바이오인

출처: biozine

인체 피부세포를 이용한 인공 피부의 개발과 응용

한국원자력 연구소 부설 원자력병원

손영숙 / 생체조직재생 국가지정연구실

(ysson@kcchsun,kcch.re.kr)
http://www.kcch.re.kr/bas

1) Tissue Engineered Medical Product(TEMP)

질병, 유전병, 사고 등으로 인하여 인체 기관이 갖는 특수한 기능을 상실하게되었을 때, 현재까지 개발된 인공장기가 그 기관의 물리화학적. 기계적 기능 혹은 생리적 기능을 단기간에 대신 혹은 보완해줌으로서 환자의 생명 연장과 재활에 공헌한 바가 크다.

그러나 이와 같은 인공 장기는 병원 내에서 혹은 단기간 동안에 장기 기능의 부분적인 회복에는 큰 역할을 하였으나 그 감수성이 인체 세포에 미치지 못하고, 물질의 fatigue 현상, calcification, thrombosis 유발 등으로 내구성이 문제가 되어 삽입 후 여러 번에 걸쳐 시술 작업이 필요한 경우도 있고, 인체 다른 기관과의 compatability가 떨어지는 단점을 보유하고 있어서 장기 기능의 영구적인 회복 혹은 대치가 어려웠다. 또한 장기 기증의 부족 및 HIV 감염 우려 등으로 장기이식 을 통한 인체 기능 회복이 어려우며, 최근 동물 복제 기술의 인체적용은 윤리적인 문제로 개발에 제한이 있고 또한 배아 간세포로부터 성인조직으로 분화를 시켜 조직 형태로 얻는 연구도 현재 상당한 기초연구가 더 진행된 후에야 가능할 것이며 또한 이 경우 역시 조직의 형태를 in vitro에서 재현하기 위해서는 현재 조직공학 기술에서 추구하는 cellular guidance 개념의 scaffold (구조물 개념의 지 지체)에 관한 기술 및 cell preconditioning (in vivo 환경을 모방한 세포 훈련기술: ex1혈관 재생시 artery의 혈류 속도와 유사한 shear stress 제공, ex2 연골 재생 bioreactor에 articulear cartilage가 인체에서 받는 compression가 유사한 힘 제공) 기술의 적용이 필요로 할 것이다.

이와 같은 cell based engineered tissue는 생체 재료만으로 제조된 인공 장기에 비해 생체 host 조직과의 동화가 용이하고 또한 이식 후 host 조직의 성장에 따라 적응할 수도 있으므로 (즉 어린이의 경우 host의 혈관은 성 장하면서 커지지만 이식한 acellular blood vessel은 그대로 있으므로 stenosis 유발) 원래 인체조직과 같이 변화에 대한 적 응력을 보유하고있다.

인공 장기 개발에 인체 세포의 중요성을 지적하는 한 예로 기증 받은 사체로부터 세 포를 제거한 acellular heart valve의 경우, heart valve의 성분은 인체 생체 재료로 구성되었으므로 인체에 가장 compatible한 valve이지만, 이 경우 역시 시간이 지남에 따라 heart valve의 elastin 성분에 calcium이 침착되 는 calcification이 발생하여 이식한 heart valve를 제거해야되는 경우가 자주 발생하고 있다. 이와 같은 문제점도 인 체 세포를 함께 배양함으로 해결 할 수 있을 것으로 기대하고 있는데 그 이유로는 heart valve을 구성하는 인체 세포가 calcified elastin fiber와 같은 노화 혹은 변형된 단백질을 감지하여 elastase을 분비하여 제거하고 이와 동시에 새 로운 elastin 단백질을 계속 제공해주기 때문 일 것으로 생각되고 있다. 이처럼 생체 조직공학(tissue engineering)연구 는 인체 세포가 보유한 무한한 능력을 최대한 이용한 인공 장기를 개발하여 인체의 손상된 조직의 기능을 회복시키고자 하 는 연구분야이다.

지금까지 조직 공학 기술로 개발하고있는 인체 조직으로는 피부가 가장 먼저 개발되었고, 연골, 혈관, 신경조직, 간 등 이 있으나 임상적으로 상용화되어 적극적으로 활용되기 위해서는 임상의사, 세포생물학자, 생체 재료학자 등 여러 연구 집단의 활발 한 공동 연구가 장차 더 진행되어야 하며, 이 분야 기술은 선진국에서도 신생 연구 분야로서 국내의 기술력과 선진국과의 기술력의 차 이가 아주 작은 기술 분야라고 할 수 있다.

현재 실험실 수 준의 조직공학 기술의 한계점을 극복하기 위해서 여러 분야 기술의 upgrade가 필요하다. 현재 cell processing 기술이 일반적 수술 혹은 신생아 포경 수술 등에서 폐기되는 조직의 일부로부터 피부 세포원을 확보, 냉 동 저장하여, 화상 및 외상에 적용할 타인의 피부 조직의 재생이 가능하나, 약 10,000 배 이상의 면적 확대를 요구하는 조직공학 기술 로 발전시키기 위하여 인체 조직으로부터 효율적인 세포 유리 기술 및 성인 조직에서 stem cell pool을 유리 동정하는 기술 개 발 등이 동반되어야한다.

또한 본인 adult stem cell 확보의 어려움을 해결하기 위하여 bone marrow, peripheral blood, 인체 진피 등에 분포하고있는pluripotent mesemchymal stem cell을 분리 및 분화 유도하는 기술 개 발이 필수적이다. 또한 산업화를 위해서 생체 적합성이 높은 생분해성 구조물(scaffold) 및 가공 기술 이 개발되어 세포 접종을 용이하게 하고 또한 세포의 기능을 유지하면서 대량 배양을 할 수 있는 기술이 개발되어야한다. 또한 in vitro에서 생체조건과 유사한 mechanical loading을 주는 preconditioning를 engineered tissue 제조에 도입하여 생체 조직과 mechanical property가 유사하고 이식후 세포 생존 및 host 동화 능력이 우수한 engineered tissue을 개발하여야한다.

2) Current Status of Bioartificial Skin and Future Aspect of Technical Improvement

화상 혹은 외 상 등에 상처 치유 목적으로 이용되는 인공피부는 acellular artificial skin(AS)에서부터 본인의 표피세포 (keratinocyte) 및 진피섬유아세포(dermal fibroblast)를 배양한 계층화된 cell-based bioartificial skin (Living Skin Equivalent: LSE)에 이르기까지 다양한 종류가 개발되어 미국 FDA 승인이 되어 상품화 단계에 까지 이르고 있는 것도 있다.

 acellular AS로는 진피의 주성분인 collagen과 glycosaminoglycan sponge 위에 silicone이 덮여있는 bilayer artificial skin (미국의 Integra LifeSciences Corp의 INTEGRATM) 제품, 일본 Terumo회사는 collagen sponge 제품인 TerudermisTM 등이 시판, 임상 적용되고 있으며 우수한 상처 치유 효과를 보이고 있다. 그러나 이들 제품은 콜라 겐과 같은 생체 물질로 제조되어 상당히 고가 제품으로 시판되고 있고, 염증 환경에서 쉽게 생분해가 되므로 실제 화상환자와 같이 상처 면적이 넓고, 염증 유발 확률이 높은 경우에는 임상 적용이 아주 어렵다.

미국 San Diego 소재 Advanced Tissue Science (Dermagraft, Transcyte), Organogenesis (Apligraf), Biosurface technology (Acticel; epidermal cell sheet for partial thickness wound), Integra (Integra Artificial Skin Dermal Regeneration Template), LifeCell (Alloderm), Genzyme Tissue Repair (autologous cell procesing) 등 Biotech 회사들은 인체 표피세포 및 진피섬유아세포 (allogenic 혹은 autologous cells)을 이용 한 다양한 생인공피부를 개발하여 Shreiner Burn Center, Brigham&Women Hospital, UCSD 의과대학 등을 중심으로 임상 시도를 하고 있으며, cell-based 생인공피부가 신속한 상처 치유는 물론 상흔의 감소 등 질적인 면에서도 우수한 상처 회복 효과를 얻고 있으며, allogenic 세포에 대한 면역 거부 반응이 없는 것 으로 보고되고 있다.

(그 이유로 순수 분리된 표피세포와 진피 섬유아세포만을 이용하므로 정상 피부조직에서 발견되는 내피세포, dendrite 세포 및 혈중에 존재하는 세포가 없어 면역 계가 단지 부분적인 면역반응, clonal anergy(특정 항원에 대한 면역 결핍) 혹은 특이 반응을 낼 수 없기 때문일 것으로 추정하고있음). 또한 본 연구실의 연구 결과에 의하면, 인 체로부터 진피 섬유아세포를 분리할 당시는 HLA-ABC 발현이 높지만 passage number 5 이상에서는 HLA-ABC 발현이 상당히 감소하여 background 수준으로 떨어지므로, 일반적인 in vitro 세포 배양 및 확장의 경우 allogeneic rejection을 염려 하지 않아도 되는 것으로 인정되고 있다. 이와 같이 순수 분리된 표피세포 및 진피 섬유아세포가 이상적인 donor tissue를 창조해 낼 수 있을 것으로 기대되고 있다. 그러나 cell based AS 역시 collagen 및 생존한 세포를 이용하므 로 아주 고가이며 장기간 보존 및 delivery의 문제점 등을 가지고 있으며 장차 이러한 문제점이 개선되어야한다.

당뇨성 궤양 및 venus ulcer에 활용한 cell-based bioartificial skin이 신속한 상처 치유는 물론 상흔의 감소 등 질적 인 면에서도 우수한 상처 회복 효과를 얻고있지만, 현 기술 수준에서 대부분의 생인공피부에 수화된 collagen 을 진피 주 구조물로 활용하고 있어서 면역성 및 고비용 문제, 수화되어 rigidity가 부족하여 graft로 활용, 대량 생산하는데 여 러 가지 면에서 개선할 점이 산재해 있다. 생인공피부를 진정한 의미의 조직공학으로 발전시키기 위해서는 수화 collagen 의 특성을 보완할 수 있는 가공 기술 및 대체 재료로서 biodegradable biocompatible polymer의 개발이 절실히 요구되고 있 다.

또한 cell based AS가 보여준 우수한 상처 치유 효과는 allogenic graft가 상처 회복에 필수적인 cytokines, 성장인 자, ECM 등을 시간적 순서대로 적절하게 제공하여주므로 상처 치유의 적합한 미세 환경을 제공하기 때문으 로 분석하고 있다. 이는 cell based skin에 주로 활용한 타인 피부 세포원은 현재 일종의 biodressing으로 인정 받고 있으므로 화상의 경우처럼 응급 상황을 제외하고는, 성인 본인조직에서 processing하여 얻어진 본인의 표피세포 및 진피 섬유 아세포의 활용이 절실히 요구되고 있으며, 이에 미국 보스톤의 Genzyme tissue repair에서는 성인 조직(1cm x1 cm)으로부 터 최적의 stem cells 분리/유지 조건 수립 및 최적의 초기화 배양 기술을 탐색하고 있고 custom service 및 cell bank 운영을 추진하고 있다. 또한 인체 세포 자체가 self cell sorting 능력을 보유하고있음이 최 근 규명되어 본인 세포자체가 세포 치료제로 활용될 전망이며 또한 본인세포에 gene therpy를 통한 상처 치유 촉진 유전자를 제공하므로 난치성 상처 등에도 상처 치유 환경을 개선 할 수 있을 것으로 기대하고 있다.

현재 기술 수준 으로 개발된 인공 피부는 표피와 진피 층 사이에 존재하는 basement membrane이 부재하여 이에 따른 두 조직간의 결착력 소실은 이식 후 기계적 마찰 등에 의해 표피층이 탈락되는 blister 현상의 주원인이 되며 이식한 graft의 intake율을 떨어뜨리는 원인이 되고있다. 본 연구실에서 type IV collagen과 laminin의 molar ratio을 조절하 여 basement membrane을 재건하여 진피와 표피층의 결착력 증진을 유도하는 연구를 수행하였고, 이 기술을 생인 공 피부 제조에 적용하므로 진피와 표피에 결착력이 높이고, 이식 후 실질적으로 문제가 되는 graft 조직의 mechanical stress 에 약한 단점을 크게 보완 할 수 있을 것이다.

또한 상처 치유 된 조직의 저 색소증을 보완하기 위하여 melanocyte를 생인공 피부 제조시keratonocyte와공동배양하여(개인별로 인체 조직내의 melanocyte/keratinocyte ratio을 조사한 후 이 ratio를 공동 배양 시 적용함) 인 체 조직과 유사한 색소 반응을 재현시킬 수 있게 될 것이며 또한 본 연구실에서는 초기화 배양한 혈 관 내피세포를 진피 구조물에 loading 하여 혈관 생성을 유도하므로 더욱 완벽한 생인공피부로 발전시키고자 한다.

Dopa staining in the individual human skin and cultured melanocyte

3) Bioartificial Skin

본 연구실에서 는 인체 세포로 구성된 이식 가능한 생인공 피부를 개발하고있다. 이는 생체 조직공학 기술 (조직공학; tissue engineering)의 선구자적 역할을 한 기술 분야로서 인체 피부 조직의 일부로부터 초기화 배양(stem cell를 분리/배 양/확장)한 인체 표피세포 및 진피 섬유아세포를 collagen matrix에서 3 차원적 배양하여 완전히 계층화된 인공피부를 실험실 에서 재현하는 기술이다. (Figure 1.)

세포에, 세포 분열/분화 조절인자 및 조직 특이적 세포외 물질로 재구성된 적합한 미세환경을 제공하여 실험실 수준에서 조 직의 특성을 갖춘 engineered tissue를 재현하는 기술이다.

(1) Ideal Dermal Template

현재 기술 수준 의 생인공피부가 우수한 상처 효과를 보임에도 불구하고 화상 환자 이식에 적극적으로 활용되지 못하 고 있다. 현 기술을 상용화 가능한 기술로 발전시키기 위하여서는 우선 두 가지 문제점을 해결하여야한다.

첫째는 생인공피부에 주로 이용하는 구조물인 수화된 동물 collagen 혹은 collagen sponge는 고가이고 또 한 면역성, rigidity 부족 등 문제점이 있으므로 graft의 넓은 상처에 적용 및 대량 생산에 한계점이 있다. 본 연구실에 서는 생인공피부를 진정한 의미의 조직공학으로 발전시키기 위해서는 수화 collagen의 특성을 보완할 수 있는 가공 기술 및 대체 재료로서, 이미 약물전달 및 치과용 재료로 활용되고있는 chitosan을 collagen과 혼합 혹은 coating하여 진피 재료로 이용하 므로 chitosan의 생분해성 및 구조적 우수성(100-200 um porous 구조)과 collagen의 세포적합성(세포 attachment 8 배 증진)의 특성을 공유할 수 있는 진피 구조물을 개발하여 생인공 피부의 조직공학화를 시도하고 있다 (Figure 2-3).

둘째는 세포배양이 어려운 응급의 상황에 대처할 수 있는 인공피부의 개발이다. 인체 allogeneic cell이 상처치유 촉진 인자 및 ECM 제공하는 biodressing이란 점에 착안하여 생분해성 진피 scaffold에 상처치유를 촉진시켜 줄 성장인자 및 ECM를 제공하여 응급상황에 대처하는 인공피부를 개발하고있다. 현재 동물실험에서 우수한 상처 치 유 촉진 효과를 얻었고 이식한 부위에 활발한 혈관생성를 관찰하였다(Figure 2).

Figure 3. Ideal Bioartificial Skin

(2) Cell processing and cell preconditioning

성인 본인 조 직으로부터 autologous cell source를 활용하기 위하여 피부의 구성 세포의 효과적인 분리 및 stem rich population 확보가 중요하다. 본 연구실에서는 기계적 자극을 가하면서 세포 분리를 하므로 기존 기술의 6.5 배 이상 cell yield를 높였고 또한 CFU 평가에 의한 stem cell rich population를 확보하는 기술을 개발했다 (Figure 4). 또한 이렇게 분리한 표피세포 및 진피 섬유아세포를 혼합하여 nude mouse skin에서 in vivo raft culture를 하여 nude mouse skin에 human skin patch(self cell sorted skin equivalent)을 형성하여 인체 초기화 세포의 cell therapy 적용의 가능성을 제시하고 있다. 또한 Flexor cell tension system을 이용하여 약 10 % tension을 1HZ로 2 일간 제공하여 인체 진피 섬유아세포 및 혈관 내피 세포를 훈련시키므로 ECM 분비 정도를 200 배 이상 증진시켰고 또한 생체 적응력이 증진되었다.

Figure 4. Schematic diagram of cell processing screening and evaluation of colony forming unit(CFU)

(3) 연구용 및 screening 모델 개발

3-D 세포 배양으로 계층화된 인공피부를 개발하여 자외선에 대한 반응이 인체 피부와 유사함을 확인하 였고(YS Son et. al, 1996, Mol & Cell, Vol.6, pp.659∼ 665) 이를 8mm size의 인공피부로 개발하여, 화장품의 원료 효능 및 독성 평가, transdermal 약물전달 등의 연구 에 활용하고 있다. (Figure 5)

Figure 5. Bioartific skin as in vitro model for transdermal drug delivery and cosmetics screening