst)의 내부세포괴(inner cell mass)에서 유래해 세포분열과 분화 를 통해 배아 단계의 발생을 거쳐 궁극적으로 하나의 생명체를 만들어 가는 생명의 기원과도 같은 존 재이다. 다만 인간의 배아는 난자와 정자의 수정 후 4-5일 지나 배반포(blastocyst)의 단계에 이르러 생성이 되며, 이러한 배반포(blastocyst)가 자궁에 착상이 된 이후부터 본격적인 생명체로의 발생이 시 작된다. 이러한 점에 비추어 보면 배아줄기세포는 초기 착상의 전 단계에서 얻어지는 세포로 아직 완 벽한 생명체의 단계에 이르렀다고 보기는 어렵다. 하지만 이러한 배아줄기세포는 근본적으로 하나의 생명이 될 수 있는 큰 가능성을 지니고 있는 배아의 희생을 전제로 이루어지기 때문에 끊임없이 생명 윤리적 문제점이 야기될 수밖에 없다. 

체세포 핵이식(somatic cell nuclear transfer, SCNT)은 수정이 되지 않은 난자의 핵을 제거한 이 후 환자의 체세포(somatic cell)에서 추출한 핵을 이식해 만들어지는 환자 맞춤형 줄기 세포의 효시이 자 배아줄기세포의 생명윤리 문제를 해결할 수 있는 가장 좋은 대안이었다. 이러한 SCNT의 실험 방 법은 비교적 오랜 역사를 지니고 있다. 앞서 언급했던 복제양 돌리 [1]가 바로 이러한 SCNT 방식으 로 만들어졌고, 2004년 전 세계의 화려한 스포트라이트를 받았던 황우석 교수의 연구도 이러한 SCNT 방식을 이용해 만드는 줄기세포 연구였다. SCNT 방식은 환자의 세포에서 추출한 핵을 이용해 만들어 지는 줄기세포이기 때문에 기본적으로 생성된 줄기세포는 환자의 유전정보(genetic information)를 고 스란히 지니고 있다. 따라서 이식 후 환자의 면역 거부 반응이 일어나지 않는 환자 맞춤형 줄기세포 의 신기원이자 세포 이식 후 발생하는 면역 거부 반응을 야기하는 배아줄기세포의 단점을 보완할 수 있는 매우 획기적인 방식의 연구였다. 문제는 핵치환 이후 인위적인 발생 유도를 위한 활성화 과정이 필요한데 여기서 비롯되는 다양한 스트레스가 정상적인 배아줄기세포로의 성공률을 극단적으로 낮추 어 상용화가 불가능하다는 것이다. 또한 2004년에 “Science”에 발표했던 황우석의 연구는 연구윤리 위반과 조작으로 판명되어 한국 줄기세포 역사에 커다란 오점으로 장식되고 만다. 다만 10여 년의 세 월이 지난 이후 Oregon 대학의 Mitalipov [7] 교수 그룹에 의해서 이러한 방식의 배아줄기세포의 생산 이 전혀 불가능한 것은 아니었음이 입증되었다. 과학사에 만약이라는 가정이 있을 수 없지만 그래도 만약 황우석과 그의 연구팀이 보다 정직하게 차근차근 연구의 업적을 쌓아 갔다면 한국 줄기세포 연 구의 위상은 지금보다 더 높아졌을 것이며, 많은 한국의 기업들과 연구진들이 전 세계의 재생의료 표 준화에 이바지하며 시장을 주도해 나가지 않았을까 하는 아쉬움이 남는다. 

앞서 언급한 대로 배아줄기세포는 줄기세포의 생성을 위해서 잠재적으로 태아의 희생이라는 윤리적 문제를 태생적으로 안고 개발되었기 때문에 종교와 윤리적 문제에서 오는 여러 가지 연구의 제약과 반대를 극복해야 하는 문제를 가지고 있을 수밖에 없다. Dr. James Thompson에 의해 만들어진 첫 번째 배아줄기세포 이후로 다양한 인간 배아줄기세포주가 많은 연구자들에 의해 만들어지고 있다. H1과 H9은 Dr. James Thompson에 의해 만들어진 대표적인 배아줄기세포이며 이를 이용한 여러 퇴행 성질환 [8-10]의 세포치료 연구가 관련 연구 초창기에 많이 사용되었다. 

1998년 Dr. James Thompson에 의해 배반포(blastocyst)의 내부세포괴(inner cell mass)에서 분리 된 배아줄기세포를 in vitro상에서 배양하는 것이 가능하다고 밝혀졌고 [2], 이러한 배양 기술을 발전 시켜 현재는 배아줄기세포를 이용해 세포치료제로 개발하기 위한 FDA의 기준을 충족시키는 다양한 배양액과 실험 기법들이 개발되었다. 초창기 배아줄기세포의 배양을 위해서는 mouse embryonic fibroblast (MEF)를 matrix로 이용하여 배아줄기세포의 지지체 역할을 해 주어야 했으며 serum 대체 제인 knock-out serum replacement (KOSR)를 함유하고 있는 배양액을 사용했었다. 또한 배아줄기세 포의 계대배양(passage)을 위해서는 glass pipette을 이용해 사람의 손으로 줄기세포 colony를 하나 씩 잘라서 옮겨주는 manual pick-up 방식이 사용되었기 때문에 고도로 훈련을 받은 연구원과 과학 자들에게만 배양이 허락되는 매우 진입 장벽이 높은 연구 분야이기도 하였다. 하지만 현재는 많은 연구자들이 비교적 손쉽게 접근할 수 있는 다양한 배양법이 개발이 되었다. 관련 내용을 조금 더 살 펴보고자 한다.

2.1.1. 줄기세포 배양액

배아줄기세포와 유도만능줄기세포는 줄기세포의 특성을 유지하기 위해 까다로운 배양조건을 요구한다. 또한 줄기세포는 다른 배양 세포들과는 다른 에너지 메타볼리즘을 이용하기 때문에 이로 인한 배양액 개발에 필요한 다양한 고려사항이 존재한다. mTeSR와 같은 feeder cell이 필요하지 않은 defined medium뿐 아니라 E8과 같은 chemically defined medium도 개발되어 상용화되고 있다. StemCell Technologies에서 생산 판매하고 있는 mTeSR는 Dr. James Thompson과 그의 실험실에서 박 사후 연구원(post-doctorial fellow)으로 있던 Dr. Tenneille Ludwig에 의해 처음으로 개발되었다 [11]. 이는 처음으로 MEF와 같은 feeder cell이 필요하지 않으며 또한 배양액의 성분을 정확히 알고 있는 defined media 개발의 효시가 되었으며 이로 인해 배아줄기세포와 유도만능줄기세포를 배양할 수 있 는 표준화를 제공했다는 점에서 줄기세포 연구의 또 다른 혁신이었다. 이후 Dr. James Thompson은 StemCell Technologies에 license out을 통해 상용화에 성공하게 되었고 현재 줄기세포 연구자들에게 가장 많이 사용되고 있는 세포 배양액이 되었다. mTeSR가 “modified Te (Tenneille)’s secrete recipe”의 약자라는 사실을 아는 이들은 그리 많지 않다. Dr. Tenneille Ludwig는 WieCell에 Director로 일하고 있 으며 올해는 ISSCR (International Society of Stem Cell Research) board member로 추천되어 줄기세포 상용화의 표준화 작업에 큰 기여를 하고 있다. mTeSR에서 한 걸음 더 나아간 chemically defined medium는 E8 media이다. 이는 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)/F12을 기본 배지로 사 용하여, 64 mg/L L-ascorbic acid-2-phosphate magnesium, 14 μg/L sodium selenium, 100 μg/L fibroblast growth factor (FGF)2, 19.4 mg/L insulin, 543 mg/L NaHCO3, 10.7 mg/L transferrin, 2 μg/L transforming growth factor (TGF)β1만을 첨가하여 만든 배양액이다 [12]. 단지 8가지 조성으로 구성된 배양액인 만큼 표준화에는 용이한 측면이 있으나 이러한 간혹 minimal 배지가 줄기세포 배양에 충 분하지 못한 환경을 만들어 세포 배양에 어려움이 있기도 하여 호불호가 있는 배양액이다. 이후 E7 media 등 점차로 배지 조성 성분을 줄여 나가는 연구를 점차적으로 시도했으나 이러한 제품들은 줄 기세포의 특성을 유지한 채로 안정적으로 세포를 성장시키는데 문제가 발생하여 성공적으로 상업화 가 되지는 못하였다.

2.1.2. 줄기세포 계대배양(passage)을 위한 reagent

줄기세포 배양을 위해서 mouse embryonic fibroblast (MEF)를 이용한 matrix와 serum 대체제인 knock-out serum replacement (KOSR)를 함유하고 있는 배양액을 사용했던 1세대의 줄기세포 연구자들에게는 계대배양(passage) 역시 쉽지 않은 일이었다. 계대배양(passage)을 위해서는 현미경 아래 에서 줄기세포 콜로니를 하나하나 직접 눈으로 관찰하면서 유리 파이펫이나 파이펫 팁등을 이용해 물리적으로 줄기세포 콜로니를 자르는 manual pick-up 방식을 사용하였기 때문이다. 다른 세포주들 과 달리 Trypsin과 같은 enzyme을 이용해서 계대배양을 할 경우 세포에 손상을 입어 계대배양 (passage) 이후 배양이 되지 않거나 pluripotency를 잃어버려 분화가 돼버리기 때문이었다. 하지만 현재는 계대배양을 위해서 사용되었던 manual pick-up 방식이 아닌 EDTA-based reagent 개발로 줄 기세포의 분화능에 영향을 미치지 않으면서 비교적 쉽게 계대배양(passage)이 가능해졌다. 대표적인 EDTA-based dissociation buffer는 StemCell Technologies에서 개발된 ReLeSR와 Thermo Fisher Scientific에서 개발된 Versene을 꼽을 수 있다. Dispase와 accutase 같은 trypsin에 비해 활성이 약한 여러 가지 enzyme들이 그동안 개발되어 사용이 되어왔지만 계대배양(passage)을 위해 enzymatic dissociation buffer를 이용해 single cell로 dissociation 하는 방식은 배아줄기세포 표면에 특이적으로 발현하는 surface marker들인 단백질에 문제가 되기도 하며, 이로 인한 genomic instability의 영향으 로 abnormal karyotyping이 발생하기 때문에 좋은 quality의 배아줄기세포를 유지하는데 어려움을 발생시킨다 [13-15]. 따라서 enzymatic dissociation buffer를 이용한 single cell passage 방식이 아닌 EDTA-based dissociation buffer를 이용한 clump passage를 통해 세포를 유지하는 방식을 사용해야 한다.

2.1.3. 줄기세포 배양을 위한 matrix

배아줄기세포와 유도만능줄기세포의 배양에 필요한 다양한 matrix의 개발로 인해 mouse embryonic fibroblast(MEF)를 이용한 matrix를 대체하게 되었고 임상시험에 필요한 기준들을 충족시 켜 줄 수 있는 배양법이 완성되었다. Mouse embryonic fibroblast (MEF)가 1세대 matrix였다면 현재 많이 사용되고 있는 matrix는 Corning에서 개발된 Matrigel과 Thermo Fisher Scientific에서 개발된 Geltrex이다. Corning의 Matrigel과 Thermo Fisher Scientific의 Geltrex는 모두 Murine EngelbrethHolm-Swarm sarcoma(종양)에서 유래된 추출물로 mouse embryonic fibroblast (MEF)를 대체하는 2세 대 matrix로 많은 연구자들에 의해 사용되고 있다. 하지만 이 역시 mouse 유래일 뿐 아니라 종양에 서 추출된 matrix이기 때문에 임상적용을 위해서는 여러 가지 제약과 한계를 가지고 있다. 최근에는 이러한 한계점을 극복하고자 rhLaminin-521와 Vitronectin과 같은 재조합 단백질(recombinant protein)을 이용한 3세대 matrix가 개발되어 사용되고 있다. 또한 matrix-free의 suspension 방식의 3D 배양법도 최근에 개발이 되어 대량생산에 적용시킬 수 있게 되었다. 현재 널리 사용되는 matrix 를 이용한 2D 배양법은 배아줄기세포의 안정적인 성장과 배양조건을 제공하고 있지만 근본적으로 대량생산에는 적합하지 않다. 따라서 matrix가 필요하지 않은 suspension 방식의 3D 배양법의 개발 은 bioreactor를 이용하여 대량생산을 위해 꼭 필요한 기술이었다. 현재는 배아줄기세포를 aggregate로 형성시켜서 이를 suspension 방식으로 배양하는 기술과 이에 필요한 배양액이 개발되 었으며 이를 이용해 세포치료에 필요한 임상 목적의 대량생산도 가능하게 되었다.

2.1.4. 줄기세포 cryopreservation media

상대적으로 생산에 필요한 시간이 오래 걸리는 줄기세포들은 궁극적으로는 질병이 발병하기 전에 환자의 체세포를 이용해서 미리 만들어 놓아 보관을 하는 banking의 개념을 적용해야 하며 장 기간의 보관이 필수적으로 필요하여 이를 위한 cryopreservation기술의 개발 역시 필요하다.. 일반적 으로 세포들을 장기적으로 보관하기 위해서는 액체질소를 이용하여 -140°C 이하의 냉동 보관 (cryopreservation) 방식을 이용한다. Immortalized 된 많은 세포주들의 경우는 DMSO를 포함하고 있 는 세포 배양액이나 serum을 이용하면 -80°C에서 어느 정도까지는 보관이 가능하지만 줄기세포의 경우는 단순하게 세포배양액에 DMSO만을 첨가하여서는 장기간 보존이 불가능하다. 초창기에는 ES qualified serum에 10% DMSO를 첨가해서 배아줄기세포와 유도만능줄기세포를 보관하였지만 freezing and thawing 후 다시 정상적으로 배양이 가능한 recovery 효율이 매우 낮음에 따라 이를 위 한 여러 가지 cryopreservation media가 개발되어 왔다. 대표적으로는 StemCell Technologies에서 개 발된 mFreSR, Thermo Fisher Scientific에서 개발된 PSC Cryopreservation kit, ReproCell에서 개발한 NutriFreez D10, BiolifeSolutions에서 개발된 CryoStor CS10이 있다. 특별히 CryoStor CS10 제품은 cGMP에서 생산되어 임상을 위한 제품에 사용이 가능하며 여러 가지 줄기세포들에서 가장 좋은 효 율을 보여주고 있는 cryopreservation media이다.

...................(계속)

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