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출처: biozine

세포의 노화와 불멸화

이재용 / 한림대학교 의과대학 생화학교실 부교수

1. 서 론

인간과 동물로부터 분리한 섬유아세포(fiboblast)는 세포배양에서 계속 자라지 못하고 제한된 수의 분열을 한 후 성장을 정지하는데 이를 in vitro의 세포 복제의 노화(replicative senescence)라고 일컫는다(Hayflick 1965, 1977, Rohme 1981). in vitro에서 노화한 섬유아세포는 in vivo에서 노화된 섬유아세포와 같은 형태를 보여주는 것으로 알려졌으며, 유전자의 발현양상도 유사한 것으로 보고되어 섬유아세포 배양은 중요한 in vitro 세포노화의 연구 모델이 되어왔다. 물론 근육세포나 신경세포는 분화한 뒤에 전혀 분열을 하지 않으며, 분화된 세포마다 그 성장 양상이 다르기 때문에 섬유아세포의 모델이 in vivo의 개체의 노화를 대변할 수는 없으나 개체를 사용하여 노화유전자를 찾는다는 것은 어렵기 때문에 노화의 유전자를 발견하는 등의 분자생물학적 방법으로 노화연구를 위한 중요한 모델로 이용되고 있다.정상적인 세포는 자연적으로 또는 virus의 감염, mutagen의 처리 등의 여러 인공적인 방법에 의하여 불멸화하여 암으로 진행할 수 있다(Chang 1986, Newbold et al 1983). 세포 불멸화 기작은 아직 정립이 되어있지는 않으나, 불멸화 과정에서 세포 노화와 관련된 유전자들에 돌연변이나 불활성화가 나타나 결국 노화의 프로그램을 상실함으로써 불멸화되는 것으로 추정하고 있다(그림 1).

그림 1. 세포의 노화와 불멸화

가장 많은 연구가 된 세포의 불멸화는 SV40 virus의 발암성 단백질 large T antigen에 의한 인간의 섬유아세포의 불멸화로 유전자의 수준까지 상당히 많이 알려져있다. 불멸화된 세포는 암세포와 달리 아직 contact inhibition 기능을 보유하고 있어 soft agar assay나 nude mice test와 같은 발암성 분석에서 음성으로 나타난다. 불멸화세포에서 암세포로의 변환에 대해서는 아직 알려진 바가 없으나 아마도 contact inhibition에 관여하는 유전자들과 그 밖의 다른 유전자들에서의 변형을 통하여 진행할 것으로 추정된다.

2. SV40 Large T antigen에 의한 인간 섬유아 세포의 불멸화

DNA tumor virus인 SV40 virus에 의한 인간의 섬유아세포(fibroblast)의 불멸화는 가장 잘 연구가 되어있는데, 이 virus의 발암성 단백질인 large T antigen이 불멸화에 관여하는 것으로 알려져 있다(Chang et al 1986, Mayane et al 1986). SV40 virus의 large T antigen은 세포내의 암억제 유전자(tumor suppressor genes)인 p53, pRB, p107 단백질들과 결합하여 세포내의 이들 단백질의 활성을 제거하므로써 세포의 불멸화를 촉진한다(Ide et al 1986, Wright et al 1989). 그러나 이 large T antigen만으로 인간의 섬유아세포가 직접 불멸화되지는 않고 몇 가지의 단계를 거쳐 극소수의 세포만이 불멸화하게 된다. 배(embryo)로부터 확립한 정상적인 인간의 섬유아세포는 세포배양에서 약 50-60 번의 분열을 한뒤에 분열을 정지하고 in vivo에서 노화한 인간의 세포와 같은 형태를 보여주는 세포 노화(cellular senescence)를 진행한다(West et al 1989, Kumazaki et al 1991, Millis et al 1992). 정상적인 인간의 섬유아세포에 SV40 virus의 large T antigen을 발현시키면, 50-60번 외에 약 20번 분열을 더 진행한 다음 세포가 자라면서 동시에 죽는 평형상태인 crisis에 도달한다(Stein 1985, Radna et al 1989, Wright et al 1989). 이 crisis 과정에서 약 107의 세포중 하나의 세포만이 불멸화로 진행하여 계속 자라게되고 나머지의 세포는 모두 점진적으로 죽게된다 (그림 2)(Shay et al 1993).

crisis의 발생기작은 아직 밝혀져 있지 않으나 G1기의 cell cycle arrest에 관여하는 Cyclin Dependent Kinase(CDK) Inhibitor인 p21WAF1과 p16INK4의 발현이 증가하고 세포의 형태와 다른 성장유전자의 발현상태로 보아 정상세포의 senescence와 유사한 것으로 알려졌다(El-deiry et al 1993, Noda et al 1994, Rubelj et al 1994). 이와 같이 large T antigen에 의한 인간 섬유아세포의 불멸화가 2단계로 일어난다는 사실은 Dr. Shay 그룹에의해 발견되었으며 두 단계를 M1, M2라고 명명하였다(그림 2).

M1은 T antigen에 의한 약 20번의 분열수가 증가하는 단계를 말하며, 여기에는 T antigen과 직접 결합하는 p53, RB, p107 등이 관여하는 것으로 알려졌다. M2는 crisis로부터 탈출하여 불멸화되는 단계로서 아마도 세포내의 또다른 유전자들의 돌연변이나 발현의 불활성화를 수반하여 진행하는 것으로 추정되나 그 기작에 대해서는 현재까지 알려진 바가 없다. 이들 유전자는 불멸화로의 진행을 막는 세포내의 또다른 방어자로서 세포의 불멸화, 발암, 노화에 직접 연관되어 있을 것으로 추정된다. T antigen에 의한 인간 섬유아세포의 불멸화는 inducible T antigen 발현시스템을 사용하여(Dexamethasone의 존재하에서만 발현) T antigen 발현이 중지되었을때 어떤 불멸화 단계에 있더라도 원래의 상태로 되돌아가는 가역적 과정으로 밝혀졌다(그림 2). 즉 불멸화에서 T antigen의 발현은 반드시 요구되는 필요조건으로 보인다.

그림 2. 인간 섬유아세포의 SV40 large T antigen에 의한 불멸화

3. 불멸화의 기작

 T antigen과 직접 결합하는 p53, RB, p107 등의 성장억제단백질들의 소실이 M1을 주도하고, M2에는 아마도 세포내의 또다른 유전자들의 돌연변이나 불활성화를 수반하여 진행하는 것으로 추정되나 그 유전자들이나 기작에 대해서는 현재까지 알려진 바가 없다. crisis에서는 발현이 되나 불멸화된 후에는 발현이 저하되는 CDK Inhibitor p21WAF1이 knock-out된 인간의 fibroblast에서도 SV40 virus의 large T antigen을 발현시킨 때와 마찬가지로 세포분열수에서 약 10-20번의 연장이 보고되어 CDK Inhibitor가 불멸화에 관여하는 것으로 추정된다(Brown et al 1997). 정상세포에는 telomerase(염색체 끝의 telomere를 만드는 효소)가 없어서 세포가 분열을 거듭할수록 telomere가 점점 짧아진다는 것이 알려졌다. 결국 점진적 telomere의 소실은 염색체를 부서지게하고 이는 DNA damage 신호와 마찬가지로 ATM(ataxia telangiectasia gene product)을 활성화하고, p53를 활성화하고 p53은 p21을 활성화하여 세포를 세포주기의 G1기에서 정지하게되고 노화하는 것으로 설명한다(그림 3). 정상세포가 불멸화세포나 암세포로 변환되면 telomerase의 활성이 나타나서 세포가 무제한으로 계속 자랄 수 있다는 결과가 최근 보고되어 telomerase의 활성이 직접 불멸화와 연관되는 것으로 제안되었다(Kim et al 1994). 그러나, 아직 세포의 불멸화과정에서 확실히 입증되지 못하였으며, 실제로 SV40 virus의 large T antigen에 의한 인간의 섬유아세포의 불멸화에서는 telomerase활성이 없는 불멸화 세포가 많이 나타나는 것으로 보고되었고, telomerase가 아닌 다른 방법에 의한 telomere의 연장도 보고되어 telomerase 이론이 맞는지는 아직 더 지켜보아야할 것으로 판단된다(Bryan et al 1994, Mumane et al 1994, Beissmann et al 1997).

그림 3. Telomere의 단축에 의한 노화의 가설

4. 불멸화세포의 Complementaion group

불멸화된 세포를 정상세포와 세포융합을 시키면 융합된 세포는 정상세포와 마찬가지로 세포노화를 보여준다. 세포노화가 불멸화에 대해 우성이라는 것을 의미한다. 같은 방법으로 두 불멸화된 세포를 융합할 때 두가지 결과가 가능한데, 하나는 세포노화를 보여주는 것이고, 다른 하나는 계속 자라는 경우이다. 첫 번째 경우는 두 불멸화 세포에서 이상이 있는 유전자가 달라서 서로 상보적인 결과에 의해 정상세포처럼 세포노화를 보여주나 두 번째의 경우는 두 세포가 이상이 있는 부분이 같아 서로 상보효과가 없기 때문에 불멸화의 형질을 그대로 유지하게 된 것이다. 이러한 방법으로 세포불멸화를 억제하는 특성이 4개 이상 complementation group으로 이루어졌다는 것이 보고되었다(Pereira-Smith and Smith 1988). 몇몇 불멸화 세포주에 대한 complementation group이 (표 1)에 요약되어있다. 최근에는 Microcell mediated chromosome transfer의 방법에의해 염색체를 하나씩 도입하여 어떤 complementation group의 유전자가 어떤 염색체에 존재하는지까지 확인이 되었다. 염색체 1번은 group C, 염색체 4번은 group B, 염색체 7번은 group D의 유전자를 함유하는 것으로 알려졌다. 염색체 5, 6, 11, 18, X 등도 불멸화세포의 성장을 억제한다고 보고되었으나 complementation group에는 연결되지않은 상태이다(Smith et al 1996). 그러나 현재까지 유전자가 클로닝되지 않았고, SV40 virus에 의해 불멸화한 세포는 모든 complementation group에 해당한다고 보고되어 이 분야의 연구는 아직 더 확인이 요구되고 염색체수준에서 유전자의 수준으로 더 진전이 필요한 상태이다. 

표 1. 불멸화세포의 불멸화 특성에 대한 Complementation group배정의 예

5. 동물세포의 불멸화

인간의 섬유아세포를 SV40 large T antigen으로 불멸화할 때 M1, M2의 2단계를 거치고, crisis 상태를 갖는 것으로 알려져 있으나, mouse의 섬유아세포는 그러한 상황을 보여주지않고 바로 불멸화가 된다는 것이 알려졌다. 인간의 섬유아세포는 자연적 불멸화가 거의 일어나지 않는 반면에 mouse의 섬유아세포는 자연적인 불멸화가 빈번하게 일어나는 것으로 보고되었다. 즉 같은 섬유아세포라 할지라도 원래 세포를 채취한 동물의 종류에 따라 불멸화의 용이도와 그 과정이 다르다는 것을 의미하며, 인간의 섬유아세포의 결과로 다른 동물의 세포를 설명할 수가 없다는 것을 보여준다. 아직 여러 동물세포에 대한 비교연구가 없는 상태라서 확증되지는 않았으나 저자의 실험결과에 의하면 동물의 수명과 동물로부터의 섬유아세포의 불멸화 용이도가 연관되어있는 것으로 보인다. 

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