바이오인

 

□ 나노공학자와 임상의료진 간의 공동연구로 조기진단이 매우 중요한 급성심근경색*을 현재 방식보다 훨씬 빠르고 정확하게 진단할 수 있는 기술이 개발됐다. 공학 분야의 나노광센서 기술과 의학 분야의 바이오마커 기술이 결합한 공학-의학 융합연구 성과로서 향후 암, 심혈관 질환 등 난치성 질환을 조기에 진단할 수 있는 시스템 구축에 크게 기여할 것으로 기대된다.

 

* 급성심근경색(Acute Myocardial Infarction, AMI) : 관상동맥이 막혀 혈액을 공급받는 심장근육이 손상을 입는 질환, 조기에 치료하지 않으면 사망률이 급격히 증가

 

o 한양대학교 생명나노공학과 주재범 교수, 전향아 박사(제1저자) 등과 고려대 구로병원 진단검사의학과 윤수영 교수팀이 미래창조과학부와 한국연구재단이 추진하는 선도연구센터지원사업 등의 지원으로 수행한 이번 연구결과는 영국 왕립화학회(RSC)에서 출간하는 케미컬 커뮤니케이션스誌(Chemical Communications) 1월 10일자 온라인판에 게재되었으며, 2월 프린트판 표지 논문으로도 게재될 예정이다.

 

 

□ 심근경색은 증상이 나타난 후 한 시간 이내에 사망하는 환자가 전체 사망자의 절반 이상이기 때문에 신속한 치료가 중요하다. 따라서, 시간과 장비가 요구되는 X-ray나 심전도 등의 기본검사, 심장초음파 등의 정밀검사와는 별개로 신속한 혈액진단 방법의 개발이 요구되어 왔다.

 

o 현재 상용화되어 널리 쓰이고 있는 심근경색 진단기기는 혈액 속의 바이오마커를 형광전이*기술을 이용하여 진단하고 있는데, 각각의 마커당 15분이 소요되며, 한 번에 하나의 마커에 대해서만 검출할 수 밖에 없었다. 또한 검출 한계도 1～10ng/mL이다.

* 형광전이(fluorescence resonance transfer, FRET) : 가까이 위치한 두 형광물질 간에 일어나는 에너지 전이 현상을 이용해 단백질 등 물질상호간의 결합 등을 검출하는 기술

 

□ 연구팀은 대표적 심근경색 바이오마커인 CK-MB, cTnI 2 종류를 동시에 고감도로 검출할 수 있는 센서를 개발했다.

 

o 동 연구에서는 최근 활용도가 높아진 표면증강 라만 산란* 현상을 이용, 증폭된 산란 신호를 발생하는 금 나노입자를 합성하고 이 나노입자에 CK-MB 및 cTnI 항원을 부착하였다. 또한, 두 마커의 항체가 고정된 자성 나노입자를 별도로 제작하였다.

* 표면증강라만산란(Surface-enhanced Raman Scattering, SERS) : 빛이 물질에서 반사될 때, 입사광과 산란광이 같은 파장이면 Rayleigh 산란, 파장이 길거나 짧으면 라만 산란이라고 함. 금속 나노구조체에는 특정 파장의 빛을 쪼이면 표면 자유전자들 간의 공명으로 입사된 빛보다 100~1000배 이상 증폭된 빛이 만들어지는데, 특히 금속나노입자 표면에 흡착된 분자가 증폭된 빛과 상호작용을 하면 증폭된 라만산란을 유발하고 이러한 효과를 표면증강라만이라 한다.

 

o 제작된 입자들을 활용하여 혈액 속의 바이오마커와 나노입자가 경쟁적으로 항체와 결합하려는 반응을 이용한 검출 센서를 개발한 것으로, 실제 18명의 환자 혈액으로 시험한 결과, 기존 센서보다 100배 이상의 감도(0.30～4.70ng/mL)로 두 바이오마커를 15분 이내에 동시에 검출할 수 있었다.

 

□ 한편 연구팀은 고감도와 다중검출이 가능하다는 장점을 지닌 표면증강라만 기술을 이용해 혈액진단 센서에 광 감지 기능도 담아 임상에 적용한다는 계획이다.

 

o 주재범 교수는 “향후, 본 기술을 전립선암 마커, 류마티스 자가항체, 성조숙증 진단마커의 다중검출 등에도 활용하고, 관련 질환에 대한 나노 의료진단 광센서를 개발하는데 주력할 계획”이라고 밝혔다.

 

 

 

 

미국 심장병협회의 최근 보고에 의하면 심근경색(AMI)으로 의심되는 환자의 경우, 자각 증상이 일어난 후 2시간 내에 응급조치가 이루어지지 않으면 사망률이 급격히 증가하는 것으로 보고되었다. 즉, AMI의 발병 후 조기에 이를 신속하고 정확하게 진단할 수 있는 조기 진단 기술의 개발이 임상학적으로 매우 중요하다고 할 수 있다. 조기진단을 위한 최근의 연구 경향은 발병 시 혈액 중에 존재하는 바이오마커의 농도를 정확하게 결정하는 것이다.

 

CK-MB와 cTnI는 심근경색 진단에 이용되는 대표적 바이오마커이다. 바이오마커의 농도를 결정하기 위하여 미국 Biosite사에서 형광전이 (FRET) 현상을 이용한 심근경색 진단기기가 상용화되어 대학병원에 널리 보급되었으나 이 장비는 각 마커 당 15 분의 진단 시간이 소요되며, 검출 한계가 1-10 ng/mL 정도이고, 여러 개의 마커를 동시에 검출하는 것이 불가능하다. 따라서 임상학적으로 심근경색의 조기진단을 위해서는 좀 더 빠르고 감도가 좋으며, 두 개의 마커를 동시에 검출할 수 있는 새로운 심근경색 진단기술의 개발이 절실한 실정이다.

 

 

최근에 금이나 은과 같은 금속 나노입자에 흡착된 분자의 광 증폭 현상을 이용한 SERS 기술을 이용한 바이오 분석법이 의료진단에 널리 활용되고 있다. 본 연구에서는 기능성 나노입자를 이용한 SERS 기반의 면역진단 기술을 이용하였는데, 바이오마커와 금속 나노입자의 경쟁 반응을 이용하여 CK-MB와 cTnI 마커를 15분 내에 고감도로 동시 검출할 수 있는 신개념의 심근경색 진단 기술을 개발하였다.

 

본 연구는 한양대 ERC 센터와 고려대병원 진단검사의학과 간의 협동연구로 진행되었는데, 임상의가 현재 진단검사의학과에서 이용되는 심근경색 진단기술의 한계성과 진단에서 중요한 요소들에 관한 내용들을 공학자가 이해하기 쉽게 설명하고, 공학자는 이를 기반으로 실제로 임상에 적용할 수 있는 신개념의 진단 기술을 개발하였다. 또한 기술 개발 과정에서 실제 임상 적용을 위해서 고려되어야 할 사항들을 수시로 논의하였다. IRB를 통하여 허가받은 실제 심근경색 환자들의 임상시료와 진단검사의학과 분석결과를 제공받아 개발한 SERS 기반의 면역분석 결과와 비교/분석함으로써 임상에 적용할 수 있는 신뢰성 높은 혈액 진단 기술을 개발하는데 주력하였다. 본 연구 결과는 의학자-공학자 간의 긴밀한 협동연구체계 구축을 통한 대표적인 융합연구 성공 사례로 판단된다.

 

본 연구진은 혈액 내에 미량으로 존재하는 CK-MB 및 cTnI 두 종류의 마커를 동시에 검출하기 위하여, 증폭된 라만 시그널을 낼 수 있는 두 종류의 금 나노입자 (SERS nano tag)를 합성하였으며, 이들 마커와 경쟁적으로 결합할 수 있는 CK-MB antigen, cTnI antigen를 각각 나노입자에 고정화 (conjugation)시켰다. 혈액 내의 마커와 나노입자의 경쟁적인 항원-항체 결합을 유도하는 반응지지체로는 각 항체가 고정된 자성 나노입자를 사용하였다.

 

SERS nano tag의 확인에는 자외선 흡수 분광기, 형광분광기, 전자현미경, 광산란분광기, 공초점 레이저 현미경 등이 이용되었으며, 나노입자와 혈액 내 바이오마커의 경쟁 반응을 통한 마커의 정량분석을 위해서는 자체 제작한 공초점 레이저 라만 현미경을 이용하였다. 먼저, 상용화된 CK-MB와 cTnI 각각의 항원에 대한 독립적인 면역분석 실험을 통하여 단일 항체의 정량화 곡선을 얻었으며, 두 항원을 일정한 몰농도 비율로 혼합하고 두 세트의 금 SERS nano tag과 항체가 고정화된 자성 나노입자를 일정 비율을 혼합하여 경쟁반응을 통한 두 항원의 동시 검출을 수행하였다.

 

마지막으로 고려대학병원에서 IRB 심사 후 50명의 심근경색 환자들에 대한 혈액 세럼과 현재 진단검사의학과에서 이용하고 있는 gold standard 방법인 electro-chemiluminescence 검사 결과를 제공받아 그 중 두 마커의 농도가 현저한 차이를 보이는 18명의 환자 혈액 샘플에 대한 SERS 에세이를 수행하였다. 본 SERS 에세이 방법은 15 분 내에 두 종류의 마커를 0.30 ∼ 4.70 ng/mL 검출 한계 이하로 동시에 검출할 수 있으며, 이는 현재 병원 진단검사의학과에서 이용되는 검사 방법보다 훨씬 빠르고 정확하게 심근경색을 진단할 수 있다는 것을 의미한다.

 

 

이번 연구는 난치성 질환인 심근경색을 조기에 진단할 수 있는 새로운 개념의 나노 광센싱 기술을 개발하였다는데 의의가 있으며 의학-공학 연구의 대표적인 성공 사례로 판단된다.

 

앞으로 연구는 크게 두 가지 방향으로 진행 될 예정이다. 첫 번째는 본 기술을 이용하여 좀 더 많은 종류의 바이오마커를 동시에 검출하여 진단 신뢰성을 높이는 방향으로 연구가 진행될 예정이며. 두 번째는 이러한 혈액 분석을 소형화 진단시스템에서 구현할 수 있는 microfluidics 기반의 통합형 SERS 광학센싱 시스템을 구현할 예정이다. 본 연구가 성공적으로 수행되면 혈액분석을 통하여 난치성 질환을 조기에 진단할 수 있는 point-of-care (POC) 시스템이 성공적으로 개발될 수 있을 것으로 기대된다.  

 

이번 성과 뭐가 다른가		새로운 개념의 혈액분석을 통한 심근경색 진단 기술의 개발
어디에 쓸 수 있나		신개념의 심근경색 조기진단 기술로 임상 진단에 활용
실용화까지 필요한 시간은		진단기술 : 특정 마커의 다중 진단 기술 확보되어 임상 적용까지는       5～6년 소요 예상. 진단 시스템 : 시스템 개발까지는 7-8년 소요 예상.
실용화를 위한 과제는		다중 마커 분석을 통한 신뢰성 학보 나노광센서 기반의 진단 시스템 개발 및 상용화
연구를 시작한 계기는		선도연구센터 사업을 계기로 의학-공학 융합 연구가 활성화됐으며, 임상의가 현재 심근경색 진단 기술의 한계성을 제시하여 신기술 개발에 관한 토의가 활발히 이루어짐.
에피소드가 있다면		협동연구 초창기에 의학자-공학자 간의 협동연구를 위한 회의시에 서로 사용하는 용어와 중요하게 여기는 가치 관점의 차이로 인하여 소통이 어려웠음
꼭 이루고 싶은 목표는		본 기술이 실제 임상 진단에 활용되는 동시에 진단 시스템을 제작하여 상용화 하는 것
신진연구자를 위한 한마디		개인의 생각과 역량으로 연구하는 것은 한계가 있음. 좀 더 열린 마음으로 목적 지향적인 다학제간 융합연구에 관심을 좀 더 가지시기를 바람.

 

 

O 영국화학회 (Royal Society of Chemistry, RSC)가 매월 발간하는 국제학술지

(영향력 지수 6.4, 2013년 기준)

 

O 가까이 위치한 두 형광물질 간에 일어나는 에너지 전이 현상을 이용해 단백질 등 물질상호간의 결합 등을 검출하는 데 이용된다.

 

O 금속 나노구조체에 특정 파장의 빛을 쪼이면 표면의 자유전자가 진동하는데 이들 상호간의 공명으로 입사된 빛보다 100배 내지 1000배 이상 증폭된 전자기장이 만들어진다. 특히 금속나노입자 표면에 흡착된 분자가 증폭된 빛과 상호작용을 하면 증폭된 라만산란을 유발하고 이러한 효과를 표면증강라만 증폭이라 한다.

O 혈액이나 소변에 들어 있는 물질로 생체 내 생물학적 변화를 정량적으로 파악하기 위한 지표가 되는 생물화학물질을 말한다. 예를 들면, 당뇨병의 경우 glucose를, 신장기능 평가에는 알부민을, 간기능 평가에는 널리 알려진 GPT, GOP를 각각 바이오마커로 이용한다.

O 바이오마커의 농도는 특정 질병에 대하여 양적으로 변화하기 때문에 이를 질병 진단에 활용할 수 있다. 최근 임상적으로 많은 난치성 질환의 바이오마커가 발견되어 진단에 활용되고 있다.

 

O 임상시험에 참여하는 환자의 권리ㆍ안전ㆍ복지를 보호하기 위하여 연구 기관 내에 독립적으로 설치한 상설위원회로 병원 내에서 다루어지는 모든 임상연구에 대하여 사전에 IRB에 심사를 받아 "승인"을 받은 후에 진행하도록 되어있다.

 

 

두 종류의 기능성 금 나노입자와 경쟁 면역분석 반응을 이용한 심근경색 마커 CK-MB와 cTnI의 고감도 정량 분석에 관한 모식도. 혈액 내에 존재하는 심근경색 마커 단백질 트로포닌 I(cTnI, 붉은색) 및 CK-MB(파란색)가 이들이 각각 결합된 금 나노입자(노란색 구)와 서로 경쟁하면서 각 마커에 대한 항체가 붙어 있는 자성입자(일부만 보이는 울퉁불퉁한 회색 구)에 고정되면 조사된 레이저에 의해 측정되는 표면증강 라만 시그널의 세기로부터 혈액 내 두 마커 단백질(붉은색과 파란색)의 양을 동시에 정량적으로 분석할 수 있다.

 

 

⒜ 사용되는 입자 모식도

(첫째줄) 항체를 고정시킬 수 있는 자성입자(CaptureCK-MB, CapturecTnI)

(둘째줄) 심근경색 마커(CK-MB, cTnI)와 경쟁관계에 있는 마커가 부착된 금 나노입자들(HGNCK-MB, HGNcTnI)

(셋째줄) 왼쪽부터 마커(CK-MB)와 결합하는 항체와 마커, 형광물질

(넷째줄) 왼쪽부터 마커(cTnI)와 결합하는 항체와 마커, 형광물질

 

⒝ 혈액에 포함된 두 종류의 심근경색 마커와 금 나노입자 간의 경쟁면역반응

두 종류의 나노입자와 두 종류의 자성입자를 혈액으로부터 분리한 용액과 혼합하여 각 마커(CK-MB와 cTnI)의 경쟁반응을 유도하는데 약 14분 가량이 소요된다.

 

⒞ 남아있는 나노입자에 대한 SERS 시그널 검출

반응이 종결된 후 상층액을 모세관에 추출하여 633 nm 파장의 레이저를 조사한 다음 각 금 나노입자의 특징적인 표면증강 라만 시그널 세기를 측정하여 혈액내 각 마커의 농도를 정량하는데 약 1분 가량이 소요된다.

   

 

큰 자성입자(3μm 크기, 회색 큰 구)와 작은 자성입자(1μm 크기, 회색 작은 구)에 각각 Ck-MB와 cTnI에 대한 항체를 고정하고 각 자성입자에 결합하는 금 나노입자의 전자현미경 이미지를 관찰하여 각 자성입자에 대한 선택성을 관찰하였다. 금 나노입자가 결합한 경우 티끌 같은 작은 점들이 관찰된다.

 

그 결과 (a) 경쟁하는 두 마커의 농도가 0ng/mL 인 대조군에서는 두 자성입자 모두에 금 나노입자가 결합하였으나, (b) 경쟁하는 두 마커의 농도가 동일하게 100ng/mL인 대조군에서는 두 자성입자 모두에 금 나노입자가 결합하지 않았다.

 

반면 (c) cTnI만 100 ng/mL 농도로 들어있는 경우 큰 자성입자에 CK-MB 나노입자만 결합하고, (d) CK-MB만 100 ng/mL 농도로 들어있는 경우에는 반대로 작은 자성입자에는 cTnI만 결합되어 있는 것으로 나타나 두 마커의 자성입자에 대한 선택적인 결합성을 확인할 수 있었다.  

 

두 종류의 마커에 대한 표면증강라만산란(SERS) 신호를 한 번에 측정하여 두 마커의 농도를 동시에 결정하는 고감도 다중 분석이 가능함을 확인할 수 있다.

(a) cTnI 농도차이에 따른 라만피크 세기의 변화(아래 그림에서 붉은색 그래프)

(b) CK-MB 농도차이에 따른 라만피크 세기의 변화(아래 그림에서 파란색 그래프)