바이오인

단일 crRNA 어레이의 자율처리를 통한 CRISPR-Cpf1에 의한 복수 유전자 편집 

요약문

Cas9를 사용하여 복수의 지놈 유전자좌를 표적하는 것은 복수 또는 대형 발현 construct가 필 요하기 때문에 제한적이다. 본 논문에서 우리는 Cpf1이 독자적으로 CRISPR RNA (crRNA)를 처 리할 수 있는 점을 이용하여 복수의 지놈 편집을 단순화시킬 수 있음을 나타내었다. 우리는 customize된 단일 CRISPR 어레이를 사용하여 포유류 세포에서 최대 네 개의, 마우스의 뇌에서 세 개의 지놈을 동시에 편집하였다.

목차

1. 본 내용

2. 방법

1. 본 내용

Cas9을 이용한 복수지놈편집이 가능하지만,  이를 위해서는 상대적으로 큰 크기의 con- struct가 필요하거나 여러 개의 플라스미드가 동시다발적으로 운반되도록 해야 하기 때문에 복수스크리닝 또는 in vivo 응용에 문제가 된다. 대조적으로, Cpf1를 이용할 경우에는 여러 개의 작은 crRNA (crRNA당 39 nt)를 운반하기 위한 하나의 Pol III 프로모터만이 필요하다.  본 논문에서는 Fran- cisella novicida  (FnCpf1)와 포유류 세포 안에서 활성을 갖는 두 개의 Cpf1 orthlog (Acidaminococ- cus Cpf1 (AsCpf1)와 Lachnospiraceae Cpf1 (LbCpf1))의 CRISPR 유전자좌로부터 direct repeat (DR)에 의해 분리되는 네 개의 스페이서로 구성된 인공 CRISPR pre-crRNA 어레이를 사용하여 Cpf1만으로 어레이 처리가 충분함을 확인하였다(그림 1b). 우리는 small RNAseq을 이용하여, FnCpf1 CRISPR 시스템을 이종(異種)발현하는 대장균에서 관찰되는 절단 패턴과 동일한 DR 헤어핀의 5말단에서의 절단되는 fragment와 AsCpf1로 절단된 fragment가 상호관계를 지님을 밝혀냈다(그림 1c).
우리는 어레이 처리가 불가능한 AsCpf1  변이체를 작성함으로써 이러한 결과를 더욱 입증하였다. AsCpf1의 결정 구조를 바탕으로 하여 어레이 처리를 방해할 수 있는 다섯 개의 보존된 아미노산 잔기의 변이체를 작성하였다(H800A, K809A, K860A, F864A 및 R790A). 모든 변이체는 in vitro에서 pre-crRNA  처리를 방해하지만 DNA  절단 활성을 방해하지 않았으며(그림 1d),  이러한 영향은 FnCpf1에서도 관찰되었다. AsCpf1는 DR stem 루프의 5  말단 flank에 있는 특정 뉴클레오타이드를 인식한다. 이 뉴클레오티드의 치환은 RNA 분열을 약화시키거나 폐지시킨다. 다섯 개의 AsCpf1 변이체의 투여실험에서 K809A, K860A, F864A, R790A의 경우에는 고농도 또는 초과 배양 시간 동안 사용될 때 pre-crRNA가 처리됨을 나타내었으나, H800A의 경우에는 투여량과 시간에 상관없이 활성을 나타내지 않았다.

...................(계속)

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