바이오인

핵심내용

해양미생물에 존재하는 이온수송 세포막 단백질의 구조 및 작동 메커니즘 최초 규명
- 우울증 등 뇌질환의 광유전학 치료에 적용 기대 -

□ 한국연구재단(이사장 조무제)은 조현수·김지현 교수 연구팀(연세대 시스템생물학과)이 “해양 박테리아에 존재하는 이온 수송 단백질(광활성 염소 이온 펌프*)의 구조를 세계 최초로 규명하여 바다에 사는 박테리아가 어떻게 빛을 이용해서 생존하고, 자라는지에 대한 메커니즘을 발견함으로써 뇌·신경 연구의 새로운 발판을 마련했다.”고 밝혔다.
    *광활성 염소 이온 펌프 : 빛에 의해 활성화되어 작동하는 염소수송 막단백질

□ 연구팀은 바다에 살고 있는 미생물 중 박테리아(세균)의 로돕신*을 신경세포에 이식하여 신경세포 사이의 신호를 마음대로 조작하는데 쓰이는 로돕신의 입체구조를 세계 최초로 규명하고, 구조 정보를 바탕으로 염소 수송* 메커니즘을 분자 수준에서 밝혀냈다. 
    *로돕신 : 광활성 이온 펌프 단백질
    *염소 수송 : 염소이온이 세포 안으로 이동되는 것

□ 염소로돕신 펌프는 빛을 이용해서 염소 이온을 세포 안으로 특이적으로 이동시켜 이온 농도의 차이를 형성시키고 이를 이용해서 박테리아의 성장을 촉진시킨다. 연구결과, 염소로돕신 펌프는 염소 이온과 결합하는 부위의 아미노산 서열과 구조가 독특한 형태로 이루어져 있어 새로운 메커니즘으로 염소이온을 수송한다는 사실을 발견했다.

□ 로돕신은 최근 뇌·신경 연구의 혁신적으로 이용되고 있고 태양의 빛에너지를 생체에너지로 바꾸는데 이온펌프 기능*을 수행

함으로써 지구 생태계와 세포대사에서 매우 중요한 역할을 한다.
    *이온펌프 기능 : 세포막을 경계로 이온 농도 구배를 형성함.  

□ 조현수 교수는 “순수 국내 연구진의 힘으로 7년 만에 막단백질*의 구조를 밝혀냈다. 이번 연구결과로 지구 생명체의 빛에너지 이용에 대한 이해를 심화시키는 이론적 근거를 마련하였으며, 우울증, 간질 등 뇌·신경 연구에 사용되는 광유전학* 등에의 적용 가능성을 높이게 되어 신약개발에 대한 기대도 높이게 되었다.”라고 연구의 의의를 설명했다. 
     *막단백질 : 세포막에 존재하는 단백질
     *광유전학 : 빛을 신호로 신경세포 등의 활성을 조절하는 연구 방법

□ 이 연구 결과는 미래창조과학부 기초연구사업(개인연구), 원천기술개발사업(포스트게놈 다부처 유전체사업), 농림축산식품부 미생물유전체전략연구사업, 교육부 BK21플러스사업의 지원을 받아 수행되었으며, 세계적인 과학 학술지인 네이처 커뮤니케이션스(Nature Communications) 8월 24일자에 게재되었다.

논문의 주요 내용

□ 논문명, 저자정보

   - 논문명 : Crystal structure and functional characterization of a light-driven chloride pump having an NTQ motif
   - 저자 정보 : 조현수 교수(교신저자, 연세대), 김지현 교수(교신저자, 연세대), 김국래 학생(제1저자, 연세대), 권순경 박사(공동제1저자, 연세대), 전성훈 박사(공동제1저자, 연세대), 차정석 학생(참여저자, 연세대), 김호영 학생(참여저자, 연세대), 이원태 교수(참여저자, 연세대)

□ 논문의 주요 내용

 1. 연구의 필요성

   ○ 최근 연구에서 플라보박테리아*(flavobacteria) 등 여러 해양세균에서 발현되는 로돕신들이 빛에너지를 받아 종류에 따라 수소, 염소, 소듐 등의 이온을 세포 안과 밖으로 퍼 나른다는 것이 기능 연구를 통해 밝혀졌다. 로돕신의 특정 활성화 부위에 DTE 아미노산 모티프*를 가지는 프로테오로돕신(PR)*은 수소이온을, NDQ 모티프를 가지는 소듐로돕신(NaR)은 소듐이온을, 그리고 NTQ 모티프를 가지는 염소로돕신(ClR)은 염소이온을 펌핑*하는 기능을 가진 것으로 연구되었고, DTE와 NDQ 모티프를 갖는 로돕신들은 구조가 규명되어 작용 메커니즘이 잘 설명되었다. 하지만 NTQ 모티프를 갖는 ClR의 구조는 아직까지 연구가 되어있지 않았고, 그 작용 메커니즘 연구도 미흡한 실정이었다. 따라서 세계적으로 여러 로돕신 연구그룹들이 경쟁적으로 염소로돕신의 구조를 규명하는 연구를 진행하고 있었다.
       *플라보박테리아 : 로돕신 단백질을 발현하여 색깔을 띄는 세균의 한 종류
        *DTE 아미노산 모티브 : 박테리아 수소 이온 펌프에서 수소 이온 수송에 직접 관여하는 아미노산으로 이루어진 모티브
        *프로테오로돕신 : 박테리아에 존재하는 수소 이온 펌프
        *펌핑 : 이온을 농도 구배에 역행하여 수송함. 

 2. 연구내용

   ○ 염소로돕신 단백질의 과발현 및 분리 정제
     해양박테리아의 염소로돕신을 대장균에서 과발현하고 세포를 파쇄한 후 초원심분리를 통해 세포막 부분만 순수하게 얻었다. 세포막을 물에 녹인 후 여러 번의 정제 과정을 거쳐 단백질을 순수 분리하였다.

   ○ 염소로돕신의 결정구조 규명
     막단백질 결정화를 위해 Lipidic Cubic Phase (LCP) 방법을 이용하여 결정화 선별작업*을 하고, 최적화 과정을 거쳐 회절에 적당한 크기의 결정 확보에 성공했다. 일본 PF 가속기와 포항 가속기연구소에서 X-선 회절 데이터를 얻었으며, 최종적으로 1.57 옹스트롱의 고해상도의 구조를 규명할 수 있었다.
     ＊결정화 선별 방법 : 약 1,000여 가지의 다양한 조건에서 결정화 조건 선별

  ○ 구조기반 작용 메커니즘 규명
     고해상도로 규명된 구조 분석을 통해서 단백질 내부에 두 개의 염소 이온이 결합하는 부위를 파악했고, 이 정보로부터 이온이 세포 밖에서 세포 안으로 들어오는 이동 통로와 작용 메커니즘을 제시하였다. 이를 증명하기 위해 활성화에 중요한 잔기들을 돌연변이 시키면서 펌프 기능을 테스트하였고, 그 결과를 면밀히 분석하여 제시한 작용 메커니즘이 적절함을 검증하였다.

 3. 연구 성과

   ○ 광유전학 기술에 염소로돕신 활용 기대
 신경세포의 신호전달은 세포막 전위차에 의해 형성된 분극 상태에서, 탈분극과 재분극을 거쳐 신호가 전달된다. 광유전학에서는 이 신경세포에 양이온과 음이온을 펌핑하는 로돕신들을 발현시킨 상태에서 각각의 로돕신에 맞는 파장의 빛을 조사하면 로돕신들이 특정이온들을 펌핑하게 되고 그 결과 세포막의 탈분극 또는 재분극을 일으켜 세포내로 신호를 인위적으로 전달되게 된다. 본 연구진이 규명한 염소로돕신은 매우 안정적인 단백질로서 신경세포에서 과발현시켜, 광유전학 연구에 활용하면 좀 더 정밀한 신호조절이 가능할 것으로 기대된다.

  ○ 국내 최초의 막단백질 구조 규명 성공
     이번 막단백질 구조 규명은 순수 국내 연구진만으로 최초로 성공한 것이며, 이는 한국도 신약개발 및 기능 연구에 매우 중요한 막단백질 구조 연구 분야에서 뒤떨어지지 않을 여러 기술적 노하우가 축적되었으며 더 이상 막단백질 구조 연구의 불모지가 아니라는 것을 의미한다.

상세내용

 연 구 결 과  개 요

 1. 연구배경

  ㅇ 지구 전체 바이오매스 생산의 대다수를 차지하는 해양생태계에서 미생물은 지구의 물질순환과 에너지 균형 유지에 중요한 역할을 하고 있으며, 해양 환경에 서식하는 대다수의 미생물이 보유한 광활성 단백질인 로돕신(microbial rhodopsin)의 발견과 그 기능에 관한 연구는 엽록소를 이용한 광합성 반응이 태양에너지를 생체에너지로 포획하는 유일한 수단으로 여겨졌던 기존의 관념에 큰 변화를 가져왔다. 로돕신은 광활성 이온채널 혹은 센서로서, 빛을 받으면 로돕신 내 레티날의 구조변화를 유도하여 이온을 막 내외로 수송하는 단백질이다. 실제로 미생물로돕신이 활용하는 가시광선은 광합성세균 혹은 식물이 이용하지 않는 빛의 파장대로서, 해양에 광범위하게 존재하는 미생물로돕신은 해수 표면에 도달하는 태양에너지를 해양생태계에서 효율적으로 활용할 수 있도록 한다.

  ㅇ 세균(Bacteria)에 존재하는 로돕신의 구조와 기능 및 응용 관련 연구는 해양에 가장 광범위하게 분포하며 또한 2000년에 가장 먼저 발견된 양성자이온펌프인 프로테오로돕신(PR)에 집중되어 왔다. 수소이온펌프 로돕신의 경우 막 내외로 수소이온 농도 구배 차이를 발생시켜 ATP 중합효소로 하여금 생체에너지 생성을 유도하는 것으로 알려져 있다. 이후, 독도 바닷물에서 분리된 동해독도(Donghaeana (Nonlabens) dokdonensis) DSW-6 균주에 소듐이온펌프 로돕신(NaR)이 존재한다는 것이 2013년에 본 연구진에 의하여 최초로 발견되었다. 세균 유래 염소이온펌프 로돕신(ClR)은 2014년에 논라벤스 마리너스(Nonlabens marinus) S1-08 균주에서 최초로 보고되었다.

  ㅇ 로돕신 단백질들이 빛에너지를 이용하여 각각 다른 이온들을 세포 안팎으로 이동시킬 때, 이온수송에 중요한 역할을 하는

아미노산 잔기들이 존재한다. 세균 유래 미생물 로돕신들은 해당 아미노산 부위에, 수소이온펌프 로돕신은 주로 DTE 모티프를, 소듐펌프 로돕신(NaR)은 NDQ 모티프, 그리고 염소이온펌프 로돕신(ClR)은 NTQ 모티프를 가진 것으로 보고되었다. 연구 역사가 오래된 수소이온펌프 로돕신은 물론, 최근 일본과 독일 연구진들에 의해 소듐로돕신 구조와 이온수송 메커니즘이 규명되었다. 하지만, 염소로돕신의 구조와 작용 메커니즘은 밝혀진 바 없어, 연구팀과 국외 여러 그룹들이 경쟁적으로 이 구조 연구에 착수하게 되었다.

 2. 연구내용

  ㅇ 염소로돕신 단백질 과발현 및 분리 정제
     연구팀은 논라벤스 마리너스(N. marinus) S1-08의 균주로부터 DNA를 추출한 후, 염소로돕신 유전자만을 증폭시키고 대장균에 형질전환하였다. 대장균에서 과발현시킨 후, 균을 파쇄하고 로돕신 단백질이 과발현된 막부분만 순수하게 얻기 위해 초원심분리 과정을 거쳤다. 막 부분을 DDM 계면활성제를 이용하여 물에 녹인 후 다시 초원심분리 후 상층액을 TALON 친화 크로마토그래피를 통해 순수 분리하였고, 이것을 다시 size exclusion 크로마토그래피를 통해 정제하여 높은 동질성과 높은 순도의 단백질을 확보하였다.
 
  ㅇ 염소로돕신 결정구조 규명
     고농도의 단백질을 Lipidic Cubic Phase (LCP)방법을 이용하여, 결정화 스크리닝을 진행하였다. LCP 방법은 막단백질의 결정화 방법으로써 현재 가장 널리 쓰이는 방법이다. 막과 유사한 cubic phase를 형성시켜, 막단백질을 지질에 둘러싸여 안정한 상태에서 결정화를 유도시켜주도록 개발된 방법이다. 이 방법으로 초기 결정화에 성공하였고, 결정 최적화 과정을 거쳐, 약 50마이크로 미터(um) 사이즈의 결정화에 성공하였다. 만들어진 결정을 방사광 가속기 연구소에서 X-선 회절 데이터를 얻었으며, 최종적으로 1.57옹스트롱(Å)의 고해상도의 구조를 규명할 수 있었다.

  ㅇ ClR의 작용 메커니즘 규명
     고해상도로 규명된 염소로돕신 구조 분석을 통해서 단백질 내부에 두 개의 염소 이온이 결합하는 부위를 파악했고 이 정보로부터 이온이 세포 밖에서 세포 안으로 들어오는 이동 통로와 작용 메커니즘을 제시하였다. 이를 증명하기 위해 활성화에 중요한 잔기들을 돌연변이시켜 펌프 기능을 테스트 하였고 그 결과를 분석하여 제시한 작용 메커니즘이 적절함을 증명하였다.

3. 기대효과

  ㅇ 염소로돕신의 광유전학에 활용
     광유전학은 빛을 이용한 신경세포를 자극하여, 뇌의 비정상적인 기능에 의해 수반되는 우울증, 간질 같은 뇌질환의 치료 연구에 사용되고 있다. 신경세포의 신호전달은 막전위차*에 의해 형성된 분극 상태에서, 탈분극과 재분극을 거쳐서 신호가 전달되는데, 이 신경세포에 양이온과 음이온을 펌핑하는 로돕신들을 발현시켜놓고, 각각의 로돕신에 특정 파장대의 빛을 조사시키면, 로돕신들이 이온들을 펌핑하게 되고, 그 결과 세포막의 탈분극 또는 재분극을 유도하여 신호가 인위적으로 전달되게 된다. 연구팀이 규명한 염소로돕신을 신경세포에서 발현시켜 광유전학의 연구에 활용하면 쪼여주는 빛에 따라 신경세포막의 전위차를 조절하여 신호조절이 가능할 것이라 기대한다. 
     ＊막전위차 : 세포막을 경계로 형성된 전위차

  ㅇ 국내 최초의 막단백질 구조 규명 성공
     막단백질의 구조 연구는 단백질의 분리 정제 과정부터 결정화 등 여러 가지 단계에서 어려움이 많아서 미국, 일본, 유럽의

세계적인 연구 그룹에서만 선도적으로 연구되어왔다. 하지만 이번 결과는 국내 연구진만으로 최초로 막단백질의 구조 규명을

성공하였으며, 이는 한국도 신약개발 및 기능 연구에 매우 중요한 막단백질 구조 연구 분야에 더 이상 뒤떨어지지 않고 여러

기술적 노하우가 축적되었으며 막단백질 구조 연구의 불모지가 아니라는 것을 의미한다.

★ 연구 이야기 ★

□ 연구를 시작한 계기나 배경은?

세균의 유전체 분석 및 로돕신 기능 연구를 하는 김지현 교수가 연세대 시스템생물학과에 부임하면서 단백질의 구조 연구를

수행해오던 조현수 교수와 로돕신 관련 공동연구를 시작하게 되었다. 미생물 로돕신은 해양 환경에서 생태학적 의미가 크고,

최근 미생물 로돕신을 이용한 광유전학 기술이 크게 발전하고 있다. 이에 따라 아직 연구가 미흡한 이온펌프 로돕신에 대한 관심이 높아지게 되어 최근 새롭게 발굴된 세균 유래 염소이온펌프인 염소로돕신의 구조 규명 및 작용 메커니즘에 관한 공동연구에 착수하게 되었다.

□ 연구 전개 과정에 대한 소개

연세대 김지현 교수 연구팀 소속의 권순경 박사는 해양 박테리아 균주를 제공하였고, 조현수 교수 연구팀의 김국래 학생은 이 균주로부터 확보한 염소로돕신유전자를 대장균 발현 벡터에 삽입하여 단백질 과발현과 정제 및 결정화하였다. 결정은 일본의 PF 방사광가속기와 포항의 방사광가속기연구소에서 고해상도의 회절 데이터를 얻어 구조 규명에 성공하였다.

또한 고해상도로 규명된 구조 정보를 바탕으로 염소이온 통로를 제안하고, 이를 바탕으로 여러 돌연변이체를 만들었다.

한편 권순경 박사는 이온 펌핑 활성도 측정 실험을 하여 구조적 정보를 뒷받침하였고, 전성훈 박사는 구조 및 작동 메커니즘에 대한 고찰과 논문 작성을 담당하였다.

□ 연구하면서 어려웠던 점이나 장애요소가 있었다면 무엇인지? 어떻게 극복(해결)하였는지?

단백질의 구조 및 기능 규명 연구는 그 단백질의 중요도가 클수록 그 경쟁이 매우 치열하다. 그 경쟁에서 승자가 되려면 다른 그룹보다 먼저 연구 결과를 논문으로 보고 하여야 한다. 로돕신의 경우 미국과 일본 등지에 로돕신만을 주제로 몇 십년동안 연구를 지속해 온 그룹이 다수 존재하기 때문에 국내 로돕신 연구팀은 상대적으로 후발주자인 셈이다. 특히 염소로돕신의 경우 염소로돕신과 마찬가지로 해양환경에 광범위하게 존재하는 박테리아 그룹에서 발견된 새로운 이온펌프 로돕신이라는 점에서 관심이 집중되었고 타 로돕신보다 연구 결과 보고를 위한 경쟁그룹 간 선점 경쟁이 치열할 것으로 예상되었다.
실제로 본 연구실에서 염소로돕신의 경우도 구조 규명을 위해서 약 2년 동안 노력하였지만 일본 그룹에서 먼저 구조 규명을 해서 네이처 저널에 게재하여 크게 실망한 경험도 있었다. 따라서 염소로돕신의 구조 및 기능 연구도 무엇보다 신속한 연구 진행이 요구되어 심적 부담이 컸다. 우려는 현실화되어서 논문 승인 과정에서 실제 일본 그룹도 동일한 단백질의 구조를 규명한 것이 알려지게 되어 매우 위험한 상황에 이르기도 했지만 연구팀은 여러 개의 단백질 구조를 규명하였고 구조 정보에 기반한 견고한 실험적 증거들이 있었기 때문에 본 저널에 출판될 수 있었다.

□ 이번 성과, 무엇이 다른가?

염소로돕신 구조 분석을 통해서 할로로돕신과 그 기능은 유사하지만, 구조적으로는 차이가 있음을 알 수 있었다. 먼저 염소이온이 PSB에 결합된 형태가 할로로돕신은 물분자를 매개로 결합하는데 반하여, 염소로돕신 구조에서는 직접적으로 결합할 것으로 예측되었고, 이 가설은 후속 실험을 통해서 확인되었다. 반면에 단백질 아미노산 서열이 매우 유사하여 구조가 유사할 것으로 예상된 소듐로돕신과는 펌핑하는 이온과 방향이 서로 반대이고 세포 바깥쪽으로 열려있는 구조를 보여서 기능적 구조적 차이를 보였다.

또한 위에서 언급한 염소로돕신, 소듐로돕신 뿐만 아니라 방선균로돕신 그리고 잔토로돕신의 구조에서 공통적인 특징이 있었는데 그것은 세포 밖으로 노출된 부위의 구조가 기존의 로돕신들과는 다른 방향으로 되어있는 것을 구조적으로 확인하였고, 이것들은 서열 분석을 통해서 공통적으로 3오메가 모티프라는 특이적 아미노산 서열을 가지고 있는 것을 확인하였고 이를 통해 이 로돕신들은 진화적으로 유연관계에 있는 것을 확인하였다.
이번 염소로돕신 구조 해독은 국내에서는 최초의 막단백질 구조 규명이며, 이것의 의미는 본 연구진이 막단백질의 구조 규명을 위한 기술적 노하우가 축적되었다는 것을 의미하며, 앞으로도 신약개발에 중요한 표적이 되고 있는 다양한 GPCR을 비롯한 많은 막단백질들의 구조가 규명될 것으로 기대한다.

□ 꼭 이루고 싶은 목표와, 향후 연구계획은?

미생물 로돕신 관련 연구는 해당 단백질이 지닌 생태학적 의미와 광유전학 분야의 높은 활용성 때문에 학문적 영향력이 지대하다.이에 지속적인 로돕신 자원의 발굴과 구조와 기능을 포함한 작용 메커니즘 연구로 미생물 로돕신 연구에 있어 국제적 위상을 높이는 일에 기여하고 싶다. 또한 질병 치료의 표적 단백질들 중 막단백질의 비중이 상당한데, 이 중 GPCR 단백질들은 항암제, 심혈관질환 치료제, 당뇨병 치료제 등의 개발에 잘 검증된 대표적인 표적 단백질로서 세계적인 제약회사들의 주요 관심사이므로 로돕신 단백질의 구조 연구 경험을 발판으로 로돕신 단백질과 구조적 유사도가 높은 GPCR 단백질의 구조 규명에 도전하여 국내 제약회사의 신약개발에 기여하고 싶다.

□ 기타 특별한 에피소드가 있었다면?

포항방사광가속기 연구소의 거대분자를 위한 X-선 회절 빔라인은 세계 최고 수준의 우수한 실험 시설로서 자동으로 단백질 결정을 장착할 수 있는 로봇과, X-선 회절 패턴을 손실 없이 고해상도로 기록할 수 있는 장치인 PILATUS를 구비하여 높은 해상도의 회절데이터를 확보할 수 있어 큰 도움이 되었다.

...................(계속)

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