바이오인

핵심내용

국내 연구진, 새로운 유전자가위의 효과 증명
- 단백질효소(Cpf1) 기술적용 생쥐 유전자 편집 세계 최초 성공 -

◇ 이상욱 교수 연구팀, 국제 저명 학술지 ‘네이처 바이오테크날러지’에 게재
◇ 유전자 치료 신약 개발에 필요한 다양한 유전자 편집기술 확보에 기여

□ 국내 연구진이 새로운 유전자가위 기술인 Cpf1*을 이용해 생쥐의 유전자를 녹아웃** 하는데 세계 최초로 성공했다. 
   * Cpf1와 Cas9 : 세균이 바이러스에 감염시 사람의 면역작용처럼 세균의 DNA는 건드리지 않고 바이러스의 DNA를 인식하여 제거하는 일종의 면역시스템을 발전시켰는데, Cas9과 Cpf1는이를 담당하는 단백질 효소임. 이들의 특성을 이용하여 유전자가위를 활용하는 것임.
   * 유전자 녹아웃: 특정 유전자의 기능을 없애는 기술로 유전자의 생체 내 기능 연구와 신약개발연구에 필수적인 질환모델생쥐 개발에 필수적임.

 ○ 한국연구재단(이사장 정민근)은 미래창조과학부의 바이오·의료기술개발사업(국가마우스표현형분석사업/단장 서울대 성제경 교수) 등의 지원을 받은 이상욱 교수 연구팀(울산대학교 의과대학)이 주도한 이번 연구결과가 국제 저명 학술지 ‘네이처 바이오테크날러지(Nature Biotechnology, 저널 임팩트팩터 = 41.514)’ 에 6월 7일 온라인 게재되었다고 밝혔다.
    ※ (논문명) Generation of Knockout Mice by Cpf1-mediated Gene Targeting
    ※ (저자정보) 김용섭 (제1저자); 이상욱, 이명섭, 백인정, 성영훈 (공동 교신저자)

□ 유전자가위(engineered endonuclease)는 유전자 염기서열을 인식하여 절단하는 효소로 유전자 치료제로써 개발되고 있다.
 ○ 유전자가위에 의해 절단된 DNA는 세포 내에서 재빨리 수리되는데, 이때 다양한 기술을 적용하여 DNA의 염기서열을 원하는 대로 편집할 수 있다.
 ○ 따라서 유전자가위는 유전자 조작을 위한 시발점으로서 질병을 유발하는 인간유전자의 돌연변이를 교정하는데 사용될 것으로 예상되어, 그 개발 및 연구에 있어서 전 세계적으로 경쟁이 매우 치열하다.

□ 이 논문에서는 최근 발견된 Cpf1 유전자가위가 생쥐에서의 유전자적중에 활용될 수 있는지를 최초로 증명하였다.
 ○ Cpf1 유전자가위는 근래 유전자가위 분야를 석권하고 있는 Cas9 유전자 가위와는 다른 PAM*을 인식하여 Cas9이 인식 못하는 부위에 사용이 가능하며, 특히 Cas9과 달리 짧은 crRNA** 하나만으로도 작동하여 훨씬 생쥐 제작에 효율적인 장점이 있다.
   * PAM(Protospacer Adjacent Motif) : 모든 유전자가위가 DNA 절단을 시작하기 위해 표적 DNA의 한쪽 말단에 접근해야 하는데, 이 때 활용되는 짧은 유전자 염기서열
   ** crRNA (Crispr RNA) : 표적 DNA 와 결합하여 Cpf1이 DNA의 절단을 일으킬 수 있게 만드는 역할을 함. 
 ○ 향후 Cpf1 기술을 통해 보다 발전된 유전자 녹아웃 생쥐 생산은 물론, 유전자 기능 연구와 효율적인 유전자 치료제 신약 개발에 소요되는 다양한 유전자 편집기술의 확보에 기여할 것으로 기대된다.

□ 이번 연구를 지원한 국가마우스표현형사업단 단장인 성제경 교수(서울대학교)는 기존의 유전자가위에 비하여 전 세계적으로 가장 정확하고 효율이 높은 유전자 편집 기술을 확보하게 되어서 마우스를 포함한 줄기세포의 기초 연구 뿐 아니라, 유전자 교정을 활용한 인체질환 치료에 한걸음 다가서는 계기가 되었다고 연구 의의를 밝혔다.

상세내용

 
연 구 결 과 개 요

Generation of Knockout Mice by Cpf1-mediated Gene Targeting
(Cpf1에 의해 매개되는 유전자 적중에 의한 녹아웃 마우스 생산)

I. 서론
유전자 녹아웃 생쥐의 생산과 연구는 생체 내에서의 유전자 기능이해에 큰 도움을 주어 의·생명분야에 혁명적인 변화를 일으켰다. 최근까지도 대부분의 유전자 녹아웃 생쥐는 생쥐의 배아줄기세포(ES cell)를 이용하여 제작되었으며, 그러한 공로로 이 분야를 확립한 과학자들에게 2007년 노벨생리학상이 수여되었다. 하지만, ES cell을 이용하여 유전자 녹아웃 생쥐를 생산하기 위해서는 2년 가까이 복잡한 과정을 많은 비용을 들여 수행해야만 한다.

이러한 노력을 최소화하기 위해서 유전자가위를 사용하여 유전자 녹아웃 생쥐를 생산하려는 다양한 연구들이 이어져 왔으며, Tranion Activator-Like Effector (TALE) Nuclease (TALEN)과 Cas9 유전자가위를 생쥐의 수정란에 직접 주입해서 유전자 녹아웃 생쥐를 효율적으로 생산할 수 있게 되었다(1,2). 특히, 단순한 guide RNA (gRNA)에 의해 프로그래밍 할 수 있는 Cas9 유전자가위의 경우, 그 디자인과 생산의 용이함으로 인해서 생쥐에서의 다양한 유전자 적중 실험에 관한 연구들이 널리 수행되고 있다. 하지만, 여러 장점들에도 불구하고 이들 유전자가위들이 갖는 특성들로 인하여 그 사용에 제약이 존재한다.

최근 새로 보고된 Cpf1 유전자가위는 Cas9의 gRNA 보다 단순한 crRNA에 의해 손쉽게 프로그래밍 할 수 있는 등 그 디자인과 생산이 매우 유용하면서도 Cas9과 다른 특성들을 가지고 있어, 향후 Cas9을 보완하거나 새로운 방식으로의 활용이 기대되고 있다(3). 본 연구에서는 Cpf1 유전자가위가 생쥐에서의 유전자적중에 활용될 수 있는지를 최초로 증명하였다.

II. 본론
본 연구팀은 생쥐에서 Cpf1에 의한 유전자적중을 확인하기 위해서 기존의 연구결과를 바탕으로, 세포 내에서의 활성이 높은 Acidaminococcus sp. BV3L6와 Lachnospiraceae bacterium N D2006라는 두 가지 서로 다른 미생물에서 얻어진 Cpf1 (AsCpf1과 LbCpf1)을 사용하였다. 먼저, 생쥐의 암억제 유전자인 transformation related protein 53 (Trp53) 유전자를 모델로 하여 이들 Cpf1 유전자가위의 능력을 조사하였다. Cpf1이 Trp53 유전자의 염기서열을 특이적으로 공격할 수 있도록 디자인된 crRNA와 Cpf1 messenger RNA (mRNA)를 생쥐의 표준품종 중의 하나인 C57BL/6J (B6)에서 얻어진 수정란의 세포질에 미세주입하였다. 이렇게 미세주입된 수정란은 대리모의 자궁에 이식하여 새끼가 태어나게 하였고, 이들의 유전자형(genotype)을 조사한 결과 Cpf1 유전자가위에 의해 공략당한 부위에 70% 이상의 매우 높은 비율로 돌연변이가 유발됨을 알 수 있었다.

Cpf1의 효용성에 대한 추가적인 검증을 위해서 자가면역질환 및 조직이식 연구에 널리 사용되는 NOD/ShiLtJ 생쥐의 수정란에 유전자 녹아웃에 의해 면역부전을 일으키는 protein kinase, DNA activated, catalytic polypeptide (Prkdc) 유전자에 대한 Cpf1 유전자가위를 미세주입하였다. 그 결과, Trp53 유전자와 마찬가지로 70% 이상에 달하는 높은 돌연변이 효율을 관찰하였다. 이러한 결과는 Cpf1 유전자가위가 생쥐의 수정란 내에서 높은 활성으로 돌연변이를 유발할 수 있음을 증명한다.

Cpf1 유전자가위가 높은 활성을 보이므로, 타겟 염기서열 이외에 다른 부위를 공격하여 돌연변이를 일으키는 독성 효과(off-target effect)가 있는지를 조사하였다. 실험결과, 대부분의 경우 이러한 독성이 발견되지 않았으나, 유사성이 매우 높은 염기서열의 경우 일부에 한해서 off-target effect를 나타내는 것으로 확인되어, 타겟 염기서열의 선택에 있어서 주의를 기울여야 할 필요성이 있음을 알게 되었다.

III. 결론
본 연구결과는 Cpf1 유전자가위가 생쥐에서의 유전자 녹아웃에 유용한 도구로 사용될 수 있음을 증명하였다. 특히, 대부분 수입에 의존하던 다양한 질환모델 생쥐를 자체 생산하여 대체하고, 연구 및 개발이 긴급히 요구되는 유전자 녹아웃 생쥐의 국내 생산에 크게 기여할 것이다.

또한, 향후 다양한 유전자 녹인 생쥐의 제작에 선행되어야 될 Cpf1 유전자가위의 활성과 효율에 대한 기본적인 정보를 제공하게 될 것이다. 즉, 생체 내에서의 Cpf1 유전자가위 활성 및 독성에 대한 정보를 최초로 보여주는 만큼, 향후 다른 동물모델에서의 연구와 더불어 인체에서의 유전자치료에서의 활용에 기본적인 지표로써도 활용될 수 있으리라 여겨진다.

[참고문헌]
1. Sung YH, Baek IJ, Kim DH, Jeon J, Lee J, Lee K, Jeong D, Kim JS, Lee HW. Knockout mice created by TALEN-mediated gene targeting. Nat Biotechnol. 2013 Jan;31(1):23-4.
2. Sung YH, Kim JM, Kim HT, Lee J, Jeon J, Jin Y, Choi JH, Ban YH, Ha SJ, Kim CH, Lee HW, Kim JS. Highly efficient gene knockout in mice and zebrafish with RNA-guided endonucleases. Genome Res. 2014 Jan;24(1):125-31.
3. Zetsche B, Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Slaymaker IM, Makarova KS, Essletzbichler P, Volz SE, Joung J, van der Oost J, Regev A, Koonin EV, Zhang F. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 2015 Oct 22;163(3):759-71.

☞ 자세한 내용은 내용바로가기 또는 첨부파일을 이용하시기 바랍니다.