바이오인

출처 : 고려웰빙자연치유학연구소

나노테크놀로지를 이용한 바이오센서

장용근 / 한국과학기술원 화학공학과 교수

나노테크놀로지(nanotechnology)라 함은 원하는 구조의 제작과 대상구조의 관찰을 원자 수준에서 행하는데 필요한 모든 기술을 총칭한다. 나노테크놀로지에 있어서의 첫 진보는 실리콘 소자의 제작 가공을 하는 전자산업분야에서 이루어졌다. 이 경우 미세조작기술(micromanipulative technologies)을 사용하여 원자들을 임의대로 배열하는 것은 본질적으로 이전에 사용해 왔던 방법들의 연장선상에 있음에 불과하다. 미세조작기술 외에 원하는 형태의 미세구조를 얻는 또 하나의 방법은 자체조립(self-assembling) 시스템을 이용하는 것이다. 물론, 이 경우에는 이용하고자 하는 자체조립 시스템의 특성을 사전에 충분히 파악하여야만 원하는 구조가 제대로 만들어질 수 있는 조건이 마련된다.

초분자(supramolecules)와 자체조립구조들은 생체 시스템으로부터 기원하는 것이 많은 바, 이들은 나노테크놀로지와 생물공학의 연결점 역할을 한다. 바이러스, 세포막, 단백질 복합체를 포함한 많은 생체 시스템이 바로 자연 발생적인 나노구조(nanostructure)이다. 물과 공기 사이의 계면에 형성되는 지질 단분자막과 이로부터 만들어지는 다층구조도 대표적인 자체조립구조이다. 생체물질, 화학물질을 물리소자(physical device) 또는 전극과 결합한 시스템은 무궁무진한 응용 잠재성을 갖는 바, 이는 잘 조직화되고 미세화된 분석용 또는 모니터링용 센서의 개발 뿐만 아니라 분자 크기 수준(molecular scale)의 반응기 또는 분리시스템의 개발에도 이용될 수 있다.

나노테크놀로지를 응용함에 있어서 원자와 분자들을 2차원 또는 3차원으로 배열하는 것이 당연히 필요한데 그 첫번째 방법은 전술한 바와 같이, lithography, ed ion beam(FIB) milling, atomic force micros(AFM) 등의 미세조작 기술을 이용하여 원하는 물질의 분자들을 배열하고 화학반응을 통하여 이들을 기판에 고정시키는 것이다. AFM은 원래 나노구조의 관찰을 위해 고안된 것이나 나노스케일에서의 조작에도 이용되는 매우 유용한 기술이며 1 nm 정도의 정밀도를 갖는 것으로 알려져 있다. Lithography를 사용하면 폭이 0.3~10 nm에 불과한 패턴을 만들어 낼 수 있다.

두번째는 역시 전술한 바와 같이, 합성물 또는 생체 분자들의 자체 조립 특성을 이용하는 방법인데 지질과 같은 양친성(amphiphilic) 물질을 이용하면 비교적 용이하게 나노구조를 얻을 수 있다. 이 경우 보다 효율적인 나노구조의 제작을 위해 다음의 조건이 갖추어져야 한다 : (1) 원하는 나노구조와 이를 구성하는 분자들 간의 관계를 이해해야 하며 ; (2) 사용 목적에 적합한 구조가 유도될 수 있도록 분자를 개조하는 방법이 있어야 하며 ; (3) 만들어진 자체조립 구조를 미세 조정하고 개조하고 안정화시키는 미세조작기술이 있어야 한다.

자체조립구조는 역미셀(reverse micelles), 액정구조, vesicle, 단층막의 네 가지로 대별될 수 있는데 현재 바이오센서 개발에 가장 많이 이용되고 있는 것이 단층막 또는 이의 반복 누적으로 만들어지는 다층막 구조이다. 고체 표면에 단층막 또는 다층막을 형성시키는데 주로 쓰이는 것이 Langmuir-Blodgett(LB) 기술이다. 이 공정에서는 물과 공기간의 계면에 단층막이 형성되어 있는 상태에서 고체 물질을 담갔다 꺼내는 작업의 반복을 통해 원하는 층수만큼의 다층 구조를 얻을 수 있다. 경우에 따라서는 순수한 자체조립 특성만으로는 원하는 구조가 만들어 질 수 없을 수도 있다. 이러한 경우 templating 법이 사용되는 바, template 상에 lithography 등을 이용하여 뒤따를 자체 조립에 필요한 보다 복잡한 초기 구조를 만들어 줄 수 있다. Molecular imprinting은 하나의 templating 기법이다. 한 print molecule을 특정 용액과 작용시켜 print molecule을 둘러싼 용액이 굳으면서 print molecule의 형태를 간직하도록 한다. 내부의 print molecule을 제거해 내면 하나의 template가 만들어지는바 이는 차후에 해당 print molecule을 선택적으로 흡착시키는데 사용된다.

본 고에서는 유전자 분석, 질병진단, 생물공정 모니터링 및 환경 모니터링에 필요한 바이오센서 개발에 있어서 커다란 잠재 응용성을 갖고 있는 DNA 칩, 면역센서의 제작과 적용예, 그리고 LB기법을 이용한 바이오센서소자의 제작과 적용예를 간략히 살펴보기로 한다.

DNA 칩(DNA Chip)

근래에 들어 인체가 갖고 있는 모든 유전정보를 규명하고자 하는 노력과 함께 유전병을 진단하고 예방하는데 있어서 막대한 양의 유전자 정보를 신속히 제공할 수 있는 방법에 대한 요구가 크게 증가하고 있다. 현재 널리 사용되고 있는 전기 영동에 의한 DNA 염기서열 분석은 과정이 번거롭고 많은 시간과 노력, 비용 그리고 고도의 숙련도를 필요로 하기 때문에 이러한 단점을 극복할 수 있는 새로운 분석 시스템이 모색되어 왔고 최근 10년 동안에 미국에서 DNA 칩의 제작과 이용 기술과 관련한 괄목할 만한 진보가 있었다.

DNA 칩은 실리콘, 표면개질 유리, 폴리프로필렌, 활성화 폴리아크릴 아마이드와 같은 고체 표면에 염기서열이 미리 알려진 6~20 염기 크기의 탐침 올리고 핵산(probe oligonucleotide)을 적게는 1000개 많게는 1,000,000개 까지 정해진 위치에 부착시켜 array를 형성시킨 것을 통칭한다. 이러한 DNA 칩에 분석하고자 하는 목표 DNA 단편을 결합시키면 DNA 칩에 부착되어 있는 탐침들과 목표 DNA 단편상의 염기서열의 상보성 정도에 따라 각기 다른 결합(hybridization) 상태를 나타내게 되는데, 이를 광학적인 방법, 방사능 화학적 방법 등을 통해 관찰 해석함으로써 목표 DNA 상의 염기 서열을 파악할 수 있다.

얻어진 데이터의 처리를 위한 병렬계산 과정 등에 필요한 소프트웨어의 개발과 함께, DNA 칩의 사용은 DNA 분석 시스템의 소형화(miniaturization)를 이루어 극미량의 시료만으로도 분석이 가능한 것 외에 목표 DNA 상의 여러 군데의 염기서열을 한꺼번에 규명할 수 있게 함으로써 간편하고도 저렴 신속한 방법을 제공할 수 있다. DNA 칩의 사용은 DNA 분석속도를 수십~수백배 증가시켜 Human Genome Project의 완성시기를 크게 앞당겨 줄 뿐만 아니라 현재 염기 하나당 수 달러인 비용을 몇 센트의 수준으로 낮추어 줄 것으로 기대되며, 유전병의 진단 돌연변이의 탐색, 암 진단, 병원균의 검출, 유전자 발현 분석, 신약개발 등 폭넓은 응용 분야가 예상된다. 현재 이 분야에서 선도적인 역할을 하고 있는 미국의 경우 Affymetrix사를 비롯한 20여개사와 여러 대학에서 DNA 칩 제작과 이용 기술을 활발히 개발하여 일부 시판하고 있는 바 Affymetrix사의 경우 한 변의 길이가 1.28cm인 사각형 칩에 12,224개의 각기 다른 염기 서열을 부착시킨 DNA칩을 상용화하였다.

지금까지 소개한 것과는 다른 형태의 DNA 칩으로서, 미세가공기술을 이용하여 칩 위에서 모세관 전기영동(capillary electrophoresis)이 이루어질 수 있도록 한 것과 한 칩 상에서 시료 희석, 혼합, 반응, 분리, 정량이 모두 이루어질 수 있게 한 ‘Lab-On-A-Chip’ 개념의 소자도 개발하고 있다.
DNA 칩을 만드는데 있어서 단순히 미리 합성된 올리고 핵산을 부착시키는 방법도 있을 수 있으나, 이 방법은 많은 수의 다양한 종류의 염기서열을 원하는 위치에 배치하는 데에는 한계가 있다. DNA 칩의 제작에 있어서 대표적으로 사용되고 있는 광학식각법(photolithography)에 의한 light-directed synthesis법 (Fig. 1, C & EN, June 6, p.24, 1994)에서는 담체인 실리카 기판의 특정부분이 광화학적인 방법에 의해 선택적으로 활성화되며 이 부분만이 다음에 가해질 nucleotide와 화학적 결합을 하게 된다. 이때 목적하는 부분만을 활성화시키기 위해 차폐물질(photolithographic mask) 상에 미리 정해진 형태에 따라 뚫린 구멍을 통해 빛을 쪼여 준다. 따라서, 칩 상의 특정 부위와 염기 조성은 매 단계에서 사용되는 차폐물질 상의 구멍패턴과 이어서 공급되는 nucleotide의 종류에 따라 달라지게 되는 바, 이러한 특성을 이용하면 아무런 제한 없이 원하는 염기서열을 원하는 곳에 배치할 수 있다.

Figure 1. DNA Chips are made by light-directed synthesis.

In the light-directed synthetic technique developed by researchers at Affymetrix and Affymax, a surface bearing protected hydroxyls (O-X) is illuminated through a photolithographic mask (M1), generating free hydroxyl groups in exposed regions. The hydroxyl groups are then substituted by a protected nucleoside (T-X, protected deoxylthymidine). A new mask pattern (M2) is applied and the surface is again illuminated, yielding a new set of free hydroxyls (not shown), and a second protected nucleoside (C-X, protected cytidine) is substituted in. Mask application, illumination, and substitution steps are repeated until the desired set of products is obtained (a pattern of trinucleotides, in this case).

DNA 칩에 분석하고자 하는 목표 DNA 단편을 결합시킨 후 그 결합상태를 관찰하고 가시화 시키기 위한 방법들과 얻어진 데이터의 해석을 통해 염기서열을 규명해 내는 소프트웨어들이 활발히 개발되고 있다. 이른바 sequencing by hybridization(SBH)의 기본 개념이 Fig. 2에 잘 요약 정리되어 있다. 결합상태를 규명하는 방법으로는 결합된 염기 서열이 특정 온도 이상에서 분리되는 현상 즉 융해(melting)를 관찰하는 법, 형광 이미지를 이용하는 방법, 목표 DNA를 32P로 라벨링한 후 scintillation counting 또는 charge coupled detector(CCD)를 사용하는 방법, 광분산 라벨(light-scattering)이 부착된 목표 DNA의 결합과 융해를 2차원 optical wave guide(OWG)를 사용하여 관찰하는 방법 등이 있다.

Figure 2. Hybridization sequencing utilizes overlap strategy.

In sequence analysis by hybridization, a 12-mer target DNA sequence might be mixed with a complete set of the 65,536 possible octanucleotide probes. Assuming perfect hybridization complementarity (zero mismatched nucleotides), or the ability to distinguish perfect and imperfect complementarity based on significant differences in binding strength, five of the 65,536 DNA octamer probes will hybridize to the target. Alignment of the overlapping sequences from the hybridizing probes will reveal a sequence complementary to that of the target DNA.

일례로서 scintillation counting에 기초한 상용화된 가스 어레이 검출기(gas array detector)를, 9개의 염기를 가진 네가지 종류의 탐침 올리고 핵산이 부착된 DNA 칩 상에 21개의 염기를 가진 목표 DNA 단편이 결합된 상태의 관찰에 사용하여 그 성능을 보인 예가 Fig. 3에 있다(Nucleoid Acids Res., Vol. 22. No. 11, p.2121, 1994). 이때 사용된 네가지의 목표 DNA 단편 각각은 중앙에 탐침 올리고 핵산 중의 어떤 하나와 정확히 상보적인 9개의 염기서열을 갖고 있다. Fig. 3은 30분간에 걸친 측정 결과를 보여 주는데 이는 전통적으로 DNA 결합 분석에 사용되어 왔던 X-ray에 의한 방법 보다 10~20 배 빠른 것이다. 그림에 주어진 데이터를 보면 완벽한 결합이 이루어진 경우가 아홉 개중 단 한 개의 염기가 어긋난 경우에 비해 신호의 세기가 3~10배 크게 나타난 것을 알 수 있는데 이는 이 방법을 실제로 DNA 분석에 사용할 경우 염기 한 개에 해당하는 염기서열 상의 차이도 구분할 수 있다는 가능성을 보여주는 예이다. 동 연구팀은 CCD를 검출기를 사용한 실험 연구도 행하였는데 일초라는 짧은 시간 내에 관찰이 가능했으며 완벽한 결합이 이루어질 경우 한 개의 염기가 어긋난 경우에 비해 신호의 크기가 11배 이상을 나타내었다. 이는 CCD 이용 기술이 실용화 될 경우 DNA 분석 속도에 있어서 획기적인 개선이 가능함을 보여준다.

Figure 3. Hybridization ivity on SiO2 films

Four probes (as defined at the bottom) were attached to form four identical quartets. One of the four 21 base targets, labelled with [r -32p] ATP, was hybridized to each quartet then washed at 4。C in hybridization solution. Arrays have been formed so that the innermost element of each quartet constitutes the correctly matched probe-target pair. Data were obtained after 30 minutes of data acquisition on a gas phase array detector. Left: The data have been presented in a 3 dimensional format. Right: The total radiochemical signal within each of the 16 quadrants is summed. As seen, a minimum discrimination factor of 3-10 was routinely obtained between specific and mismatched pairs. Bottom: The sequence of four targets and four probes used in the study.

DNA 칩을 DNA 염기서열 규명에 사용하는 것에 대해서는 이론적으로는 문제가 없을지 모르나 실제 적용 단계에서는 아직도 해결해야 할 문제가 많이 남아 있다는 의견이 일각에서 제기되고 있다. 이러한 이유에서인지는 모르지만 구체적인 적용 예는 알려진 것이 아직은 드문 편이다. Affymetrix사는 같은 미국 회사인 Roche Molecular System과의 협력 연구를 통해 cystic fibrosis(CF)라는 질병의 원인이 되는 돌연변이를 규명하기 위한 연구의 일환으로서 57개의 CF 돌연변이를 찾아낼 수 있는 형광을 이용한 DNA 칩 시스템을 개발하고 있다. Beckman Instrument사 역시 CF 돌연변이 검색을 위해 폴리프로필렌 박막 위에 64개의 올리고 핵산이 직선으로 배열된 ‘genosenso’를 개발하였는데 이를 사용하면 최대한 32개의 돌연변이와 32개의 wild-type 염기서열을 검색할 수 있는 것으로 알려져 있다. 미국의 Molecular Tool사에서는 결핵균의 종분화(speciation) 조사에 필요한 유전형분석(genotyping) 기술을 개발 중에 있다. 이외에도 대장암, 방광암에 관련된 종양 유전자 상의 돌연변이의 검출을 위한 DNA 칩 개발도 진행중이다.

마지막으로 모세관 전기 영동 칩을 제작하여 DNA 염기서열 분석에 이용한 경우를 간단히 소개하기로 한다(Fig. 4, Anal. Chem., Vol. 67, No. 20, p.3676, 1995). 50×8 μm의 단면적을 갖는 모세관을 2인치×3인치 크기의 두 개의 유리판 사이에 형성된 샌드위치 구조 내에 만들어 사용한 결과 단 540초만에 약 150개의 염기 서열에 대한 분석이 97%의 정확도(accuracy)와 단일 염기 해상도(single-base resolution)로 이루어질 수 있었다. 이러한 연구결과는 칩 상에 미세화된 모세관 어레이 전기 영동을 사용함으로써 고속 염기서열 분석이 가능할 수 있음을 말해준다.

Figure 4. Schematic diagram of the electrophoresis chip indicating the injection procedure

The injection channel reservoirs 1 and 3, and the separation channel connects reservoirs 2 and 4. In the inject mode, a field is applied between reservoirs 1 and 3, causing the DNA to migrate through the gel-filled intersection toward reservoir 1. In the run mode, a field is applied between reservoirs 2 and 4, causing the DNA fragments in the intersection region to migrate toward reservoir 4 through the gel in the separation channel. The actual devices had 15 electrophoresis systems integrated on each chip.

면역 센서(Immunosensor)

오늘날 임상실험, 식품의 선도 및 오염도 측정, 생물공정제어, 환경모니터링 등 여러 분야에서 기존의 전통적인 면역분석(immunoassay)의 대안의 하나로서 여러 생화학적 성분에 대해 연속적으로 원 위치에서 이루어지며(in situ) 신속한 측정을 가능케 하는 바이오센서의 개발에 상당한 관심이 집중되고 있다. In situ 측정을 위해서는 무엇보다도 센서의 크기가 작아야 원하는 부위에 설치가 가능하다. 미량측정을 위해서는 잘 define된 형태의 감도가 높은 감지 소자가 필요하며 다성분을 대상으로 하는 경우에는 한 센서 시스템 내에 각각 다른 물질을 감지하는 여러 개의 미세화된 감지소자를 설치함으로서 측정시간을 획기적으로 줄일 수 있다. 이러한 미세화되고 잘 define된 구조를 만드는 데에는 미세조작 또는 자체 조립 시스템에 기초한 나노테크놀로지 기술이 필수 불가결하다.

여타 센서와 마찬가지로 바이오센서도 감지요소(sensing element)가 트랜스듀서와 결합된 형태를 갖는다. 바이오 센서의 경우 감지 요소는 효소, 항체, 생체막 구성물, 또는 미생물 등이다. 트랜스듀서는 감지요소 물질과 분석 대상물질 간의 상호 작용 결과를 물리적, 화학적, 전기적 또는 광학적 형태의 신호로 바꾸어 주는 역할을 한다. 면역센서는 항원 또는 항체를 감지요소로 사용하는 바이오센서의 한 형태로서 매우 높은 특정성(specificity)과 ppb 또는 ppt 수준의 높은 민감도를 갖는 것이 보통이다.

트랜스듀서로서는 물리적, 전기적 원리 또는 광학적 원리에 기초한 것들이 주로 쓰이는데 최근에는 실용성을 고려하여 전기적인 것이 선호되고 있는 추세이다. 일례로 광섬유와 형광을 이용한 센서를 살충제 등의 검출에 사용하기도 하는데 이 유형의 센서는 각 대상물질이 독특한 빛 흡수특성을 가짐으로 인해 일부 한정된 물질의 측정에만 이용될 수 있을 뿐만 아니라 보다 강화된 신호를 얻기 위해 별도의 시약을 써야 하기 때문에 비용이 많이 든다는 단점이 있다. 특히, 환경 모니터링에서 처럼 현장에서, 시약의 사용 없이, 신속 저렴하게 이용할 수 있는 방법이 필요한 경우에는 이러한 단점이 더욱 부각된다. 또한, 측정에 한 번 사용하고 난 후 pH 또는 이온 세기 등의 환경 조건을 바꾸어 주지 않으면 센서가 원상태로 돌아가지 않는 소위 비가역성 문제는 재생과정의 포함 또는 일회용 감지소자의 사용을 불가피하게 함으로써 비용과 시간이라는 측면에서 또 하나의 단점이 된다.

전기적 검출 방법을 사용하는 전기 화학적 면역센서는 전위차를 이용하는 것(voltametric), 전류를 이용하는 것(amperometric) 등이 있으며 이중 전류를 이용하는 것이 전압을 이용하는 것보다 민감한 것으로 알려져 있다. 그러나 전기화학적 면역센서도 아직까지는 직접적이고 동시에 가역적인 결과를 주기가 어려운데 이는 본질적으로 항체-항원 결합이 비가역적인데에서 오는 것이라 할 수 있다. 이러한 문제점들을 극복하기 위한 하나의 새로운 접근 방법에서는 conducting electroactive polymer(CEP)에 고정시킨 항체에 주기적으로 변하는 맥동 전위(pulsed potential waveform)를 가함으로써 문제를 해결할 수 있음이 보여졌다(Biosensors & Bioelectronics, Vol. 11, No. 8, p.v, 1996). Human serum albumin(HSA)을 대상으로 한 시험 케이스를 통해 항체-항