바이오인

박테리아의 CRISPR-Cas9 시스템은 서열-특이적인 유전자 발현 조절을 위한 다기능 플랫폼으로써 대두되고 있다. 본 리뷰는 RNA를 이용해서 유전자를 억제 혹은 촉진시킴으로써 유전자 전사 조절을 하는 과학 기술인 핵산분해효소를 불활성화시킨 Cas9 (dCas9이라고 함)의 개발에 대해 서술한다. 그리고 박테리아와 진핵세포를 비롯한 다양한 유기체에서 이 기술의 다양한 활용에 대해서 서술하고, 현재 유도성 유전자의 조절, 유전체 수준의 스크리닝, 세포 운명 공학과 같이 다양한 부분에서 CRISPR-dCas9이 어떻게 활용되고 있는지 요약 설명하고자 한다. 또한, 이 기술의 전망에 대한 관점을 제시하고, 의생명연구와 의학 분야에서 이 기술이 어떻게 적용될 것인지에 대해서도 서술하고자 한다.

 

본 자료는 Beyond editing: repurposing CRISPR?Cas9 for precision genome regulation and interrogation. Nat Rev Mol Cell Biol. 2016 Jan;17(1):5-15의 논문을 한글로 번역, 요약한 자료입니다.


목 차

1. 서론
2. 교정에서 전사 조절로
  2.1 CRISPRi에 의한 전사 억제
  2.2 CRISPRa에 의한 전사 촉진
  2.3 dCas9을 매개로 한 후성유전학적인 변형
  2.4 동시 다발적인 촉진과 억제
3. Cas9과 dCas9의 특이성
4. CRISPR-dCas9 적용
  4.1 유전체 수준의 스크리닝
  4.2 유도성 CRISPR-dCas9에 의한 유전자 조절
  4.3 세포 운명 공학
5. 결론과 미래 전망


1. 서론

복잡하고 역동적으로 다양한 유전자와 신호전달기작의 전사(tranion)를 조절하는 것은 유전체 복제, 수선, 세포 분열, 분화와 같은 세포의 필수적인 활동을 가동시킨다. 유전자 네트워크의 복잡한 기능을 이해하기 위해서는 관심 있는 유전자를 세밀하게 변형시키거나 유전자의 발현을 억제 혹은 촉진시킬 수 있는 능력이 필요하다. 그러나 아직까지 우리에게는 간단하면서도 확실한 기술이 없었다. Small interfering RNA (siRNA)나 short hairpin RNA (shRNA)를 이용한 RNA-매개 간섭 (RNA interference, RNAi)이 진핵생물의 유전자를 서열 특이적으로 억제할 때 사용되는 주된 접근 방식이었다. RNAi는 유전자의 기능을 연구할 때 편리한 도구이기는 하지만 비효율적이고 비특이적일 수 있다(RNAi는 mRNA와 siRNA 혹은, mRNA와 shRNA 사이에 생기는 왓슨-크릭 염기 결합(Watson?Crick base-pairing)을 이용하여 전사체 특이적인 분해를 일으킴). RNAi 외에 zinc-finger protein이나 tranion activator-like effectors (TALEs)와 같이 주문 제작된 DNA-결합 단백질도 있는데 이들은 서열 특이적으로 DNA를 타겟해서 유전자를 조절하는데 사용되어 왔다. 이들은 프로그래밍이 가능한 DNA 결합 도메인을 통하여 DNA를 정확하게 타겟하며, 전사 억제나 촉진을 위한 효과기들을 모듈 방식으로 끌어들일 수 있다. 그러나 각각의 DNA-결합 단백질은 개별적으로 설계되어야 하므로 제작의 문제와 동시에 여러 좌위를 타겟하는 데에 어려움이 있다는 문제가 있다. 유전자를 과발현시키는 방법에는 cDNA 과발현 벡터나 벡터 라이브러리를 사용할 수 있지만 거대한 cDNA 서열을 바이러스 벡터에 넣어서 클로닝해야 하는 문제와 유전자 동형을 동시에 조작하는 문제, 그리고 대규모의 라이브러리를 합성하는 비용의 문제가 있다. 그러므로 유전체를 조절하는 이상적인 기술은 편리함, 확실하고 정확하게 RNAi를 확장할 수 있는 능력, 그리고 DNA-결합 단백질과 모듈 방식으로 작용 가능함이 모두 충족이 되는 기술이어야만 한다.

박테리아의 CRISPR-Cas 시스템의 발견으로 인해 뉴클레오티드 염기 결합을 매개로 하는 DNA 타겟팅의 새로운 전략이 발전하게 되었다. 타입 II CRISPR 시스템은 엔도뉴클레아제인 Cas9을 사용하는데, 이는 한 개의 가이드-RNA (sgRNA)의 안내를 받아서 sgRNA와 상보적인 서열을 가지는 부분에 정확하게 결합해서 이중가닥절단(double-strand break, DSB)을 유발한다. 핵산분해효소가 없게 조작해서 만든 dCas9은 DNA를 자르지 않으면서 DNA를 타겟하여 시스템을 조절할 수 있다. 앞으로 자세히 다루겠지만, 최근 연구들은 dCas9가 유연하고, RNA-유도 DNA 인식 플랫폼이어서 정확하고 확장가능하며 확실하게 RNA-유도 전사 조절을 해준다는 것을 보여주고 있다.

본 리뷰에서 먼저 유전자 편집을 위한 CRISPR-Cas9 기술에 대한 개괄적인 설명을 하고, 다양한 생명체에서 CRISPR-dCas9을 이용한 전사 촉진과 억제에 대해 다룰 것이다. 그리고 현재의 dCas9 기술이 지니는 장점과 한계점을 조명하고, 현재 생물학 연구에서 이 기술이 적용되고 있는 예시들과 미래 의학 연구에서 이들의 잠재성에 대해서 제시하고자 한다.