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핵심내용

상세내용

 연 구 결 과  개 요

1. 연구배경

리간드-수용체(막 단백질, 세포막 단백질)간 상호작용은 세포 안과 밖의 신호전달을 매개함으로써 생명유지에 필수적인 역할을 하는 것뿐만이 아니라, 수많은 질병의 원인 인자로서 현재 개발된 50% 이상의 신약들이 리간드-수용체간 상호작용을 대상으로 하고 있다. 이러한 중요성에도 불구하고, 세포막 위에서 일어나고 있는 리간드-수용체간 상호작용에 대한 이해가 많이 부족한 상황이다. 이는 전체 유전자의 15% 이상 되는 다양한 단백질들이 세포막 위에서 매우 높은 농도로 존재함으로써 나타나는 복잡성과 친수성 및 소수성을 모두 가지는 세포막의 생화학적 특이성이 만들어 내는 특수한 환경 때문이다. 현재까지는 기술적인 제약으로 인해 리간드-수용체의 상호작용의 연구가 시험관 수준에서 이루어졌지만 실제 세포막 위에서 나타나는 이들 상호작용의 본질적인 성질을 밝혀내는데 아직까지 기술적으로 큰 한계가 있다.

단백질의 확산을 기반으로 한 영상 기법들을 통해 살아있는 세포에서 단백질들의 고유한 확산 성질을 이용하여 단백질들의 상호작용을 측정할 수 있다. 그러나 세포질의 단백질의 확산과는 달리 수용체의 경우 세포막의 높은 점성도로 인해 확산 성질이 매우 달라진다. 40여 년간 세포막 단백질 유동의 표준모델로서 받아들여져 왔던 샤프만-델브룩 모델에 따르면 세포막의 높은 점성도를 가지는 지질 특성으로 인해 수용성인 리간드가 수용체에 결합하더라도 수용체의 움직임이 변화하지 않는다. 따라서 이러한 가설에 입각하여 수용체의 확산을 기반으로 한 방법들은 다른 방법들에는 없는 많은 장점들에도 불구하고 리간드-수용체 간 상호작용을 측정하는 것이 근본적으로 불가능하다고 생각되어 왔다.

2. 연구내용

최근 초해상도 현미경이 발전하면서 단일 분자 수준에서 수용체의 움직임을 직접 측정할 수 있게 되었다. 살아있는 세포의 세포막 위에서 단일 수용체의 움직임을 단일 분자 추적 기술을 통해 분석하여 각 수용체의 움직임의 속도를 나타내는 확산계수를 결정할 수 있다. 이 방법을 단일 분자 추적 광활성 위치 현미경(single particle tracking using photoactivated localization micros, sptPALM) 이라고 부른다. 본 연구진은 sptPALM을 통해 살아있는 세포의 세포막 위에서 상피세포성장인자 수용체(epidermal growth factor receptor, EGFR)의 확산을 단일 분자 수준에서 관찰하였고, 우연히 이 수용체를 표적으로 하는 항체 항암제인 세투시맙(cetuximab)에 의해 이 수용체의 확산이 40% 정도 느려진다는 것을 관찰하였다. 이 관찰을 통해 기존의 샤프만-델브룩 모델과는 달리 리간드가 수용체에 결합하였을 때 수용체의 확산이 변할 수 있을 것이라는 가설을 세우게 되었다.

이를 위해 상피세포성장인자 수용체의 N 말단에 Myc tag을 부착시키고, 어떠한 이차적 효과가 없는 Myc tag을 표적으로 한 항체를 처리하였을 때, 이 수용체의 확산이 세투시맙과 마찬가지로 40% 정도 저해된다는 것을 관찰할 수 있었다. 또한, 하나의 항체 분자가 두 개의 표적 단백질과 결합할 수 있기 때문에 Myc tag을 표적으로 하는 항체의 Fab fragment를 만들어, 여전히 이 수용체의 확산이 Fab fragment의 결합에 의해 저해되는 것을 밝혀내었다. 이 때 이 수용체의 확산의 감소 폭이 항체에 비해 조금 줄어든 16% 정도였다. 위의 결과는 세투시맙 뿐만이 아니라 상피세포성장인자 수용체의 세포 밖 부분의 서로 다른 위치에 결합하는 항체들에 대해서도 같은 결과를 얻을 수 있었다. 또한, 상피세포성장인자 수용체와 같은 family에 속하는 수용체들에 대해서도 항체의 직접적인 결합이 이들의 확산을 저해한다는 것을 보였다. 세포막을 투과하는 부분을 하나만 가지는(single-transmembrane domain) 상피세포성장인자 수용체와는 달리 세포막을 투과하는 부분을 일곱 개를 가져(seven-transmembrane domain) 세포막에 매우 의존적인 G 단백질 연결 수용체(G-protein-coupled receptor, GPCR)에 대해서도 수용성인 항체의 직접적인 결합이 이 수용체의 확산을 저해한다는 것을 관찰할 수 있었다. 이 일련의 결과들을 통해 본 연구진은 기존의 사프만-델브룩 모델과 다르게 실제 세포막 위의 수용체의 움직임을 단일 분자 수준에서 관찰하였을 때 리간드의 직접적인 결합이 수용체의 확산을 감소시킨다는 원리를 밝혀내었다. 이 새로운 원리를 바탕으로 리간드-수용체 간 결합을 분석하는 방법을 단일 분자 확산 변화 측정법(single-molecule diffusional-mobility shift assay, smDIMSA)이라고 명명했다.

smDIMSA는 단일 단백질의 확산을 기반으로 하는 방법이기 때문에 리간드가 붙어있는 단백질과 붙어있지 않은 단백질을 단일 분자 수준에서 확산의 차이로 정량적으로 구별할 수 있다. 이러한 성질을 바탕으로 세투시맙의 농도에 따라 세투시맙이 상피세포성장인자 수용체에 붙어있는 정도를 측정함으로써 이들 간의 해리상수를 살아있는 세포에서 직접 계산할 수 있다. 하나의 COS7 세포에서 세투시맙의 농도를 점점 증가시켜가며 각 농도에 따른 상피세포성장인자 수용체의 확산계수를 측정하였고, 이를 통해 세투시맙의 이 수용체에 대한 해리상수를 측정한 결과 약 0.62 nM 이었다. 이 결과는 기존의 시험관(in vitro)에서 측정된 결과와 비슷한 수준이었다. 또한, 세투시맙은 상피세포성장인자 수용체에 결합 협동성(binding cooperativity)이 없다는 것을 Scatchard plot을 통해 알 수 있었다.

흥미롭게도 여러 종류의 암에서 많이 발견되는 상피세포성장인자 수용체의 돌연변이(mutant)인 EGFR L858R에 대한 세투시맙의 결합을 정량적으로 분석하였을 때, 결합 협동성이 없었던 정상 형태의(wild-type) 수용체와는 달리 양성 협동성(positive cooperativity)이 나타나는 것을 관찰하였다. 결합 협동성은 두 개 이상의 결합 위치가 존재할 때 하나의 위치에 대한 결합이 단백질의 구조변화(conformational )를 유도하여 다른 위치의 결합에 대한 결합세기(affinity)를 변화시킬 때 나타난다. EGFR L858R은 보통 단량체(monomer)로 존재하는 정상형태의 상피세포성장인자 수용체와는 달리 대부분 이합체(dimer) 상태로 존재한다고 알려져 있다. 따라서, 이 양성 협동성은 첫 번째 세투시맙 분자가 이합체인 EGFR L858R과 결합할 때는 어렵지만(unfavorable), 이 첫 번째 결합이 이합체인 EGFR L858R의 구조변화를 일으켜 두 번째 세투시맙 분자가 결합할 때는 결합이 촉진(facilitated) 되는 것이라고 해석할 수 있다. 이 일련의 결과를 통해 기존에 논란이 많았던(controversial) 이합체인 EGFR L858R의 세포 밖 부분의 구조(conformation)를 밝혀내었다.

3. 기대효과(연구 성과의 의미) 

40여 년간 세포막 단백질 유동의 표준모델로서 받아들여져 왔던 1975년에 정립된 샤프만-델브룩 모델에 따르면 인지질 이중층으로 이루어진 세포막의 높은 점성도로 인해 수용성인 리간드가 수용체에 결합하더라도 수용체의 움직임이 변화하지 않는다고 믿어져왔다. 그러나 본 연구에서 기존에 측정이 불가능했던 단일 분자 수준에서의 세포막 수용체의 움직임을 직접적으로 관찰함으로써 리간드가 수용체에 결합하였을 때 그 움직임이 변화한다는 사실을 밝혀냄으로써 막 단백질의 유동 이론에 대한 기존의 패러다임을 바꿀 수 있는 매우 중요한 증거를 제시하였다.

본 연구에서 개발된 기술인 smDIMSA는 수용체에 결합하는 리간드의 크기를 정량적으로 인식하는 방법을 사용하기 때문에 리간드에 어떠한 표지 없이 대상 수용체에 대한 신약 리간드의 스크리닝이 가능하며, 기존의 방법들과 비교하였을 때 혁명적인 장점들을 가지고 있다. 리간드-수용체의 결합을 측정하기 위해서는 일반적으로 리간드에 방사성 동위 원소나 형광물질을 화학적으로 표지해야 검출이 가능하다. 그러나 수많은 종류의 신약 리간드 후보들을 선별하기 위해서는 이러한 표지방법은 엄청난 비용과 시간이 필요하기 때문에 신약 선별을 위해서는 리간드 비표지적 방법이 필수적이다. 현재 상용화되어 주로 사용되고 있는 표면 플라즈몬 공명(Surface Plasmon Resonance)을 이용한 비표지적 방법은 복잡하고 힘들게 정제한 대상 단백질을 값비싼 금표면에 부착시켜 리간드와의 결합을 측정하게 된다. 특히, 수용체의 경우 높은 세포막 의존도로 인해 정제가 어려워 그 측정이 더욱 힘들었다. smDIMSA는 살아있는 세포에서 리간드-수용체간 상호작용을 직접 측정함으로써 시험관 실험(in vitro assay)에서 오는 양성 및 음성 오류들을 현저히 줄일 수 있고, 까다로운 세포막 단백질 정제 과정을 완전히 없애고, 비용적인 측면에서 기존 대비 수천 배 이상 절약할 수 있다. 따라서 본 연구는 신약 후보 물질을 선별하는 데도 큰 기여를 할 것이라고 기대하고 있다.

연 구 결 과 문 답

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