바이오인

바이오 신약(Biologics)

tRNA-derived small RNA의 유전자 조절 기전의 이해와 진단/치료제 개발에 대한 전망

                                                                                                                               김학균 / 중앙대학교 생명과학과 교수

이새별/ 중앙대학교 생명과학과 박사과정 학생

◈ 목차

• 1.시작하며

• 2.tsRNA의 생성 및 유형

• 3.tsRNA의 기능적 역할

• 4.RNA modifications

• 5.Potential biomarkers and therapeutic targets in cancers

• 6.Extracellular tsRNAs

• 7.글을 마치며

◈본문

1. 시작하며

지난 몇 십 년 동안 유전체의 90% 이상이 단백질을 만들어낼 수 있는 mRNA가 아닌 비번역 RNA(noncodingRNA, ncRNA)로 전사되며 이들이 중요한 유전자 발현 조절 분자라는 것이 밝혀져 왔다. 이러한 비번역 RNA에 의한 유전자 발현 조절 기능에 대한 연구는 18–25 뉴클레오타이드(nt) 길이의 작은 간섭 RNA(siRNA)와 miRNA(miRNA)의 발견으로부터 시작되었다.

1993년 최초로 발견된 miRNA인 lin-4는 lin-14 유전자 발현을 저해시켜서 Caenorhabditis elegans(C. elegans)의 발달을 조절하는 것이 알려졌다. 이후 Craig Mello와 Andrew Fire는 siRNA의 유전자 저해 메커니즘을 밝혀내어 노벨상을 수상하였다. 이러한 비번역 RNA는 Argonaute(AGO) 단백질과 결합해 mRNA 절단, 분해 또는 번역 억제를 유도하기에 이러한 복합체는 RNA 유도 침묵 복합체(RISC)로 불린다.

최근에서야 생물학적 기능에 대해서 알려진 transfer RNA(tRNA) 유래 작은 RNA(tsRNA, tRNA-derived small RNA)는 단백질 합성 시 아미노산을 리보솜에 전달하는 역할을 하는 tRNA가 리보뉴클레이즈에 의해 절단되어 생성된다. tsRNA은 1970년대 후반 암 환자의 소변에서 처음 발견되었고 비기능성 분자로 여겨져 오다 2009년에 생물학적 기능을 수행할 수 있음이 밝혀졌다.

tsRNA는 전사 단계 조절, 전사 단계 후 유전자 억제, mRNA 안정성, 바이러스 복제, 번역 억제 및 상향 조절 등 다양한 조절 메커니즘을 가지고 있다. 오늘날 이러한 기전을 바탕으로 tsRNA가 다양한 암 및 신경 질환에 관여할 수 있다는 것이 밝혀졌으며, 바이오마커 및 치료 표적이 될 수 있는 가능성이 제시되었다.

본 글에서는 tsRNA의 생합성과 유전자 발현 조절 기능 및 바이오마커로 사용될 수 있는 암에서의 발현 패턴 그리고 tsRNA를 이용한 잠재적 치료 방법 등을 소개하고자 한다.

2. tsRNA의 생성 및 유형

tsRNA는 절단 위치와 크기에 따라 6가지 이상의 유형으로 분류된다(그림 1).

① Type I tsRNA

Type I tsRNA는 mature tRNA로부터 생성되는 18-30 nt 길이의 tsRNA로서 tRNA-derived fragment(tRF)라고도 불린다. 이들은 5′tsRNA(tRF-5)와 3′tsRNA(tRF-3)로 나누어진다.

5′tsRNA는 tRNA의 5′ 말단에서 D-loop 또는 anticodon loop을 포함하며, 길이에 따라 tRF-5a(14–16 nt), tRF-5b(22–24 nt), tRF-5c(28–30 nt)로 명명된다. 3′tsRNA는 T-loop으로부터 tRNA의 3′ 말단까지를 포함하며, 주로 18 또는 22 nt 길이를 가지고, 이에 따라 각각 tRF-3a 및 tRF-3b로 명명된다.

Type I tsRNA의 생성 기전은 아직 명확히 밝혀지지 않았다. 일부 연구에서는 Dicer가 type I tsRNA를 생성할 수 있다고 제안했으나, 그렇지 않다는 연구 결과도 다수 존재한다. 또한, 다른 종에서 Angiogenin 및 RNase T2를 포함한 다양한 endonucleases에 의해 생성되기에, 다른 ribonucleases에 의한 tsRNA 생성에 대한 추가 연구가 필요하다.

② Type II tsRNA

Type II tsRNA(tRF-1)는 16-48 nt 길이를 가지며 pre-tRNA의 3′-trailer 서열에서 생성된다. 5′-leader, mature tRNA, 인트론, 3′-trailer 서열로 구성된 pre-tRNA는 RNA 중합 효소 III에 의해 전사된다(그림 1). tRNA maturation 과정 중에 mature tRNA 서열을 제외한 나머지 서열들은 제거되고20 type II tsRNA는 tRNA maturation 과정에서 RNase Z와 Elac2에 의해 생성되는 것으로 알려져 있다. 다양한 암에서 여러 type II tsRNA는 다르게 발현되어21-23 바이오마커로서의 가능성을 제시하고 있지만 발현 조절 및 기능에 대한 추가적인 연구가 필요하다.

③ Internal tsRNA

Type I 및 type II tsRNA와 달리, internal tsRNA(tRF-2 또는 i-tRF)는 tRNA의 3′ 또는 5′ 말단을 포함하지 않고, anticodon loop을 포함한다24(그림 1). Internal tsRNA의 생성 과정은 아직 밝혀지지 않았다.

④ 5′ 및 3′ tRNA halves(tiRNA)

tRNA의 anticodon loop에서 절단이 일어나 생성되는 30-40 nt 크기의 RNA는 tRNA 길이의 절반 정도이기 때문에 tRNA halves라고 불린다(그림 1). 이들은 다양한 스트레스 조건(예: 영양 결핍, 열 충격, 저산소증, 산화 스트레스, UV 조사 등)에서 생성이 유도되기 때문에 tRNA-derived stress-induced RNA(tiRNA)라고도 불린다. 초기 연구에서는 tRNA halves가 스트레스를 받았을 때 angiogenin 또는 Rny1p에 의해 생성된다고 보고되었다. 그러나 일부 tRNA halves는 스트레스와 관계없이 성호르몬과 성호르몬 수용체에 의존하여 발현되기에 sex-hormone-dependent tRNA-derived RNA (SHOT-RNA)로 명명되었다. 이러한 발견은 tRNA halves가 스트레스와 무관하게 생성될 수 있음을 의미하며, 이들의 생성 기전에 대한 추가 연구가 필요하다.

3. tsRNA의 기능적 역할

tsRNA의 유전자 조절 역할은 크게 전사 단계에서의 조절, 전사 단계 후 조절, 바이러스 복제 조절, 전이 요소 조절, 번역 단계 조절, RNA 결합 단백질 기능 조절 등으로 나누어질 수 있다.

① 전사 단계에서의 조절

Gullerova 그룹의 연구 결과, type I 3'tsRNA와 type II tsRNA 일부는 세포 핵에서 새로 형성되는 RNA의 인트론을 표적으로 하여 다양한 암과 관련된 여러 유전자를 억제하며, 이러한 조절 기능은 AGO 단백질 활성에 의존하여 mRNA 발현과 단백질 생성 측면에서 표적 유전자의 발현을 현저히 감소시킬 수 있다는 것이 알려졌다.

② 전사 단계 후 조절

초기 연구에서는 몇몇 tsRNA가 miRNA처럼 AGO 단백질과 결합해 유전자 발현을 저해할 수 있다는 연구 결과가 보고되었다. 그러나 이후에는 tsRNA가 AGO 단백질과 약하게 결합하여 miRNA와는 다른 기전으로 유전자 발현을 조절할 수 있는 가능성도 제시되었다. 예를 들어, Kay 그룹과 Dutta 그룹은 tsRNA가 miRNA와 결합하여 유전자 발현을 저해하는 역할을 하는 데 있어서 중요한 역할을 하는 AGO2가 아닌 AGO3와 AGO4와 더 강한 결합을 한다고 보고했으며, Croce 그룹은 Chronic Lymphocytic Leukemia에서 tsRNA가 AGO 대신 PIWI-Like 단백질과 상호작용한다고 보고했다.

③ 바이러스 복제 조절

Bao 그룹은 호흡기 융합 바이러스(RSV, respiratory syncytial virus) 복제에서 tRNA half의 조절 역할을 설명했다. RSV 감염은 몇몇 tRNA halves (tRF5-GluCTC, tRF5-GlyGCC, tRF5-LysCTT, tRF5-CysGCA)의 발현을 증가시키며 이러한 tRNA halves는 표적 유전자 발현을 저해시킬 수 있지만 miRNA와는 다른 방식의 기전을 가진다고 보고하였다. 이 중 tRF5-GluCTC는 RSV 복제를 억제하는 항바이러스 단백질인 APOER2를 억제함으로써 RSV 복제를 촉진한다. 또한, D'Agostino 그룹은 HTLV-1 감염 시 tRF-3019(18-nt Pro 3′tsRNA)가 발현되어 HTLV-1의 프라이머 결합 부위(PBS)에 결합하여 HTLV-1의 복제를 촉진한다는 것을 밝혔다.

④ 전이요소(transposon element, TE) 조절

TE가 세포 내에서 작용을 하게 되면 genome 상에서 돌연변이를 일으킬 수 있기 때문에 TE의 전사는 보통 후성유전학적으로 억제가 되어 있지만35, 후성유전학적인 조절 이외에도 비번역RNA에 의해서 억제가 되는 것이 보고되었다. Martienssen 그룹은 18-nt 3'CCA tRF(18-nt3′tsRNA)가 내인성 레트로바이러스(ERV,endogenous retro virus)의 PBS에 결합하고 22-nt 3′CCA tRF는 전사 단계 후 조절 방식으로 ERV의 복제를 억제한다는 것을 발표하였다.

⑤ 번역 단계에서의 조절

번역 단계에서의 조절은 크게 번역 저해와 번역 활성화로 나눌 수 있다9(그림 2). 세포가 스트레스를 받으면 스트레스 상황을 극복하기 위하여 스트레스로 인한 손상을 복구하기 위한 에너지를 보존하고자 세포 내 전반적인 단백질 합성을 억제한다. 특히, 암세포는 산화 스트레스, 포도당 결핍, 저산소증을 포함한 다양한 형태의 스트레스에 노출이 되기에 이러한 스트레스를 극복하는 것이 암세포의 성장 및 전이와 매우 깊은 관련이 있다. 따라서 앞서 말한 스트레스 조건 하에서 증가하는 tRNA halves에 의한 번역 단계에서의 조절이 암세포의 성장 및 전이에 중요할 수 있음을 알 수 있다.

Anderson 그룹은 angiogenin에 의하여 생성되는 5'-tiRNA가 번역 개시 인자인 eIF4F 복합체의 구성 요소인 eIF4G와 상호작용을 하여, eIF4F 복합체의 안정성을 방해해서 세포 내 전체적인 번역을 저해하는 것을 보여주었다. 그 밖에 다른 그룹에서도 길이가 tRNA halves보다 짧은 tsRNA들이 앞서 말한 tRNA halves와는 다른 기전으로 세포 내 번역을 저해하는 것을 보고하였다.

반면, Kay 그룹은 LeuCAG3′tsRNA가 리보솜 단백질 RPS28과 RPS15의 mRNA에 결합하고 두 mRNA의 2차 구조를 바꾸어서 세포 내 번역을 향상시킨다는 것을 밝혔다43. RPS28은 40S 리보솜의 구성 요소이며 18S rRNA 생성에 필수적이기 때문에, LeuCAG3′tsRNA의 억제는 40S 리보솜의 숫자를 줄여서 apoptosis를 야기하여 환자 유래 간세포암(HCC,hepatoceullar carcinoma) 이종 이식(PDX, patient-derived xenograft) 모델에서 종양의 성장을 줄인다. 이러한 발견은 tsRNA가 HCC 치료의 잠재적 표적이 될 수 있음을 시사한다. tsRNA에 의한 세포 내 번역의 증가는 기전은 다르지만 다른 종에서도 보고되었다.

⑥ RNA 결합 단백질 관련 조절

Tavazoie 그룹은 tsRNA가 두 가지 다른 기전으로 유방암의 전이와 관련된 종양유전자 발현을 조절할 수 있다는 것을 발표하였다24,45. 저산소 스트레스에 의해 발현이 증가하는 tsRNA(i-tRF)는 종양유전자 전사체를 안정화시키는 YBX1에 결합하여 여러 종양성 전사체와 YBX1의 상호작용을 방해한다. 이것은 유방암세포에서 종양유전자 전사체의 안정성을 감소시키고, 결과적으로 유방암세포 성장을 억제한다. i-tRF의 발현은 악성 잠재력이 낮은 유방암세포보다 전이성 유방암세포에서 현저히 낮으며, 이는 전이성 유방암이 tsRNA에 의한 억제를 회피하는 기전을 가질 수 있음을 시사한다.

Tavazoie 그룹은 또한 CysGCA5′tRNA halves가 유방암 진행과 전이 중에 증가하며 RNA 결합 단백질인 nucleolin에 결합하여 nucleolin과 혈소판 활성화 인자 Pafah1b1과 Mthfd1l 전사체 사이의 상호작용을 향상시킨다는 것을 밝혔다. 그 결과 Pafah1b1과 Mthfd1l 전사체의 안정성이 증가되고 유방암세포의 생존으로 이어진다.

이러한 tsRNA의 다양한 유전자 조절 역할에 대한 연구결과는 tsRNA가 암을 비롯하여 다른 질병에 대한 연구 및 치료방법 개발에 있어서 매우 중요하다는 것을 보여준다.

4. RNA 변형(RNA modifications)

RNA nucleotide modification에는 100가지 이상의 유형이 있다. tRNA는 평균 11~14개의 modified nucleotide를 가지며, 이러한 modification은 tRNA maturation 과정에서 일어난다46(그림 3). RNA modification은 tRNA의 안정성과 기능, 생성 과정에 영향을 미치며 최근 연구에 따르면, RNA modification이 암 발생 과정에서 tsRNA의 기능에 중요한 역할을 할 수 있음이 확인되었다.

6. Extracellular tsRNAs

RNA를 포함한 소포체와 막이 없는 RNA/단백질 복합체는 세포에서 세포 외 환경으로 이동할 수 있으며, 이는 표적 세포의 기능에 영향을 미칠 수 있다. Extracellular RNA는 tsRNA를 포함하여 여러 종류의 RNA로부터 유래된 서열을 포함하고 있다(그림 8).

2013년, 쥐의 혈청에 tRNAGly, tRNAVal, tRNAGlu, tRNAHis 등으로부터 유래한 풍부한 5′tRNA halves가 존재한다는 것이 밝혀졌으며, 이러한 5′tRNA halves는 혈액에서 100–300 kDa 크기의 고분자 복합체로 존재한다. 또한, 혈청 내 5′tRNA halves의 양은 나이와 섭취하는 열량에 따라서 변화한다는 보고도 있다. 이러한 조절 패턴과 5′tRNA halves의 알려진 기능 중 하나인 번역 억제는 5′tRNA halves가 새로운 유형의 신호 분자를 구성할 수 있는 가능성이 있음을 보여준다.

2019년 또 다른 연구에서는 tsRNA가 엑소좀에 널리 존재하며, 건강한 사람에 비해 간암 환자의 혈장 엑소좀에서 크게 증가한다는 것을 밝혀내어 tsRNA가 암 진단을 위한 바이오마커로 사용될 수 있음을 보여주었다.

tsRNA는 암 진단과 예후 예측을 위한 바이오마커로 사용할 수 있으며, 암 치료에서 중요한 역할을 할 수 있다. tsRNA를 표적으로 하거나, 이들의 발현을 조절하는 다양한 치료 전략이 제안된다. 결론적으로, tsRNA는 암 연구에서 중요한 역할을 하며, 이들의 기능과 발현 패턴을 이해함으로써 새로운 치료 방법의 개발이 가능할 것이다.

7. 글을 마치며

인간 유전자를 이용한 치료 분야의 최근 기술 발전은 tsRNA와 같은 비번역RNA를 기반으로 한 다양한 질병에 대한 치료제의 가능성을 제시하고 있다. 이러한 기술 발전과 연구 결과를 토대로 특정 tsRNA 및 다른 종류의 비번역RNA를 표적으로 하거나 조절하기 위한 다양한 치료 전략을 구상할 수 있다.

먼저, 다양한 질병 치료에 개발되고 있는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 (antisense oligonucleotide, ASO)를 이용하는 방법이 있다. ASO는 척추성 근육 위축(late-stage development for spinal muscular atrophy), 가족성 고콜레스테롤혈증(familial hypercholesterolemia), 트랜스티레틴 매개 아밀로이드증(transthyretin-mediated amyloidosis) 및 뒤센 근육 위축증(Duchenne muscular dystrophy) 등을 치료하는 데에 있어서 승인 또는 후기 개발 단계에 있다66-68. 이러한 ASO 또는 화학적으로 변형된 올리고뉴클레오타이드의 생체 내 전달은 표적 tsRNA와 tRNA의 발현을 증강하거나 억제할 수 있다.

둘째로는, 아데노 관련 바이러스(adeno-associated virus, AAV)와 같은 바이러스 벡터를 이용하는 방법이다. 바이러스 벡터를 이용하여 tsRNA를 과발현시키거나, 비정상적으로 발현된 tsRNA의 표적 염기서열을 과발현시켜서 tsRNA의 기능을 억제할 수 있다.

세 번째 방법은 tsRNA 생합성과 기능에 영향을 미치는 RNA modification 유전자 발현을 조절하는 것이다. 또한, tsRNA 프로파일은 임상 시험의 맥락에서 바이오마커로 사용될 수 있으며69, tsRNA와 tRNA 간의 조절 관계에 대한 연구를 통하여 새로운 치료 전략을 제공할 수 있다. 암을 비롯한 다양한 질병에서의 tsRNA 역할과 기전에 대한 더 깊이 있는 연구와 앞에서 제시한 다양한 전략을 토대로 질병 치료에 기여할 수 있을 것으로 기대가 된다.

...................(계속)

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